ICS65.020.01CCSB6021IDB21/T3692—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試驗(yàn)準(zhǔn)備 25操作程序 26結(jié)果分析 4附錄A （規(guī)范性）儀器設(shè)備與化學(xué)試劑5附錄B（規(guī)范性）溶液配制 6附錄C 附錄D 附錄E（資料性）指紋圖譜 附錄F（規(guī)范性）指紋圖譜鑒定報(bào)告 圖D.1引物SSR1007、SSR1183、SSR160在12個(gè)藍(lán)莓主栽品種中的擴(kuò)增圖譜 9表C.14對(duì)SSR核心引物信息 8表E.112個(gè)藍(lán)莓主栽品種的SSR數(shù)字指紋圖譜 10表F.1藍(lán)莓品種SSR指紋圖譜鑒定報(bào)告 11DB21/T3692—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由遼寧省林業(yè)和草原局提出并歸口。本文件起草單位：大連大學(xué)、大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司。本文件主要起草人：徐國(guó)輝，王賀新，楚立威，婁鑫，趙倩，溫立柱，崔青青，周永斌。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省林業(yè)和草原局（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：大連大學(xué)（大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)學(xué)府大街10號(hào)），聯(lián)系電話DB21/T3692—20231藍(lán)莓常見品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法本文件規(guī)定了利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子標(biāo)記法對(duì)12個(gè)常見藍(lán)莓品種，進(jìn)行鑒定過程中樣品準(zhǔn)備、DNA提取、DNA質(zhì)量檢測(cè)、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物檢測(cè)等方面的技術(shù)要求。本文件適用于SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建12個(gè)常見藍(lán)莓品種DNA指紋圖譜過程中DNA分子數(shù)據(jù)采集和鑒別。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法LY/T2426棗品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRpolymerasechainreaction聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR)，是以DNA為模板，在DNA聚合酶、引物、dNTP的共同作用下使目標(biāo)片段擴(kuò)增并用于檢測(cè)分析。3.2SSR標(biāo)記simplesequencerpeatsmarker由幾個(gè)核苷酸（一般為1~6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。3.3核心引物coreprimers擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度的穩(wěn)定性和一致性，并具有較強(qiáng)的鑒別能力，可以用于進(jìn)行12個(gè)藍(lán)莓常見品種比對(duì)的人工合成引物。3.4SSR指紋圖譜SSRfingerprintDB21/T3692—20232利用SSR核心引物，對(duì)不同的藍(lán)莓品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同品種在DNA水平上的差異，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，獲得的具有差異片段的成像圖，并通過引物結(jié)合字母標(biāo)記法對(duì)不同的藍(lán)莓品種進(jìn)行特異性標(biāo)記。4試驗(yàn)準(zhǔn)備4.1儀器與試劑儀器與試劑詳見附錄A。4.2溶液配制溶液配制方法詳見附錄B，其中試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水的要求，其中銀染、顯色溶液的配制可以使用符合三級(jí)水的要求。4.3核心引物核心引物信息詳見附錄C。5操作程序5.1樣品準(zhǔn)備選取藍(lán)莓新鮮葉片，-20℃運(yùn)輸，-80℃進(jìn)行長(zhǎng)期保存。5.2DNA提取對(duì)于采集的新鮮嫩葉，使用試劑盒（TIANGEN）進(jìn)行DNA提取。操作步驟如下：a)處理材料：取植物新鮮葉片20mg，加入液氮充分碾磨后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入400μL緩沖液（LP2）和6μLRNaseA(10mg/mL)，漩渦震蕩1min，室溫放置10min；b)加入130μL緩沖液（LP2充分混勻，漩渦震蕩1min；c)12,000rpm(~13,400×g)離心5min，將上清液移至新的離心管中；d)加入1.5倍體積的緩沖液（LP3例如500μL的上清液加750μL緩沖液（LP3立即充分振蕩混勻15s。此時(shí)會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；e)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱（CB3）中（吸附柱放入收集管中12,000rpm(~13,400×g)離心30s，倒掉廢液，吸附柱（CB3）放入收集管中；f)向吸附柱（CB3）中加入600μL漂洗液（PW使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇12,000rpm(~13,400×g)離心30s，倒掉廢液，吸附柱（CB3）放入收集管中；g)重復(fù)操作步驟f；h)將吸附柱（CB3）放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱（CB3）置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；i)將吸附柱(CB3)轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL-200μL洗脫緩沖液（TE），室溫放置2min-5min，12,000rpm(~13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中，以待檢測(cè)。5.3DNA質(zhì)量檢測(cè)5.3.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNADB21/T3692—20233取1μL提取的DNA原液，在100V的電壓下，用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳20min左右，取出凝膠，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳條帶應(yīng)單一、無拖尾。5.3.2鑒定DNA的濃度和質(zhì)量吸取1.5μL提取的DNA原液，通過NanoDrop檢測(cè)DNA濃度和是否有RNA、蛋白質(zhì)或酚污染，純凈樣品DNAOD260/OD280的比值應(yīng)在1.7-1.9之間。5.4PCR擴(kuò)增5.4.1反應(yīng)體系SSR的反應(yīng)體系：正反向引物（10μmol/L）各1μL、2×TaqPCRMasterMix8μL、模板100ng、添加滅菌超純水至20μL。所使用的SSR引物根據(jù)已公布的藍(lán)莓品種Drapper基因組自主研發(fā)獲得。5.4.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性10min，94℃變性40s，退火70s（具體退火溫度根據(jù)引物來定，詳見附錄C），72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。5.5PCR產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，通過掃描儀進(jìn)行拍照，用人工讀帶和字母數(shù)字結(jié)合的方法進(jìn)行分析。5.5.1凝膠制備將洗凈晾干的玻璃板用水平灌膠的方式組裝玻璃板，鐵夾固定，取8mL5×TBE，16mL30%丙烯酰胺，15mL去離子水于燒杯中，加入0.28mL的10%APS，14μL的TEMED(每100mL聚丙烯酰胺加35μLTEMED)（參考LY/T2426的方法進(jìn)行凝膠制備），混勻灌入板中，插入梳子，等待聚合，拔出梳子，吸取多余的水，裝板。5.5.2點(diǎn)樣用微量移液器取3μL-5μL（具體數(shù)值依據(jù)點(diǎn)樣孔大小確定）PCR產(chǎn)物加入樣品槽，每加一個(gè)樣品后，在電泳液中吸打清洗移液器兩次，最后加入marker用于區(qū)分不同大小的條帶。5.5.3電泳加樣完畢后，加入電極緩沖液，上槽電極緩沖液要沒過矮玻璃板，下槽電極緩沖液要沒過玻璃板下方邊緣，將電源線正極接下槽，負(fù)極接上槽。電壓為120V，根據(jù)指示劑位置調(diào)整時(shí)間，電泳到樣品與marker到達(dá)膠板的末端處時(shí)停止電泳，電泳時(shí)間約為2h。5.5.4銀染顯色a)玻璃板的分離：電泳結(jié)束之后，小心地將長(zhǎng)、短玻璃分開；b)固定膠：將粘在一起的聚丙烯酰胺的長(zhǎng)玻璃板放入塑料淺盤中，加入固定液，將玻璃板在搖床上緩慢搖動(dòng)20min或至電泳示蹤液消失。凝膠可在固定液中靜止過夜；c)染色：將凝膠浸入染色液中并在搖床上緩慢搖動(dòng)20min；DB21/T3692—20234d)顯色反應(yīng)：將凝膠浸入蒸餾水中，清洗兩次，每次10s，然后取出，瀝干水分，立即放入盛有預(yù)冷顯色液的塑料盤中，并于搖床上緩慢搖動(dòng)持續(xù)顯色，直至全部條帶出現(xiàn)；e)洗膠：用蒸餾水漂洗凝膠兩次，每次2min；f)干膠：通過熱對(duì)流或室溫放置，使膠變干，然后在淺色的背景下掃描照相。5.5.5成像銀染結(jié)果于凝膠成像儀上進(jìn)行觀察拍照。6品種鑒定6.1指紋圖譜的構(gòu)建在選取的12個(gè)常見藍(lán)莓品種中，對(duì)4對(duì)核心引物SSR1007、SSR1153、SSR1183、SSR160在12個(gè)藍(lán)莓品種中的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行記錄，擴(kuò)增結(jié)果見附錄E。每對(duì)引物只分析目標(biāo)條帶附近的擴(kuò)增位點(diǎn)，按照電泳圖中從上到下依次命名為A、B、C、D等，將其整理為數(shù)字指紋圖譜，圖譜見附錄F。6.2品種鑒定將需要進(jìn)行品種鑒定的材料根據(jù)操作程序進(jìn)行樣品準(zhǔn)備、DNA提取、DNA質(zhì)量檢測(cè)、PCR擴(kuò)增與PCR產(chǎn)物檢測(cè)，將統(tǒng)計(jì)得到的條帶情況與前期構(gòu)建的指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，得到與指紋圖譜中一致的品種，認(rèn)定為“疑似相同品種”，結(jié)合田間表型鑒定，對(duì)于需要鑒定的材料進(jìn)行品種鑒定，并出具鑒定報(bào)告，鑒定報(bào)告見附錄G。DB21/T3692—20235（規(guī)范性）儀器設(shè)備與化學(xué)試劑A.1儀器設(shè)備高壓滅菌鍋（105℃~136℃,最大工作壓力0.22MPa）；凝膠自動(dòng)掃描儀（400百萬像素）；高速冷凍離心機(jī)（最大離心力不小于15000g）；PCR擴(kuò)增儀（0℃~100℃);多功能酶標(biāo)儀；恒溫水浴鍋（室溫～99℃);電子天平（最小顯示0.0001g電泳儀；垂直電泳槽（樣品通量1.0mm厚磁力攪拌器（0r/min～2500r/min，室溫～100℃);酸度計(jì)（-2.00～20.000pH微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、500μL和1000μL）。A.2化學(xué)試劑TIANGEN新型植物基因組DNA試劑盒、液氮、無水乙醇、瓊脂糖、GoldView染料、6×loadingbuffer、冰乙酸、瓊脂糖、2000bpDNALadder、100bpDNALadder、2*TaqPCRMasterMix、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥基甲基氨甲烷（Tris）、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、硝酸銀（AgNO3）、氫氧化鈉（NaOH）、37%甲醛、SSR引物、滅菌超純水。除特殊說明外，所用試劑均為分析純?cè)噭B21/T3692—20236（規(guī)范性）溶液配制B.1配制1mol/LNaOH稱取4gNaOH，加水定容至100mL。B.2配制1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液稱取121.1gTris，濃鹽酸調(diào)至pH8.0，加水定容至1L，高壓滅菌備用。B.3配制0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液稱取186.1gEDTA-Na2，800mL水，1mol/LNaOH調(diào)至pH8.0，加水定容至1L后高壓滅菌備用。B.4配制1×TE（Tris-EDTAbuffersolution）取1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加水定容至100mL。B.5聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑B.5.1配制70%乙醇取700mL無水乙醇，加水定容至1L。B.5.2配制5×TBE緩沖液分別稱取54g三羥基氨基甲烷，27.5g硼酸，加入800mL水加熱溶解，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液20mL，加水定容至1L。B.5.3配制1×TBE緩沖液取100mL10×TBE，加水定容至1L。B.5.4配制10%過硫酸銨稱取0.5g過硫酸銨溶于5mL水中。B.5.5配制12%聚丙烯酰胺凝膠溶液（40mL）分別取30%丙烯酰胺16mL、5×TBE8mL、10%過硫酸銨0.28mL、TEMED0.014mL、加水15mL、4℃條件下保存。B.5.6配制染色液1L的蒸餾水中加入3g的硝酸銀和5mL的冰乙酸、100mL無水乙醇。B.5.7配制顯色液1L的超純水中加30g的NaOH，冰浴冷卻，使用前加入5mL的37%甲醛。B.5.8配制固定/終止液DB21/T3692—20237將5mL的冰乙酸和100mL的無水乙醇加入到500mL蒸