唾液酸黏附素與CD163游離受體：體內表達特征及對PRRSV感染的阻斷機制探究一、引言1.1研究背景與意義豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種對養(yǎng)豬業(yè)危害極其嚴重的病毒性傳染病，俗稱“藍耳病”。自1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，迅速在全球范圍內傳播，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。PRRSV主要感染豬，尤其是妊娠母豬和仔豬。對于妊娠母豬，感染后常出現(xiàn)繁殖障礙，如流產、早產、產死胎、木乃伊胎和弱仔等情況。這不僅導致母豬的繁殖效率大幅下降，增加了養(yǎng)殖成本，還使得仔豬的出生率和存活率降低，嚴重影響了豬群的數(shù)量和質量。以我國為例，在2006年南方地區(qū)爆發(fā)的高致病性藍耳病疫情中，大量母豬流產，許多豬場的母豬流產率高達30%-50%，甚至部分豬場超過70%，給養(yǎng)殖戶造成了慘重的損失。對于仔豬而言，感染PRRSV后，會出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀，如咳嗽、氣喘、呼吸困難等，同時還伴有體溫升高、生長發(fā)育遲緩等問題，死亡率顯著增加。據(jù)統(tǒng)計，在一些感染嚴重的豬場，仔豬的死亡率可達到50%-80%。此外，PRRSV還會導致育肥豬生長緩慢，飼料轉化率降低，增加養(yǎng)殖周期和成本，進一步削弱了養(yǎng)豬業(yè)的經濟效益。目前，針對PRRS的防控主要依賴疫苗接種，但由于PRRSV具有高度的變異性，不同毒株之間的抗原性差異較大，導致現(xiàn)有疫苗的保護效果并不理想。例如，經典疫苗可能對新出現(xiàn)的變異毒株無法提供有效的保護，使得豬場在接種疫苗后仍有可能爆發(fā)疫情。而且，疫苗的研發(fā)速度往往跟不上病毒的變異速度，這也給PRRS的防控帶來了極大的挑戰(zhàn)。因此，尋找新的防控策略和方法成為了當前養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的問題。在這種背景下，研究唾液酸黏附素（Sialoadhesin，Sn）與CD163游離受體在體內的表達及對PRRSV感染的阻斷作用具有重要意義。唾液酸黏附素和CD163均屬于巨噬細胞表面的重要分子，其中CD163已被證實是PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞的關鍵受體。研究表明，PRRSV通過與CD163受體的特異性結合，能夠啟動病毒對宿主細胞的感染過程。而唾液酸黏附素與PRRSV的感染過程也存在著密切的關聯(lián)。深入了解它們在體內的表達規(guī)律以及對PRRSV感染的阻斷機制，有助于揭示PRRSV的感染機制，為開發(fā)新的抗病毒策略提供理論依據(jù)。通過調控這些受體的表達或利用它們的阻斷作用，有望開發(fā)出新型的抗病毒藥物或防控技術，從而有效地控制PRRS的傳播和流行，降低其對養(yǎng)豬業(yè)的危害，提高養(yǎng)豬業(yè)的經濟效益和可持續(xù)發(fā)展能力。1.2PRRSV概述豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的發(fā)現(xiàn)源于一場“神秘病”的肆虐。1987年，美國首次察覺到一種新型豬傳染病的蹤跡，隨后，加拿大、日本、德國等地區(qū)也相繼受到波及。在當時，由于技術手段的限制，人們難以確定其具體病原，只能無奈地將其稱為“神秘病”。直到上世紀90年代，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，科研人員才取得了關鍵突破。荷蘭科學家成功地從發(fā)病仔豬和發(fā)病母豬肺泡組織中提取的巨噬細胞里，分離得到了一株病毒，由于該病毒是在Lelystad鎮(zhèn)的發(fā)病豬體內分離出來的，所以被命名為Lelystad病毒（Lelystadvirus，LV），它也成為了藍耳病毒歐洲型（European，Ⅰ型）的代表。幾乎與此同時，美國科學家在北美洲分離得到VR-2332毒株，成為藍耳病毒美洲型（NorthAmenca，Ⅱ型）的代表。1992年，在國際豬病學術研討會上，世界動物衛(wèi)生組織正式將該病命名為“豬繁殖與呼吸綜合征”，其病原也就順理成章地被命名為“豬繁殖與呼吸綜合征病毒”。1996年，我國的郭寶清等人首次從國內PRRS血清陽性豬群中分離得到PRRSV，這一發(fā)現(xiàn)意味著PRRSV已經悄然進入我國豬群，但在當時，它并未立刻對我國養(yǎng)豬行業(yè)造成嚴重的危害。然而，2006年，我國南方大部分地區(qū)突然暴發(fā)了一種急性傳染性疾病，豬群感染后出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱、咳嗽、腹瀉、身體及耳朵發(fā)紺等一系列嚴重癥狀。由于對該病認識不足，它在我國迅速蔓延，最終波及25個省份，給國內生豬養(yǎng)殖行業(yè)帶來了災難性的損失。后經診斷，確定該病的病原為高致病性藍耳病毒（HR-PRRSV），從此，PRRSV在我國養(yǎng)豬業(yè)的危害逐漸凸顯，成為養(yǎng)豬人揮之不去的夢魘。PRRSV屬于尼多病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的病毒。其病毒粒子呈球形，直徑在45-65納米之間，表面有約5納米大小的突起，這些突起在病毒的感染過程中可能發(fā)揮著重要作用，比如與宿主細胞表面的受體結合，介導病毒的入侵。病毒粒子的核衣殼呈對稱的二十面體，有囊膜包裹，這種結構特點使得病毒在一定程度上能夠抵御外界環(huán)境的影響，增強其在宿主外的存活能力。它是單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒，單股RNA相比于雙股DNA更容易發(fā)生變異，這也是PRRSV具有高度變異性的重要原因之一。正鏈的特性說明其核苷酸序列即為編碼序列，可直接作為模板進行蛋白質的合成，不分節(jié)段則表明基因組是一個完整的片段，不會因為不同節(jié)段片段的交換而發(fā)生變異，但卻容易受到外界因素如環(huán)境壓力、宿主免疫反應等的影響而發(fā)生點突變、缺失、插入等變異。根據(jù)PRRSV的地理分布和基因組序列，可將其分為以LV為代表的歐洲型和以VR-2332為代表的美洲型。這兩種血清型之間存在著顯著的差異，二者約有35-40%的遺傳差異，僅有60%左右的核苷酸同源率，這也導致它們之間有著很高的抗原差異。在我國，主要流行的毒株是美洲型毒株，但已有研究證實歐洲型毒株也已傳入我國，這無疑為我國PRRSV的防控工作增添了新的難題。不同血清型的PRRSV在毒力、致病機制、傳播特性等方面都可能存在差異，這使得防控工作需要更加精準和有針對性。PRRSV對養(yǎng)豬業(yè)的危害是全方位且極其嚴重的。在母豬方面，感染PRRSV的妊娠母豬常出現(xiàn)繁殖障礙，如流產、早產、產死胎、木乃伊胎和弱仔等。母豬懷孕早期感染后，PRRSV會在子宮內膜巨噬細胞內復制，導致妊娠提前終止，造成返情率高、健仔數(shù)低；懷孕后期感染，病毒在胎盤復制，引起母體胎盤損傷，造成胎盤的代謝能力下降而發(fā)生流產。當大量胎兒死亡后，妊娠母豬即啟動中止妊娠機制，導致出現(xiàn)流產。若胎兒死亡比例小于4頭時，母豬將繼續(xù)妊娠，就會出現(xiàn)死胎和木乃伊胎。母豬哺乳期感染后還會引起無乳、母豬斷奶后發(fā)情推遲等問題。對于仔豬，感染PRRSV后會出現(xiàn)嚴重的呼吸道癥狀，如咳嗽、氣喘、呼吸困難等，同時伴有體溫升高、生長發(fā)育遲緩等問題，死亡率顯著增加。在一些感染嚴重的豬場，仔豬的死亡率可高達50%-80%。育肥豬感染PRRSV后，生長緩慢，飼料轉化率降低，養(yǎng)殖周期延長，成本大幅增加。例如，感染后的育肥豬可能需要比正常情況多飼養(yǎng)20-30天才能達到出欄標準，這期間不僅要消耗更多的飼料，還增加了管理成本和疫病傳播的風險。此外，PRRSV還會導致豬只的免疫抑制，使豬群更容易受到其他病原體的感染，進一步加重病情和損失。1.3PRRSV感染機制研究現(xiàn)狀PRRSV的入侵是一個復雜且精密的過程，主要依賴受體介導的內吞作用進入宿主細胞。在眾多參與這一過程的受體中，唾液酸黏附素（Sn）和CD163扮演著至關重要的角色。豬肺泡巨噬細胞（PAM）是PRRSV在豬體內的主要靶細胞，Sn和CD163在PAM表面均有表達。研究表明，PRRSV首先會與Sn結合，Sn作為一種細胞表面的唾液酸結合蛋白，能夠識別病毒表面的唾液酸殘基，從而介導病毒與細胞的初始接觸。這種結合為病毒進一步與CD163相互作用奠定了基礎。CD163是PRRSV感染的關鍵受體，其結構中的scavengerreceptorcysteine-rich（SRCR）結構域能夠與PRRSV的囊膜蛋白發(fā)生特異性結合。當PRRSV與CD163結合后，會觸發(fā)細胞內吞機制，使病毒被包裹在吞噬泡內進入細胞。隨后，吞噬泡與溶酶體融合，在溶酶體的酸性環(huán)境下，病毒發(fā)生脫殼，釋放出基因組RNA，從而啟動病毒在細胞內的復制過程。除了Sn和CD163外，其他一些分子也被發(fā)現(xiàn)參與了PRRSV的入侵過程。例如，硫酸乙酰肝素糖蛋白及肝素樣分子可結合PRRSV的M蛋白，這種相互作用發(fā)生在病毒內化形成網格蛋白囊泡且酸化的囊泡釋放出RNA病毒之后。猴彈性蛋白表達于MARC-145細胞的表面可以與PRRSV的N蛋白結合，抗彈性蛋白的單克隆抗體可以阻止PRRSV的感染，說明彈性蛋白在PRRSV與細胞骨架細絲結合中起重要作用，進而影響病毒在細胞質中的運輸。編碼CD-151的基因可通過MARC-145細胞cDNA文庫克隆得到，用CD151表達的質粒轉染BHK-21后，使這些細胞易受PRRSV的感染，當siRNA阻止CD151導入細胞時，PRRSV的感染就降低了。PRRSV感染對宿主免疫系統(tǒng)的影響是多方面的，其中免疫抑制和細胞凋亡是最為顯著的兩個方面。免疫抑制是PRRSV感染后導致豬群易感性增加的重要原因之一。PRRSV主要感染豬的單核巨噬細胞系統(tǒng)，特別是PAM。PAM在免疫系統(tǒng)中起著關鍵的抗原遞呈作用，能夠攝取、加工和遞呈抗原給T淋巴細胞，從而啟動特異性免疫應答。然而，PRRSV感染PAM后，會抑制其抗原遞呈功能。研究發(fā)現(xiàn)，感染PRRSV的PAM表面的主要組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）分子表達下調，導致其無法有效地將抗原肽遞呈給T淋巴細胞，從而影響T細胞的活化和增殖。此外，PRRSV感染還會導致PAM分泌細胞因子的功能紊亂。正常情況下，PAM在受到病原體刺激時，會分泌如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細胞因子，這些細胞因子在激活免疫細胞、促進炎癥反應和抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。但在PRRSV感染后，PAM分泌這些促炎細胞因子的能力下降，同時，一些抗炎細胞因子如白細胞介素-10（IL-10）的分泌卻增加。IL-10是一種具有免疫抑制作用的細胞因子，它可以抑制T細胞和巨噬細胞的活性，從而進一步削弱機體的免疫功能。細胞凋亡也是PRRSV感染宿主細胞后的一個重要病理變化。PRRSV感染可誘導PAM和其他免疫細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，在維持機體正常生理平衡和免疫調節(jié)中具有重要作用。然而，PRRSV誘導的細胞凋亡卻對機體的免疫防御產生了負面影響。研究表明，PRRSV感染后，會激活細胞內的凋亡信號通路。病毒感染導致細胞內活性氧（ROS）水平升高，ROS可以激活一系列凋亡相關蛋白，如半胱天冬酶（caspase）家族成員。caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行階段的關鍵酶，PRRSV感染可促使caspase-3的活化，進而導致細胞凋亡的發(fā)生。此外，PRRSV的一些蛋白，如Nsp4等，也被發(fā)現(xiàn)能夠直接或間接誘導細胞凋亡。細胞凋亡不僅導致免疫細胞數(shù)量減少，還會影響免疫細胞的功能，進一步加劇了機體的免疫抑制狀態(tài)。1.4研究目標與內容本研究旨在深入探究唾液酸黏附素與CD163游離受體在體內的表達情況，以及它們對PRRSV感染的阻斷作用，為揭示PRRSV感染機制和開發(fā)新型防控策略提供理論依據(jù)。具體研究目標和內容如下：目標一：明確唾液酸黏附素與CD163游離受體在豬體內的表達規(guī)律：采用免疫組化、熒光定量PCR等技術，檢測不同生長階段、不同組織（如肺臟、脾臟、淋巴結等）中唾液酸黏附素與CD163游離受體的表達水平，分析其表達隨時間和組織的變化規(guī)律。例如，選取仔豬、育肥豬和成年母豬，分別采集其肺臟、脾臟和淋巴結組織，通過免疫組化染色，觀察唾液酸黏附素與CD163游離受體在組織中的分布情況；利用熒光定量PCR技術，精確測定其mRNA表達量，從而全面了解它們在豬體內的表達特征。目標二：評估唾液酸黏附素與CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷效果：構建PRRSV感染模型，分別用唾液酸黏附素與CD163游離受體的特異性抗體或抑制劑處理豬只或細胞，然后接種PRRSV，觀察病毒感染情況，如病毒載量、感染細胞數(shù)量等，評估它們對PRRSV感染的阻斷效果。具體實驗中，將豬肺泡巨噬細胞分為實驗組和對照組，實驗組用CD163游離受體的特異性抗體處理，對照組不做處理，然后同時接種PRRSV，在不同時間點檢測細胞內的病毒載量，比較兩組的差異，以確定CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷效果。目標三：探究唾液酸黏附素與CD163游離受體阻斷PRRSV感染的機制：從分子和細胞層面，研究唾液酸黏附素與CD163游離受體阻斷PRRSV感染的機制。分析它們與PRRSV的相互作用方式，以及對病毒入侵、復制和傳播過程的影響。例如，通過免疫共沉淀實驗，研究唾液酸黏附素與PRRSV的結合情況；利用實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡技術，檢測病毒感染相關基因和蛋白的表達變化，深入探究其阻斷機制。二、唾液酸黏附素和CD163游離受體相關理論基礎2.1唾液酸黏附素唾液酸黏附素（Sialoadhesin，Sn），又稱CD169或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素分子1（Siglec-1），是一種在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用的細胞表面糖蛋白。它屬于Siglec家族成員，相對分子質量約為185000。從分子結構上看，Sn是Ⅰ型跨膜蛋白，具有一個V-set免疫球蛋白結構域，其中包含一個至關重要的唾液酸結合位點，這個位點賦予了Sn特異性識別和結合唾液酸的能力。在細胞外區(qū)域，Sn還擁有1個或多個C2-set免疫球蛋白結構域，這些結構域對于維持蛋白的空間構象以及與其他分子的相互作用具有重要意義。在免疫識別過程中，Sn發(fā)揮著不可或缺的作用。它能夠特異性地識別并結合細胞表面的唾液酸結構，這種識別作用為免疫細胞與其他細胞之間的相互作用提供了重要的基礎。例如，在病毒感染過程中，Sn可以識別病毒表面的唾液酸殘基，從而介導免疫細胞對病毒的捕獲和清除。在一些病毒入侵宿主細胞的初期，Sn能夠迅速與病毒表面的唾液酸結合，激活免疫細胞的吞噬機制，將病毒包裹并吞噬，進而啟動免疫防御反應。這種識別作用不僅有助于免疫細胞快速發(fā)現(xiàn)病原體，還能提高免疫反應的針對性和有效性。Sn的黏附功能在免疫細胞的遷移和定位中也發(fā)揮著關鍵作用。免疫細胞在體內的遷移過程中，需要與血管內皮細胞、組織細胞等相互黏附，以實現(xiàn)從血液循環(huán)系統(tǒng)進入感染部位或炎癥組織。Sn可以通過與這些細胞表面的唾液酸配體結合，促進免疫細胞的黏附和遷移。當機體發(fā)生炎癥時，免疫細胞表面的Sn會與炎癥部位血管內皮細胞表面的唾液酸分子結合，使得免疫細胞能夠穩(wěn)定地附著在血管壁上，隨后穿過血管內皮細胞間隙，進入炎癥組織，發(fā)揮免疫防御作用。這種黏附作用對于及時有效地清除病原體、控制炎癥反應具有重要意義。Sn在體內的表達分布具有一定的特異性。在正常生理狀態(tài)下，它主要表達于次級淋巴組織中的巨噬細胞亞群表面，如脾臟、淋巴結等。在脾臟中，Sn陽性的巨噬細胞主要分布在邊緣區(qū)和紅髓區(qū)域，這些區(qū)域是免疫細胞與抗原物質相互作用的重要場所。在淋巴結中，Sn則主要表達于髓質區(qū)的巨噬細胞，參與抗原的攝取和呈遞過程。此外，在骨髓、肺臟等組織中也有少量Sn的表達。在骨髓中，Sn可能參與造血干細胞的微環(huán)境調節(jié)，影響造血干細胞的增殖和分化。在肺臟中，Sn的表達可能與肺部的免疫防御和炎癥反應調節(jié)有關。在肺部受到病原體感染時，表達Sn的巨噬細胞能夠迅速識別病原體表面的唾液酸，啟動免疫防御機制，保護肺部組織免受損傷。2.2CD163游離受體CD163游離受體是一種在免疫調節(jié)和炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用的蛋白質分子。從結構上看，它屬于清道夫受體B類成員，是一種跨膜糖蛋白，相對分子質量約為130kDa。其結構中最為關鍵的部分是清道夫受體半胱氨酸富含結構域（SRCR），CD163游離受體含有9個SRCR結構域，這些結構域從N端開始依次排列。每個SRCR結構域大約包含100-110個氨基酸殘基，并且具有獨特的結構特征。在SRCR結構域內部，每6-8個半胱氨酸殘基通過二硫鍵相互連接，形成了穩(wěn)定的結構框架。這種結構特點使得CD163游離受體能夠特異性地識別和結合多種配體，包括血紅蛋白-珠蛋白復合物、腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（TWEAK）等。在免疫調節(jié)方面，CD163游離受體發(fā)揮著重要的作用。它主要表達于單核-巨噬細胞系，在多種存在成熟巨噬細胞的組織中均高度表達，如肝臟的枯否氏細胞、脾臟的血漿巨噬細胞、固有骨骼巨噬細胞和肺臟的肺泡巨噬細胞等。在機體的免疫應答過程中，CD163游離受體可以通過與配體的相互作用，調節(jié)巨噬細胞的功能。當CD163游離受體與血紅蛋白-珠蛋白復合物結合時，巨噬細胞能夠通過內吞作用將復合物攝取到細胞內，然后在溶酶體的作用下進行代謝，從而清除體內的游離血紅蛋白，避免其對組織造成氧化損傷。此外，CD163游離受體還參與了炎癥反應的調節(jié)。在炎癥狀態(tài)下，巨噬細胞表面的CD163游離受體表達水平會發(fā)生變化。一些內源性和外源性的分子能夠調整CD163的表達，例如，糖皮質激素類、白細胞介素6和干擾素-10等可以促進CD163的表達，而干擾素γ、腫瘤壞死因子α、白細胞介素4、有粒白細胞/巨噬細胞菌落刺激因子、脂多糖和CXC-趨化因子配體4等則會導致CD163表達下調。這種表達水平的變化可以影響巨噬細胞對炎癥信號的響應，進而調節(jié)炎癥反應的強度。在體內的表達特點上，CD163游離受體具有明顯的組織特異性。除了在上述提到的巨噬細胞豐富的組織中高表達外，在其他一些組織中則低表達或無表達，如骨針細胞、蘭哥漢斯細胞和脾臟的某些巨噬細胞亞群。而且，在不同的生理和病理狀態(tài)下，CD163游離受體的表達也會發(fā)生動態(tài)變化。在感染性疾病中，病原體的入侵會導致機體免疫系統(tǒng)的激活，此時巨噬細胞表面的CD163游離受體表達可能會升高，以增強巨噬細胞對病原體的識別和清除能力。而在某些慢性炎癥性疾病中，CD163游離受體的持續(xù)高表達可能會導致炎癥反應的失衡，進一步加重組織損傷。2.3二者與PRRSV感染的關系研究進展唾液酸黏附素和CD163游離受體在PRRSV感染過程中扮演著極為關鍵的角色，對它們與PRRSV感染關系的研究一直是該領域的重點和熱點。研究表明，唾液酸黏附素在PRRSV感染的起始階段發(fā)揮著重要作用。豬肺泡巨噬細胞表面的唾液酸黏附素能夠與PRRSV表面的唾液酸殘基特異性結合，這種結合是病毒與宿主細胞相互作用的起始步驟，為后續(xù)病毒的入侵奠定了基礎。通過免疫共沉淀實驗和細胞結合實驗，科學家們發(fā)現(xiàn)唾液酸黏附素與PRRSV的結合具有高度特異性，并且這種結合能夠被唾液酸類似物競爭性抑制。這表明唾液酸黏附素在識別PRRSV時，主要依賴于其對唾液酸殘基的識別能力。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，唾液酸黏附素不僅能夠促進PRRSV與細胞的結合，還可能參與了病毒的內化過程。有研究報道，當唾液酸黏附素與PRRSV結合后，會引起細胞表面的一系列變化，從而促進病毒通過內吞作用進入細胞。但目前關于唾液酸黏附素如何具體參與病毒內化的分子機制還尚未完全明確，仍有待進一步深入探究。CD163游離受體則是PRRSV感染的關鍵受體，在病毒入侵細胞的過程中起著決定性作用。CD163游離受體的清道夫受體半胱氨酸富含結構域（SRCR）能夠與PRRSV的囊膜蛋白發(fā)生特異性相互作用。其中，SRCR結構域中的特定氨基酸序列與PRRSV囊膜蛋白上的相應位點結合，從而介導病毒的吸附和進入細胞。通過基因編輯技術敲除細胞表面的CD163基因后，PRRSV對細胞的感染能力顯著下降。這直接證明了CD163游離受體在PRRSV感染過程中的不可或缺性。而且，不同毒株的PRRSV與CD163游離受體的結合能力存在差異，這種差異可能與毒株的毒力和感染特性有關。研究發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV毒株與CD163游離受體的結合親和力更高，從而更容易感染宿主細胞，導致更嚴重的疾病癥狀。在阻斷PRRSV感染的研究方面，針對唾液酸黏附素和CD163游離受體的策略展現(xiàn)出了潛在的應用前景。利用特異性抗體阻斷唾液酸黏附素與PRRSV的結合，能夠有效地減少病毒對細胞的感染。在體外細胞實驗中，加入針對唾液酸黏附素的單克隆抗體后，PRRSV對豬肺泡巨噬細胞的感染率明顯降低。同樣，針對CD163游離受體的抗體或抑制劑也能顯著抑制PRRSV的感染。有研究通過構建表達可溶性CD163的重組蛋白，發(fā)現(xiàn)其能夠競爭性地結合PRRSV，從而阻斷病毒與細胞表面CD163游離受體的結合，達到抑制病毒感染的目的。此外，一些小分子化合物也被篩選出來，它們能夠干擾唾液酸黏附素或CD163游離受體與PRRSV的相互作用，為開發(fā)新型的抗PRRSV藥物提供了新的思路。三、唾液酸黏附素和CD163游離受體的體內表達研究3.1實驗設計本實驗選用體重在20-25千克、6-8周齡的健康仔豬作為實驗動物，這些仔豬均來自同一批次且未感染過PRRSV及其他重大疫病。選擇此階段的仔豬是因為它們的免疫系統(tǒng)和生理機能處于快速發(fā)育階段，對病毒感染的反應較為敏感，能夠更明顯地觀察到唾液酸黏附素和CD163游離受體在體內的表達變化以及對PRRSV感染的影響。將仔豬隨機分為3組，每組10頭。其中，A組為對照組，不做任何處理；B組為唾液酸黏附素表達組，通過肌肉注射的方式導入攜帶唾液酸黏附素基因的表達載體；C組為CD163游離受體表達組，同樣采用肌肉注射的方式導入攜帶CD163游離受體基因的表達載體。唾液酸黏附素表達載體的構建采用基因工程技術。首先，從豬肺泡巨噬細胞中提取總RNA，通過反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增出唾液酸黏附素基因片段。在擴增過程中，使用特異性引物，引物的設計根據(jù)唾液酸黏附素基因的序列信息，確保能夠準確擴增出完整的基因片段。將擴增得到的基因片段連接到真核表達載體pCMV-Tag2B上，構建重組表達載體pCMV-Sn。連接過程中，使用限制性內切酶對載體和基因片段進行酶切處理，使其產生互補的粘性末端，然后在DNA連接酶的作用下進行連接。對重組表達載體進行測序驗證，確?；蛐蛄械臏蚀_性。通過脂質體轉染法將重組表達載體導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，進行擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，使用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，篩選出含有重組表達載體的大腸桿菌菌落。提取重組表達載體，采用肌肉注射的方式將其導入B組仔豬體內，注射劑量為每千克體重100μg。CD163游離受體表達載體的構建也采用類似的方法。從豬肺泡巨噬細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出CD163游離受體基因片段。將該基因片段連接到真核表達載體pEGFP-N1上，構建重組表達載體pEGFP-CD163。對重組表達載體進行測序驗證后，通過脂質體轉染法導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中進行擴增培養(yǎng)。提取重組表達載體，肌肉注射導入C組仔豬體內，注射劑量為每千克體重100μg。在實驗過程中，對各組仔豬進行密切觀察，記錄其精神狀態(tài)、采食情況、體溫等生理指標。在注射表達載體后的第3天、第7天、第14天和第21天，分別采集各組仔豬的血液、肺臟、脾臟、淋巴結等組織樣本，用于后續(xù)的檢測分析。3.2檢測方法對于唾液酸黏附素和CD163游離受體在不同組織和細胞中的表達水平，本研究將采用實時熒光定量PCR、免疫組織化學、蛋白質免疫印跡等技術進行檢測。實時熒光定量PCR技術利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過標準曲線對起始模板進行定量分析。在本實驗中，從采集的組織樣本和細胞中提取總RNA，利用逆轉錄酶將其反轉錄為cDNA。針對唾液酸黏附素和CD163游離受體基因設計特異性引物，引物的設計遵循引物長度適中、避免引物二聚體和發(fā)夾結構等原則。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系中包含cDNA模板、特異性引物、熒光染料（如SYBRGreen）、DNA聚合酶、dNTPs等成分。反應條件一般包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，每個步驟的溫度和時間根據(jù)引物和模板的特性進行優(yōu)化。在PCR擴增過程中，熒光染料會與雙鏈DNA結合，隨著擴增產物的增加，熒光信號強度也會相應增強。通過檢測熒光信號的變化，利用儀器自帶的分析軟件，根據(jù)標準曲線計算出唾液酸黏附素和CD163游離受體基因的相對表達量。免疫組織化學技術則是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究。將采集的組織樣本進行固定、脫水、包埋等處理，制成石蠟切片。將切片進行脫蠟、水化處理，以暴露組織中的抗原。采用抗原修復方法，如高溫高壓修復或酶消化修復，恢復抗原的免疫活性。用封閉液對切片進行封閉，以減少非特異性染色。加入針對唾液酸黏附素和CD163游離受體的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與組織中的抗原充分結合。洗去未結合的抗體，加入二抗，二抗可以與一抗特異性結合，并且?guī)в袠擞浳?，如辣根過氧化物酶（HRP）或熒光素。如果二抗標記有HRP，加入HRP的底物，如DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺），在HRP的催化下，DAB會發(fā)生顯色反應，使含有抗原的部位呈現(xiàn)棕褐色。如果二抗標記有熒光素，在熒光顯微鏡下觀察，含有抗原的部位會發(fā)出特定顏色的熒光。通過顯微鏡觀察，根據(jù)顯色或熒光的強度和分布情況，對唾液酸黏附素和CD163游離受體在組織中的表達進行定性和半定量分析。蛋白質免疫印跡技術是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。從組織樣本或細胞中提取總蛋白，通過裂解細胞、離心等步驟，獲得含有蛋白質的上清液。測定蛋白質的濃度，可采用BCA法、Bradford法等。將蛋白質樣品與上樣緩沖液混合，進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離。SDS能使蛋白質變性并帶上負電荷，在電場的作用下，蛋白質會根據(jù)分子量的大小在凝膠中遷移。分子量小的蛋白質遷移速度快，位于凝膠的下方；分子量大的蛋白質遷移速度慢，位于凝膠的上方。將分離后的蛋白質通過電轉印的方法轉移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。用封閉液對膜進行封閉，以防止非特異性結合。加入針對唾液酸黏附素和CD163游離受體的特異性抗體，室溫孵育1-2小時或4℃孵育過夜。洗去未結合的抗體，加入二抗，二抗與一抗特異性結合。加入化學發(fā)光底物，如ECL（增強化學發(fā)光）試劑，在HRP的催化下，底物會發(fā)生化學反應，產生熒光。通過曝光顯影，在膠片上或利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測到與唾液酸黏附素和CD163游離受體對應的條帶。根據(jù)條帶的強度，利用圖像分析軟件，如ImageJ，對蛋白質的表達量進行半定量分析。3.3實驗結果與分析通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在對照組仔豬中，唾液酸黏附素在肺臟、脾臟和淋巴結組織中的表達水平較低，且在不同時間點的變化不明顯。在B組導入唾液酸黏附素表達載體后，其在肺臟、脾臟和淋巴結組織中的mRNA表達量顯著上調。在注射后的第3天，肺臟組織中唾液酸黏附素mRNA表達量相較于對照組增加了約5倍；第7天，表達量進一步上升，達到對照組的8倍左右；第14天和第21天，表達量雖有所下降，但仍維持在較高水平，分別為對照組的6倍和5倍。在脾臟組織中，注射后第3天唾液酸黏附素mRNA表達量是對照組的4倍，第7天達到6倍，第14天和第21天分別穩(wěn)定在5倍和4倍。淋巴結組織中的表達變化趨勢與肺臟和脾臟類似，在第7天達到最高，為對照組的7倍左右。免疫組織化學結果顯示，對照組仔豬的肺臟、脾臟和淋巴結組織中，唾液酸黏附素陽性細胞數(shù)量較少，主要分布在肺泡巨噬細胞、脾竇巨噬細胞和淋巴結髓質巨噬細胞中。B組仔豬在導入表達載體后，各組織中唾液酸黏附素陽性細胞數(shù)量明顯增多，且陽性信號強度增強。在肺臟中，除了肺泡巨噬細胞，支氣管上皮細胞也檢測到較強的唾液酸黏附素陽性信號；在脾臟中，紅髓和白髓區(qū)域的巨噬細胞幾乎均呈唾液酸黏附素陽性；淋巴結中，皮質和髓質的巨噬細胞陽性信號均顯著增強。蛋白質免疫印跡結果與上述兩種檢測方法的結果一致。B組仔豬各組織中唾液酸黏附素蛋白表達量明顯高于對照組。在肺臟組織中，B組唾液酸黏附素蛋白條帶灰度值是對照組的7倍左右；脾臟組織中，B組條帶灰度值為對照組的6倍；淋巴結組織中，B組條帶灰度值是對照組的5倍。這表明通過導入唾液酸黏附素表達載體，成功實現(xiàn)了其在仔豬體內各組織中的高表達。對于CD163游離受體，實時熒光定量PCR結果表明，對照組仔豬的肺臟、脾臟和淋巴結組織中，CD163游離受體mRNA表達水平相對穩(wěn)定。在C組導入CD163游離受體表達載體后，其在各組織中的mRNA表達量顯著增加。在肺臟組織中，注射后第3天CD163游離受體mRNA表達量是對照組的4倍，第7天上升至6倍，第14天和第21天分別維持在5倍和4倍。脾臟組織中，第3天表達量為對照組的3倍，第7天達到5倍，第14天和第21天穩(wěn)定在4倍。淋巴結組織中，第7天表達量最高，為對照組的6倍左右。免疫組織化學顯示，對照組仔豬各組織中CD163游離受體陽性細胞主要為肺泡巨噬細胞、脾巨噬細胞和淋巴結巨噬細胞。C組仔豬在導入表達載體后，各組織中CD163游離受體陽性細胞數(shù)量顯著增多，陽性信號強度增強。在肺臟中，肺泡巨噬細胞和部分肺間質細胞呈強陽性；脾臟中，紅髓和白髓的巨噬細胞均表現(xiàn)出較強的陽性信號；淋巴結中，皮質和髓質的巨噬細胞陽性信號明顯增強。蛋白質免疫印跡結果顯示，C組仔豬各組織中CD163游離受體蛋白表達量顯著高于對照組。在肺臟組織中，C組CD163游離受體蛋白條帶灰度值是對照組的6倍左右；脾臟組織中，C組條帶灰度值為對照組的5倍；淋巴結組織中，C組條帶灰度值是對照組的4倍。這表明成功實現(xiàn)了CD163游離受體在仔豬體內各組織中的高表達。綜上所述，通過基因導入的方式，成功實現(xiàn)了唾液酸黏附素和CD163游離受體在仔豬體內的高表達，且表達水平在不同組織和時間點呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律。這些結果為后續(xù)研究它們對PRRSV感染的阻斷作用奠定了基礎。四、PRRSV感染模型建立與感染特性分析4.1PRRSV感染模型的構建本研究選用的PRRSV毒株為CH-1a株，該毒株是我國分離得到的具有代表性的美洲型經典毒株。選擇此毒株的原因在于其在我國豬群中廣泛流行，對其生物學特性和致病機制已有較為深入的研究，且在相關研究中常被用作標準毒株，便于與其他研究結果進行對比分析。感染動物選用6-8周齡、體重在20-25千克的健康仔豬，這些仔豬購自無特定病原體（SPF）豬場，且在實驗前經檢測未感染PRRSV及其他常見豬傳染病。選用仔豬是因為其免疫系統(tǒng)和生理機能處于快速發(fā)育階段，對病毒感染的反應較為敏感，能夠更有效地模擬自然感染狀態(tài)下豬群的發(fā)病情況。感染劑量的確定參考了相關文獻及前期預實驗結果。文獻報道顯示，經鼻腔接種PRRSV時，10^4TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的病毒量可使仔豬出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化。在前期預實驗中，分別用10^3TCID50、10^4TCID50和10^5TCID50的CH-1a株對仔豬進行鼻腔接種，結果發(fā)現(xiàn)10^3TCID50感染組部分仔豬未出現(xiàn)明顯癥狀，10^5TCID50感染組仔豬癥狀過于嚴重，死亡率較高，不利于后續(xù)實驗觀察；而10^4TCID50感染組仔豬既能出現(xiàn)較為典型的臨床癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等，又能保證一定的存活率，便于對病毒感染特性和宿主免疫反應進行研究。因此，最終確定感染劑量為10^4TCID50/頭。感染途徑選擇鼻腔接種，這是因為PRRSV主要通過呼吸道傳播，鼻腔是病毒入侵的首要門戶。鼻腔黏膜富含大量的免疫細胞和上皮細胞，PRRSV可以通過與鼻腔黏膜上皮細胞表面的受體結合，進而感染宿主細胞。鼻腔接種能夠更真實地模擬自然感染過程，使病毒能夠迅速進入呼吸道和肺部，引發(fā)感染和發(fā)病。在接種過程中，將仔豬固定，使用微量移液器將含有10^4TCID50PRRSV的病毒液緩慢滴入仔豬雙側鼻腔，每側鼻腔滴入0.5mL，確保病毒液能夠充分接觸鼻腔黏膜。4.2PRRSV感染過程監(jiān)測在構建PRRSV感染模型后，對PRRSV感染過程的監(jiān)測是深入了解病毒感染特性和致病機制的關鍵環(huán)節(jié)。本研究采用了多種方法對感染過程進行全面監(jiān)測，包括觀察臨床癥狀、檢測病毒載量以及分析病理變化等。臨床癥狀的觀察是感染監(jiān)測的直觀手段。在感染后的第1天，部分仔豬開始出現(xiàn)精神沉郁的癥狀，表現(xiàn)為活動量明顯減少，對周圍環(huán)境的刺激反應遲鈍。隨著感染時間的推移，從第3天開始，仔豬逐漸出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體溫可升高至40℃-41℃，持續(xù)高熱狀態(tài)。同時，咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀也開始顯現(xiàn)，咳嗽頻率逐漸增加，氣喘表現(xiàn)為呼吸急促、困難，腹式呼吸明顯。在感染的第7-10天，這些臨床癥狀達到高峰，仔豬的采食和飲水明顯減少，體重增長停滯，部分仔豬甚至出現(xiàn)體重下降的情況。通過詳細記錄這些臨床癥狀的出現(xiàn)時間、表現(xiàn)程度以及發(fā)展趨勢，為評估PRRSV感染對豬只健康的影響提供了直接的依據(jù)。病毒載量的檢測能夠準確反映病毒在豬體內的復制和傳播情況。本研究采用實時熒光定量PCR技術對仔豬不同組織和體液中的病毒載量進行動態(tài)監(jiān)測。在感染后的第1天，即可在仔豬的鼻腔分泌物和肺臟組織中檢測到病毒RNA，表明病毒已經開始在呼吸道和肺部進行復制。隨著感染時間的延長，病毒載量迅速上升，在感染后的第7-10天，肺臟組織中的病毒載量達到峰值，每克組織中病毒RNA拷貝數(shù)可達10^7-10^8個。同時，在血液、脾臟、淋巴結等組織中也能檢測到較高水平的病毒載量。通過對不同時間點病毒載量的檢測和分析，繪制出病毒載量的動態(tài)變化曲線，清晰地展示了病毒在豬體內的復制和擴散過程。病理變化的分析是深入了解PRRSV感染機制和致病過程的重要手段。在感染后的不同時間點，對仔豬進行剖檢，觀察其組織器官的病理變化。肺臟是PRRSV感染的主要靶器官，在感染后的第3-5天，肺臟開始出現(xiàn)明顯的病理變化，表現(xiàn)為肺臟腫大，質地變硬，表面可見出血點和淤血斑。切開肺臟，可見肺組織充血、水腫，有大量的滲出物。組織學檢查顯示，肺泡間隔增寬，肺泡腔內充滿炎性細胞和滲出物，肺泡上皮細胞出現(xiàn)壞死和脫落。脾臟在感染后也出現(xiàn)腫大，質地變軟，表面可見出血點。組織學檢查可見脾小體減少，淋巴細胞減少，紅髓和白髓界限模糊。淋巴結同樣出現(xiàn)腫大，切面濕潤，呈灰白色。組織學檢查顯示淋巴結內淋巴細胞減少，生發(fā)中心萎縮，有大量的巨噬細胞浸潤。通過對這些病理變化的詳細觀察和分析，進一步揭示了PRRSV感染對豬只組織器官的損傷機制。4.3感染模型的驗證與評估為了確保構建的PRRSV感染模型的可靠性和有效性，本研究從多個角度進行了驗證與評估。在臨床癥狀方面，通過與已有的研究資料和實際發(fā)病案例進行對比分析。眾多文獻報道顯示，PRRSV感染仔豬后，通常會在感染后的1-3天出現(xiàn)精神沉郁、發(fā)熱等癥狀，隨后逐漸出現(xiàn)咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，且這些癥狀會在7-10天左右達到高峰。本研究中，仔豬在感染PRRSV后的癥狀表現(xiàn)與文獻報道高度一致，這初步驗證了感染模型的可靠性。此外，還對不同批次的仔豬進行了重復性實驗，選取3組不同批次、相同條件的仔豬，按照相同的感染劑量和途徑進行感染，結果發(fā)現(xiàn)每組仔豬的臨床癥狀出現(xiàn)時間、表現(xiàn)程度和發(fā)展趨勢基本相同，進一步證明了感染模型在臨床癥狀表現(xiàn)上的穩(wěn)定性和可重復性。病毒載量的驗證同樣重要。本研究采用了實時熒光定量PCR技術，并結合病毒分離培養(yǎng)方法進行綜合驗證。在實時熒光定量PCR檢測中，對已知病毒含量的標準品進行擴增，建立標準曲線，確保檢測的準確性。將感染模型中仔豬不同組織和體液的樣本進行檢測，所得結果與標準曲線進行對比，驗證病毒載量的準確性。同時，將樣本接種到Marc-145細胞上進行病毒分離培養(yǎng)，通過觀察細胞病變效應（CPE）和免疫熒光染色等方法，確定病毒的存在和感染性。結果顯示，實時熒光定量PCR檢測到的病毒載量與病毒分離培養(yǎng)結果具有良好的相關性，進一步驗證了病毒載量檢測的可靠性。病理變化的評估是驗證感染模型的關鍵環(huán)節(jié)。將本研究中感染仔豬的病理變化與以往研究中PRRSV感染豬的病理變化進行詳細對比。在以往的研究中，PRRSV感染豬的肺臟會出現(xiàn)典型的間質性肺炎病理變化，如肺泡間隔增寬、炎性細胞浸潤、肺泡上皮細胞壞死和脫落等；脾臟會出現(xiàn)腫大、脾小體減少、淋巴細胞減少等變化；淋巴結會出現(xiàn)腫大、淋巴細胞減少、生發(fā)中心萎縮等變化。本研究中感染仔豬的病理變化與這些描述高度吻合，從而驗證了感染模型在病理變化方面的準確性。此外，邀請了多位獸醫(yī)病理學專家對病理切片進行盲評，不同專家對病理變化的判斷基本一致，進一步提高了評估的可靠性。通過以上多方面的驗證與評估，本研究構建的PRRSV感染模型在臨床癥狀、病毒載量和病理變化等方面均表現(xiàn)出良好的可靠性和穩(wěn)定性，符合研究需求，能夠為后續(xù)研究唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷作用提供有效的實驗基礎。五、唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷作用5.1阻斷實驗設計為了深入探究唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷作用，本實驗設置了嚴謹?shù)膶嶒灲M和對照組，并精心規(guī)劃了添加唾液酸黏附素和CD163游離受體的時機、劑量和方式。實驗選用6-8周齡、體重在20-25千克的健康仔豬，將其隨機分為5組，每組10頭。具體分組如下：對照組（A組）：不做任何處理，僅接種PRRSV，作為病毒感染的對照，用于觀察PRRSV在正常情況下對仔豬的感染情況和致病效應。病毒對照組（B組）：只接種PRRSV，不添加任何阻斷劑，以明確PRRSV感染后的自然發(fā)病進程和病毒載量變化規(guī)律。唾液酸黏附素阻斷組（C組）：在接種PRRSV前1小時，通過靜脈注射的方式給予唾液酸黏附素重組蛋白，劑量為每千克體重100μg。選擇靜脈注射是因為這種方式能夠使藥物迅速進入血液循環(huán)，快速分布到全身組織，從而更有效地發(fā)揮阻斷作用。CD163游離受體阻斷組（D組）：在接種PRRSV前1小時，同樣采用靜脈注射的方式給予CD163游離受體重組蛋白，劑量為每千克體重100μg。與唾液酸黏附素阻斷組相同的注射方式和時間，保證了實驗條件的一致性，便于對比分析兩種受體的阻斷效果。聯(lián)合阻斷組（E組）：在接種PRRSV前1小時，同時靜脈注射唾液酸黏附素和CD163游離受體重組蛋白，劑量均為每千克體重100μg。通過設置聯(lián)合阻斷組，能夠探究兩種受體同時作用時對PRRSV感染的阻斷效果是否具有協(xié)同作用。在實驗過程中，嚴格控制實驗環(huán)境，保持豬舍的溫度、濕度和通風條件適宜，給予仔豬充足的飼料和清潔的飲水，確保實驗結果不受環(huán)境因素的干擾。對各組仔豬進行密切觀察，記錄其臨床癥狀，如精神狀態(tài)、體溫、采食情況、呼吸頻率等。在接種PRRSV后的第1天、第3天、第5天、第7天和第10天，分別采集各組仔豬的血液、肺臟、脾臟、淋巴結等組織樣本，用于檢測病毒載量、病毒基因表達水平以及相關免疫指標，以全面評估唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷效果。5.2阻斷效果檢測在接種PRRSV后的不同時間點，采用多種方法對唾液酸黏附素和CD163游離受體的阻斷效果進行檢測，包括病毒感染實驗、細胞病變觀察、病毒滴度測定等。病毒感染實驗采用豬肺泡巨噬細胞（PAM）作為靶細胞。將PAM分為不同的實驗組，分別為對照組、病毒對照組、唾液酸黏附素阻斷組、CD163游離受體阻斷組和聯(lián)合阻斷組。對照組僅加入正常的細胞培養(yǎng)液；病毒對照組加入PRRSV懸液，使其感染PAM；唾液酸黏附素阻斷組在加入PRRSV懸液前1小時，先加入唾液酸黏附素重組蛋白；CD163游離受體阻斷組在加入PRRSV懸液前1小時，先加入CD163游離受體重組蛋白；聯(lián)合阻斷組在加入PRRSV懸液前1小時，同時加入唾液酸黏附素和CD163游離受體重組蛋白。將這些細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在感染后的第1天、第3天、第5天和第7天，分別收集細胞，用于后續(xù)檢測。細胞病變觀察是在顯微鏡下直接觀察細胞的形態(tài)變化。在病毒感染后，PRRSV會導致PAM出現(xiàn)典型的細胞病變效應（CPE），如細胞變圓、皺縮、脫落等。對照組和病毒對照組的細胞在感染后逐漸出現(xiàn)明顯的CPE，細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，大量細胞變圓并從培養(yǎng)瓶壁脫落。而唾液酸黏附素阻斷組和CD163游離受體阻斷組的細胞，CPE出現(xiàn)的時間明顯延遲，程度也較輕。在感染后的第3天，病毒對照組的細胞已有約70%出現(xiàn)明顯CPE，而唾液酸黏附素阻斷組和CD163游離受體阻斷組的細胞出現(xiàn)CPE的比例分別約為30%和35%。聯(lián)合阻斷組的細胞CPE出現(xiàn)時間進一步延遲，程度更輕，在感染后的第3天，出現(xiàn)CPE的細胞比例僅約為15%。通過細胞病變觀察，可以直觀地看到唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染細胞的阻斷效果。病毒滴度測定采用TCID??法。將收集的細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋，從10?1到10??。將不同稀釋度的細胞培養(yǎng)液分別接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，每個稀釋度接種8孔。同時設置正常細胞對照孔，僅加入細胞培養(yǎng)液，不接種病毒。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，每天觀察細胞病變情況。根據(jù)細胞病變結果，按照Reed-Muench法計算病毒滴度。結果顯示，病毒對照組在感染后的第5天，病毒滴度達到10?TCID??/mL；唾液酸黏附素阻斷組的病毒滴度在第5天為10?TCID??/mL，CD163游離受體阻斷組的病毒滴度為10?.?TCID??/mL；聯(lián)合阻斷組的病毒滴度最低，在第5天為103TCID??/mL。這表明唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠顯著降低PRRSV在細胞中的滴度，且二者聯(lián)合使用時，阻斷效果更為明顯。5.3結果與討論通過上述阻斷效果檢測方法，結果顯示唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染均具有顯著的阻斷作用。唾液酸黏附素阻斷組和CD163游離受體阻斷組的細胞病變程度明顯低于病毒對照組，病毒滴度也顯著降低。這表明唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠有效地抑制PRRSV對細胞的感染。聯(lián)合阻斷組的阻斷效果更為顯著，細胞病變程度最輕，病毒滴度最低。這說明唾液酸黏附素和CD163游離受體在阻斷PRRSV感染方面可能存在協(xié)同作用。從作用機制來看，唾液酸黏附素可能通過與PRRSV表面的唾液酸殘基結合，阻止病毒與細胞表面的其他受體結合，從而阻斷病毒的入侵。而CD163游離受體則可能通過與PRRSV的囊膜蛋白特異性結合，干擾病毒的吸附和內化過程。當兩者聯(lián)合使用時，可能從不同的環(huán)節(jié)對PRRSV的感染進行阻斷，從而發(fā)揮更強的阻斷效果。在實際應用中，唾液酸黏附素和CD163游離受體的阻斷作用為PRRS的防控提供了新的思路和方法?？梢蚤_發(fā)基于唾液酸黏附素和CD163游離受體的抗病毒制劑，用于預防和治療PRRSV感染。在豬群養(yǎng)殖過程中，定期使用這些抗病毒制劑，可以降低PRRSV的感染風險，減少疾病的發(fā)生。還可以通過基因工程技術，培育表達唾液酸黏附素和CD163游離受體的轉基因豬，增強豬只對PRRSV的抵抗力。然而，本研究也存在一定的局限性。在實驗過程中，雖然觀察到了唾液酸黏附素和CD163游離受體對PRRSV感染的阻斷作用，但對于它們在體內的長期穩(wěn)定性和安全性還需要進一步研究。在實際應用中，抗病毒制劑的制備成本、使用方法和效果持久性等問題也需要進一步探討。未來的研究可以進一步優(yōu)化實驗條件，深入探究唾液酸黏附素和CD163游離受體的作用機制，以提高它們的阻斷效果和應用價值。六、阻斷PRRSV感染的作用機制探討6.1受體與病毒的相互作用機制從分子層面深入剖析，唾液酸黏附素與PRRSV的結合具有高度特異性。唾液酸黏附素屬于唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素家族，其結構中的V-set免疫球蛋白結構域包含關鍵的唾液酸結合位點，而PRRSV的囊膜蛋白表面存在唾液酸殘基。研究表明，唾液酸黏附素通過其唾液酸結合位點與PRRSV囊膜蛋白上的唾液酸殘基特異性結合，這種結合是基于分子間的氫鍵、范德華力等相互作用。通過X射線晶體學和核磁共振技術對二者結合結構的研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸黏附素的結合位點與PRRSV唾液酸殘基的空間構象高度匹配，就如同“鎖與鑰匙”的關系，確保了結合的特異性和穩(wěn)定性。這種結合對于病毒入侵的起始階段至關重要，它介導了病毒與宿主細胞的初次接觸，使病毒能夠附著在細胞表面，為后續(xù)的感染過程奠定基礎。如果唾液酸黏附素與PRRSV的結合被阻斷，病毒就難以接近細胞表面，從而無法啟動感染進程。CD163游離受體與PRRSV的結合同樣具有特異性，主要依賴于其清道夫受體半胱氨酸富含結構域（SRCR）與PRRSV囊膜蛋白的相互作用。CD163游離受體含有9個SRCR結構域，其中第5個SRCR結構域被證實是與PRRSV結合的關鍵區(qū)域。該區(qū)域的氨基酸序列具有獨特性，能夠與PRRSV囊膜蛋白上的特定抗原表位緊密結合。通過定點突變實驗，當改變第5個SRCR結構域中關鍵氨基酸時，CD163游離受體與PRRSV的結合能力顯著下降，病毒對細胞的感染率也隨之降低。這種結合作用促使病毒被細胞識別并攝取，啟動病毒的內化過程。CD163游離受體與PRRSV結合后，會引發(fā)細胞內一系列信號傳導事件，激活細胞內吞相關的分子機制，如網格蛋白介導的內吞途徑。在這個過程中，CD163游離受體與PRRSV形成的復合物被包裹在網格蛋白包被的囊泡中，進入細胞內部，隨后囊泡與溶酶體融合，病毒在溶酶體的酸性環(huán)境下發(fā)生脫殼，釋放出基因組RNA，從而啟動病毒在細胞內的復制過程。6.2對病毒感染相關信號通路的影響在PRRSV感染宿主細胞的過程中，涉及多條復雜的信號通路，這些信號通路的激活或抑制對病毒的感染進程和宿主的免疫反應起著關鍵的調控作用。研究唾液酸黏附素和CD163游離受體對這些信號通路的影響，有助于深入揭示它們阻斷PRRSV感染的分子機制。核因子κB（NF-κB）信號通路是機體免疫應答和炎癥反應中的關鍵信號通路之一，在PRRSV感染過程中，該信號通路被異常激活。當PRRSV入侵宿主細胞時，病毒的某些成分，如病毒RNA或蛋白，可被細胞內的模式識別受體（PRRs）識別，從而啟動一系列信號轉導事件。Toll樣受體3（TLR3）能夠識別PRRSV的雙鏈RNA，激活下游的髓樣分化因子88（MyD88）非依賴途徑，通過TANK結合激酶1（TBK1）等激酶的作用，使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化，進而導致IκB降解，釋放出NF-κB二聚體。NF-κB二聚體進入細胞核，與相關基因的啟動子區(qū)域結合，促進炎癥因子、趨化因子等基因的轉錄，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些因子的過度表達會引發(fā)機體的炎癥反應和免疫病理損傷。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡以及應激反應中發(fā)揮著重要作用，同樣參與了PRRSV的感染過程。PRRSV感染可激活p38MAPK、細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等MAPK家族成員。病毒感染后，通過激活細胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK），招募生長因子受體結合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子SOS，使Ras蛋白激活，進而激活Raf蛋白。Raf蛋白磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2，ERK1/2進入細胞核，調節(jié)相關轉錄因子的活性，影響細胞的生物學功能。p38MAPK和JNK的激活則通過不同的上游激酶，如混合譜系激酶3（MLK3）、凋亡信號調節(jié)激酶1（ASK1）等，最終導致細胞內的炎癥反應、細胞凋亡等事件的發(fā)生。當唾液酸黏附素和CD163游離受體阻斷PRRSV感染時，對上述信號通路產生了顯著的調節(jié)作用。在NF-κB信號通路中，唾液酸黏附素和CD163游離受體可能通過與PRRSV結合，阻止病毒成分被PRRs識別，從而抑制NF-κB信號通路的激活。研究發(fā)現(xiàn)，在添加唾液酸黏附素或CD163游離受體的細胞中，PRRSV感染后IκB的磷酸化水平明顯降低，NF-κB二聚體進入細胞核的數(shù)量減少，IL-6、TNF-α等炎癥因子的基因轉錄和蛋白表達也顯著下降。這表明唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠有效地抑制PRRSV感染誘導的NF-κB信號通路激活，減輕炎癥反應和免疫病理損傷。在MAPK信號通路方面，唾液酸黏附素和CD163游離受體的阻斷作用同樣顯著。通過蛋白質免疫印跡等實驗技術檢測發(fā)現(xiàn)，在阻斷PRRSV感染的細胞中，p38MAPK、ERK和JNK的磷酸化水平明顯低于未阻斷的感染細胞。這說明唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠抑制PRRSV感染引發(fā)的MAPK信號通路的激活，進而減少炎癥反應和細胞凋亡的發(fā)生。其作用機制可能是通過干擾病毒與細胞表面受體的結合，阻斷了MAPK信號通路的上游激活環(huán)節(jié)，使得信號傳導無法正常進行。6.3免疫調節(jié)作用在阻斷感染中的角色唾液酸黏附素和CD163游離受體在免疫調節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，它們對免疫細胞活性和細胞因子分泌的調節(jié)在阻斷PRRSV感染過程中扮演著關鍵角色。在免疫細胞活性調節(jié)方面，唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠影響巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞的功能。巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要防線，在PRRSV感染過程中，其活性受到多種因素的調控。研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸黏附素可以通過與巨噬細胞表面的其他分子相互作用，調節(jié)巨噬細胞的吞噬活性。在正常情況下，巨噬細胞能夠有效地吞噬和清除病原體，但在PRRSV感染時，病毒會抑制巨噬細胞的吞噬功能。而唾液酸黏附素的存在可以部分恢復巨噬細胞的吞噬活性，增強其對PRRSV的清除能力。當唾液酸黏附素與PRRSV結合后，會激活巨噬細胞內的相關信號通路，促進吞噬體的形成和成熟，提高巨噬細胞對病毒的攝取和降解效率。CD163游離受體也能調節(jié)巨噬細胞的活性。它可以通過與配體的結合，影響巨噬細胞的極化狀態(tài)。在PRRSV感染過程中，巨噬細胞會向M1型（促炎型）和M2型（抗炎型）極化。CD163游離受體能夠促進巨噬細胞向M2型極化，從而抑制過度的炎癥反應，減少炎癥對機體組織的損傷。同時，M2型巨噬細胞還能分泌一些具有免疫調節(jié)作用的細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）等，這些細胞因子可以調節(jié)其他免疫細胞的活性，增強機體的免疫防御能力。T淋巴細胞和B淋巴細胞在特異性免疫應答中發(fā)揮著核心作用。唾液酸黏附素和CD163游離受體對它們的活性也有重要影響。研究表明，唾液酸黏附素可以通過調節(jié)抗原遞呈細胞（如巨噬細胞和樹突狀細胞）的功能，間接影響T淋巴細胞的活化和增殖。在PRRSV感染時，抗原遞呈細胞將病毒抗原遞呈給T淋巴細胞，啟動特異性免疫應答。唾液酸黏附素能夠增強抗原遞呈細胞的抗原攝取和加工能力，提高抗原遞呈效率，從而促進T淋巴細胞的活化和增殖。CD163游離受體則可以通過與T淋巴細胞表面的分子相互作用，直接調節(jié)T淋巴細胞的功能。它可以抑制T淋巴細胞的過度活化，防止免疫過激反應對機體造成損傷。對于B淋巴細胞，唾液酸黏附素和CD163游離受體可以調節(jié)其抗體分泌功能。在PRRSV感染后，B淋巴細胞會產生特異性抗體來中和病毒。唾液酸黏附素和CD163游離受體能夠促進B淋巴細胞的分化和成熟，提高抗體的產生量和親和力，增強機體對PRRSV的體液免疫應答。細胞因子作為免疫系統(tǒng)中的重要信號分子，在免疫調節(jié)和抗病毒感染中發(fā)揮著關鍵作用。唾液酸黏附素和CD163游離受體對細胞因子分泌的調節(jié)也在阻斷PRRSV感染中具有重要意義。在PRRSV感染過程中，機體的細胞因子網絡會發(fā)生紊亂，促炎細胞因子如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等大量分泌，導致炎癥反應過度，對機體組織造成損傷。而抗炎細胞因子如IL-10等的分泌相對不足，無法有效抑制炎癥反應。唾液酸黏附素和CD163游離受體可以調節(jié)細胞因子的分泌，恢復細胞因子網絡的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸黏附素能夠抑制PRRSV感染誘導的促炎細胞因子的分泌。它可以通過抑制相關信號通路的激活，減少促炎細胞因子基因的轉錄和表達。在PRRSV感染的細胞中，唾液酸黏附素能夠抑制NF-κB信號通路的激活，從而降低IL-1、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子的分泌。CD163游離受體則可以促進抗炎細胞因子的分泌。它可以通過激活相關信號通路，上調抗炎細胞因子基因的表達。在巨噬細胞中，CD163游離受體與配體結合后，會激活STAT3信號通路，促進IL-10等抗炎細胞因子的分泌。這種對細胞因子分泌的調節(jié)作用可以減輕炎癥反應對機體的損傷，增強機體的抗病毒能力，從而在阻斷PRRSV感染中發(fā)揮重要作用。七、研究成果的應用前景與挑戰(zhàn)7.1在豬繁殖與呼吸綜合征防控中的應用潛力本研究成果在豬繁殖與呼吸綜合征防控領域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力，有望為解決這一困擾養(yǎng)豬業(yè)的難題提供全新的思路和方法。在新型疫苗開發(fā)方面，基于唾液酸黏附素和CD163游離受體與PRRSV的相互作用機制，可開發(fā)出更加高效、精準的疫苗。例如，利用基因工程技術，將編碼唾液酸黏附素或CD163游離受體關鍵結合區(qū)域的基因片段整合到疫苗載體中，構建重組疫苗。這種重組疫苗在進入豬體后，能夠表達出與PRRSV具有高親和力的受體片段，從而吸引病毒與這些片段結合，阻斷病毒與豬肺泡巨噬細胞表面天然受體的結合，達到預防感染的目的。與傳統(tǒng)疫苗相比，這種新型疫苗具有更強的針對性和特異性，能夠更有效地激發(fā)豬體的免疫反應，提高對PRRSV的抵抗力。研究表明，使用這種基于受體的重組疫苗免疫豬只后，在PRRSV強毒攻擊下，豬只的發(fā)病率可降低50%以上，病毒血癥持續(xù)時間明顯縮短，臨床癥狀也得到顯著緩解。診斷試劑的研發(fā)也是本研究成果的重要應用方向之一。通過對唾液酸黏附素和CD163游離受體與PRRSV結合特性的深入了解，可開發(fā)出高靈敏度和特異性的診斷試劑。例如，基于抗原抗體反應原理，利用唾液酸黏附素或CD163游離受體作為抗原，制備相應的單克隆抗體，用于檢測豬血清或組織中的PRRSV抗體。這種診斷試劑能夠快速、準確地檢測出豬是否感染PRRSV，為豬群的疫病監(jiān)測和防控提供有力支持。與現(xiàn)有的診斷方法相比，基于受體的診斷試劑具有更高的靈敏度和特異性，能夠在病毒感染的早期階段檢測到抗體，提高疫病診斷的及時性和準確性。據(jù)相關研究報道，使用這種新型診斷試劑對豬群進行檢測，其靈敏度比傳統(tǒng)ELISA方法提高了20%以上，特異性也得到了顯著增強。在治療藥物的開發(fā)上，本研究成果同樣具有重要價值。通過干擾唾液酸黏附素和CD163游離受體與PRRSV的結合，可設計出新型的抗病毒藥物。例如，篩選能夠特異性阻斷唾液酸黏附素與PRRSV結合的小分子化合物，或者開發(fā)針對CD163游離受體的拮抗劑。這些藥物在豬感染PRRSV后使用，能夠有效地抑制病毒的入侵和復制，減輕病情。研究顯示，使用這些新型治療藥物治療感染PRRSV的豬只，可使豬只的體溫在3-5天內恢復正常，呼吸道癥狀明顯減輕，病毒載量在7-10天內顯著下降。這為PRRS的臨床治療提供了新的手段，有助于降低豬只的死亡率，減少經濟損失。7.2面臨的技術和實際應用挑戰(zhàn)盡管本研究成果在豬繁殖與呼吸綜合征防控方面展現(xiàn)出了廣闊的應用前景，但在實際應用過程中，仍然面臨著諸多技術和實際應用挑戰(zhàn)。在技術層面，大規(guī)模生產唾液酸黏附素和CD163游離受體存在困難。目前，主要通過基因工程技術在細胞中表達這兩種受體，但表達量較低，生產成本高昂。以大腸桿菌表達系統(tǒng)為例，雖然其操作簡單、生長速度快，但由于其缺乏真核細胞的蛋白質修飾能力，導致表達的唾液酸黏附素和CD163游離受體可能存在結構和功能缺陷。而使用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，如中國倉鼠卵巢細胞（CHO），雖然能夠正確折疊和修飾蛋白質，但細胞培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)成本高，大規(guī)模培養(yǎng)難度大，限制了其在實際生產中的應用。此外，受體的穩(wěn)定性也是一個關鍵問題。唾液酸黏附素和CD163游離受體在體外保存時，容易受到溫度、pH值、氧化等因素的影響，導致其結構和活性發(fā)生改變。研究表明，在高溫環(huán)境下，受體的蛋白質結構會發(fā)生變性，使其與PRRSV的結合能力下降。在實際應用中，如何確保受體在儲存和運輸過程中的穩(wěn)定性，是需要解決的重要技術難題。從實際應用角度來看，成本是推廣的一大障礙。無論是新型疫苗、診斷試劑還是治療藥物的開發(fā)，都需要大量的資金投入。生產唾液酸黏附素和CD163游離受體的成本較高，這使得基于它們開發(fā)的產品價格昂貴，增加了養(yǎng)殖戶的經濟負擔。在當前養(yǎng)豬業(yè)利潤空間有限的情況下，過高的成本可能會導致養(yǎng)殖戶難以接受這些新產品，從而限制了其推廣應用。法規(guī)和政策方面也存在不確定性。目前，對于基于受體的新型疫苗、診斷試劑和治療藥物的審批標準和監(jiān)管政策還不夠完善。在疫苗審批過程中，需要進行大量的安全性和有效性試驗，審批周期長，這可能會影響新產品的上市速度。在一些地區(qū)，對于基因工程產品的使用還存在一定的限制，這也給基于唾液酸黏附素和CD163游離受體的防控技術的應用帶來了困難。7.3應對策略與未來研究方向為克服技術層面的挑戰(zhàn)，可從優(yōu)化生產工藝和探索新型表達系統(tǒng)入手。在優(yōu)化生產工藝方面，通過調整細胞培養(yǎng)條件，如優(yōu)化培養(yǎng)基成分、控制培養(yǎng)溫度和pH值、改進培養(yǎng)方式等，提高唾液酸黏附素和CD163游離受體的表達量。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞培養(yǎng)中，添加某些生長因子或營養(yǎng)成分，如胰島素樣生長因子、氨基酸等，能夠促進細胞的生長和代謝，從而提高受體的表達水平。采用分批補料培養(yǎng)、連續(xù)灌注培養(yǎng)等先進的培養(yǎng)技術，也有助于提高受體的產量。在探索新型表達系統(tǒng)方面，可嘗試使用昆蟲細胞表達系統(tǒng)或植物表達系統(tǒng)。昆蟲細胞表達系統(tǒng)具有生長迅速、易于大規(guī)模培養(yǎng)、能夠進行蛋白質翻譯后修飾等優(yōu)點。通過桿狀病毒表達載體系統(tǒng)，可將唾液酸黏附素和CD163游離受體基因導入昆蟲細胞中進行表達。植物表達系統(tǒng)則具有成本低、安全性高、可大規(guī)模生產等優(yōu)勢。利用轉基因植物，如煙草、擬南芥等，表達唾液酸黏附素和CD163游離受體，為大規(guī)模生產提供了新的途徑。為解決實際應用中的問題，可采取降低成本和完善法規(guī)政策的措施。在降低成本方面，一方面，通過技術創(chuàng)新降低生產唾液酸黏附素和CD163游離受體的成本。例如，開發(fā)高效的基因表達載體，提高基因的表達效率；優(yōu)化蛋白質純化工藝，降低純化成本。另一方面，加強與相關企業(yè)的合作，實現(xiàn)規(guī)?；a，通過規(guī)模效應降低成本。在完善法規(guī)政策方面，政府部門應加強對基于受體的新型疫苗、診斷試劑和治療藥物的審批標準和監(jiān)管政策的制定和完善。建立科學、合理的審批流程，縮短審批周期，加快新產品的上市速度。加強對基因工程產品的監(jiān)管，明確其使用范圍和條件，確保其安全性和有效性。未來的研究方向可以從深入探究作用機制和拓展應用領域等方面展開。在深入探究作用機制方面，進一步研究唾液酸黏附素和CD163游離受體與PRRSV的相互作用機制，以及它們對病毒感染相關信號通路的影響，尋找更多的作用靶點。利用蛋白質組學、代謝組學等技術，全面分析受體阻斷PRRSV感染過程中細胞內的分子變化，為開發(fā)更有效的防控策略提供理論支持。在拓展應用領域方面，將基于唾液酸黏附素和CD163游離受體的防控技術應用于其他動物疫病的防控，如非洲豬瘟、豬流感等。研究這些受體在其他病毒感染過程中的作用，開發(fā)通用的抗病毒策略。結合基因編輯技術，培育具有天然抗病毒能力的豬品種，從根本上提高豬群的抗病能力。八、結論與展望8.1研究主要結論總結本研究圍繞唾液酸黏附素和CD163游離受體在體內的表達及對PRRSV感染的阻斷作用展開，取得了一系列重要成果。在唾液酸黏附素和CD163游離受體的體內表達研究方面，通過構建表達載體并導入仔豬體內，成功實現(xiàn)了二者在仔豬體內的高表達。利用實時熒光定量PCR、免疫組織化學和蛋白質免疫印跡等技術檢測發(fā)現(xiàn)，唾液酸黏附素在肺臟、脾臟和淋巴結組織中的表達呈現(xiàn)動態(tài)變化。在導入表達載體后，其mRNA和蛋白表達量顯著上調，在第7天左右達到峰值，隨后雖有所下降，但仍維持在較高水平。免疫組織化學結果顯示，唾液酸黏附素陽性細胞數(shù)量明顯增多，且在肺臟、脾臟和淋巴結的多種細胞類型中均有表達。CD163游離受體在各組織中的表達也呈現(xiàn)類似的變化趨勢，mRNA和蛋白表達量在導入表達載體后顯著增加，陽性細胞數(shù)量增多，分布范圍擴大。在PRRSV感染模型建立與感染特性分析方面，成功構建了PRRSV感染模型，選用CH-1a株，通過鼻腔接種10^4TCID50/頭的劑量感染6-8周齡健康仔豬。感染后，仔豬出現(xiàn)典型的臨床癥狀，如發(fā)熱、咳嗽、氣喘等，體溫可升高至40℃-41℃，臨床癥狀在第7-10天達到高峰。病毒載量在感染后的第1天即可在鼻腔分泌物和肺臟組織中檢測到，隨后迅速上升，在第7-10天肺臟組織中的病毒載量達到峰值，每克組織中病毒RNA拷貝數(shù)可達10^7-10^8個。病理變化顯示，肺臟出現(xiàn)間質性肺炎，肺泡間隔增寬，炎性細胞浸潤，肺泡上皮細胞壞死和脫落；脾臟腫大，脾小體減少，淋巴細胞減少；淋巴結腫大，淋巴細胞減少，