五味子主要活性成分的提取及抗氧化活性研究題目五味子主要活性成分的提取及抗氧化活性研究第一章緒論五味子屬多年生落葉藤本木蘭科植物，五味子營養(yǎng)豐富，毒性小，原材料來源豐富，藥理作用廣泛，是一種存在良好開發(fā)前景的藥食兼用的傳統(tǒng)中藥材[1]。北五味子和南五味子已經(jīng)被收錄于《中華人民共和國藥典》，物產(chǎn)豐富、地大物博的東北地區(qū)是北五味子的家鄉(xiāng)；長江流域以南地區(qū)的氣候則適宜南五味子的成長。五味子的主要入藥部分就是他的成熟果實(shí)部分，但由于地區(qū)以及氣候的差異，相比之下，果實(shí)更加飽滿圓潤、味道更為甘甜的北五味子的藥效強(qiáng)于南五味子，逐漸成為該藥材的主要使用品種。五味子藥材的興起應(yīng)用，都是因?yàn)槲逦蹲恿己玫乃幚砘钚宰饔?，以及藥性緩和食用安全的性能。而且除藥用外，五味子飲料、食品的問世，更加大了五味子資源的需求量[2]。人們?yōu)榱烁由钊氲恼J(rèn)識和明白五味子的全部性能，以便更好地開發(fā)五味子的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值，在過去數(shù)十年間，經(jīng)過眾多學(xué)者不斷研究，多種現(xiàn)代提取技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，使我們對其藥理活性和臨床應(yīng)用的掌控更為精確，更大程度的提高了其中有效成分的提取率和利用率，如如法多索溶劑萃取、超臨界CO2萃取，加速溶劑萃取、超高壓萃取、植物組織破碎萃取、乳化劑萃取、植物油提取、微波輔助萃取和超聲波萃取等[3]。但實(shí)驗(yàn)室中最常見的提取方法還是以回流法、索氏提取法為主的傳統(tǒng)方法，特別是回流提取法，因裝置簡單易行、成本低廉、環(huán)保安全的優(yōu)點(diǎn)，仍作為一種基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)兼對照方法，常與新研發(fā)出的提取方法并存對照，對比提取率判斷新方法的優(yōu)劣性。五味子現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用與廣泛的產(chǎn)品之中，并且通過不同的發(fā)酵過程和生產(chǎn)過程，可以生產(chǎn)各種不同的物種，如五味子果酒、五味子果醋等。五味子復(fù)合茶亦是新興產(chǎn)品，以五味子的主要葉片為主要原料，輔以糯米，龍眼等，隨著溫火的加熱，制造出口豐富，糖含量低的口味香醇的產(chǎn)品。加入五味子后，酸奶、冰淇淋等產(chǎn)品可以制成不同的顏色，且質(zhì)地均勻細(xì)膩，口感好。五味子磨粉也已被用作人們的調(diào)味品，其風(fēng)味類似于胡椒，通常被稱為山葡萄。五味子提取物富含營養(yǎng)成分和鐵、鎂等無機(jī)元素。它具有多種健康功能，影響人體大腦皮層的興奮過程和抑制過程，調(diào)節(jié)和促進(jìn)大腦皮層和新陳代謝，也能達(dá)到提高身體免疫力的目的。同時(shí)，適量服用五味子也有強(qiáng)心、增加血壓、興奮機(jī)體、加快呼吸的作用，并可以降低血清轉(zhuǎn)氨酶。未來的生活我們?nèi)舾雍侠淼倪\(yùn)用五味子，使其高營養(yǎng)價(jià)值和改善保健功能得到充分利用，不僅可以將產(chǎn)品升級到更高的程度，而且還可以減少添加劑的使用，大大增加了經(jīng)濟(jì)效益與良好的社會(huì)福利，形成良性循環(huán)。本文主要以五味子果實(shí)為原料，探究五味子木脂素的最佳提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置不同單因素變量對五味子中木脂素類化合物的提取過程進(jìn)行優(yōu)化選優(yōu)，探究最優(yōu)提取方法并確定最佳提取條件，最后對整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程及內(nèi)容進(jìn)行綜合敘述。第二章文獻(xiàn)綜述2.1五味子的研究概況2.1.1五味子簡介五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)是一種落葉木本植物，屬于五味子科。這是一種園藝植物，果實(shí)可食用，如圖2-1所示。它用于醫(yī)學(xué)和制造繩索[4]。五味子在我國傳統(tǒng)中藥材中的應(yīng)用歷史已經(jīng)十分久遠(yuǎn)，始記載于東漢古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》，是滋補(bǔ)、養(yǎng)生、養(yǎng)顏的上等藥材。五味子適于生長在PH小于4的偏酸性沃土中，在山坡深谷中的灌木叢周圍均可能發(fā)現(xiàn)野生植株。其耐旱性較差，自然條件下，在肥沃、排水好、濕度均衡適宜的土壤上發(fā)育最好[5]。五味子的果實(shí)一般是微皺有光澤的紅色形狀不均的球形，我們經(jīng)常食用的五味子一般在9-10月份最適宜采摘。成熟了的果實(shí)，果皮微薄且口感極脆、果肉的味道屬酸、種子粉碎氣味屬辛與苦，干燥后再稍事加工便可投入使用。功能與主治收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心。用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠[6]。由此五味子除了在藥品研究開發(fā)中應(yīng)用外，還在飲品研究中逐步深入。五味子優(yōu)秀的藥理作用已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在藥品、保健食品的研發(fā)、生產(chǎn)之中，保護(hù)肝臟、對心血管的修復(fù)、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠和降血脂等作用都是五味子作為藥食同源藥材的重要功能特點(diǎn)，因具有良好的增強(qiáng)身體免疫機(jī)能的作用，逐漸成為我們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常應(yīng)用到的植物類中藥。五味子中的主要藥理活性成分包括木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖以及一些維生素等物質(zhì)，如圖2-2所示，但目前對五味子活性成分研究主要集中在木脂素類，對其它分的研究相對較少[8]。圖2-1五味子木脂素類化合物一般存在于高等植物中，其脂素類化合物是母核為1，2，3，4-聯(lián)苯-1，3-環(huán)辛二烯的一種常見木脂素，可以稱為二聚苯丙素類[9]。木脂素是一種多酚無定形物質(zhì)，主要來源于單木質(zhì)醇（對香豆素基，松柏基和芥子醇）的脫氫自由基聚合。每種木脂素都會(huì)產(chǎn)生不同類型的木脂素單位：對羥基苯基（H），愈創(chuàng)木基（G）和紫丁香基（S）單元，其根據(jù)細(xì)胞中的生長地點(diǎn)、成熟度和定位而變化。木脂素通常顯示具有高度縮合的交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)的不規(guī)則結(jié)構(gòu)。木脂素組成在不同的維管植物組中是不同的，分別是軟木（木本裸子植物），硬木（木本被子植物）和草本植物的G-、GS-和HGS-型木脂素。這些天然木脂素包括縮合的單元間連接（5－C－5'，4－O－5'，和5－5'）和芳基醚鍵（β－O－4，β－β和β－5）其中含β－O－4芳醚鍵的是天然木脂素中最常見的[10]。圖2-2粗處理的北五味子2.1.2五味子的藥理活性木脂素的藥理功效作用，最顯著的特點(diǎn)就是對肝臟病毒的抵御作用和對腫瘤和細(xì)胞老化的活性與抗性，以及對物理性能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明：五味子可以抵抗?jié)儞p傷、減緩細(xì)胞的氧化與迅速衰老、并且還具有止咳化痰清肺、保護(hù)肝臟膽疾病的功效、長期服用也有擴(kuò)張血管、增強(qiáng)免疫功能等顯著作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，對肌肉有松弛作用。2.1.3五味子的保肝作用肝臟預(yù)防疾病的能力是十分有限的，遭到病毒侵害后很難自我保護(hù)清除病毒，繼而引發(fā)疾病。各類型病毒性肝炎、某些化學(xué)物質(zhì)（如四氯化碳、半乳糖胺）、某些藥物（如撲熱息痛）均會(huì)造成肝細(xì)胞損傷。而肝細(xì)胞損傷又可能引起肝纖維化和肝硬化。因此，防止或減緩肝細(xì)胞的損傷，是治療肝病的首要目標(biāo)。五味子單味或與其他中藥配伍用于急、慢性肝損傷的治療，可以促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)、降低血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性[12]。但在近幾年對木脂素類化合物的研究中發(fā)現(xiàn)，可以實(shí)現(xiàn)以上功能的物質(zhì)正是存在于五味子中的部分木脂素，如華中五味子果實(shí)中五味子酯甲就有這種作用。金昔陸等[13]的研究發(fā)現(xiàn)：從南五味子中使用乙醇所提取出的木脂素類化合物因具有顯著的對抗羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和清除超氧陰離子自由基的作用，從而能夠起到很好的護(hù)肝、保肝、養(yǎng)肝的顯著功效作用。2.1.4五味子對心血管系統(tǒng)的作用適量的服用五味子可以達(dá)到強(qiáng)心、加快血液流動(dòng)的作用，五味子的水浸液及稀醇配置藥物浸液進(jìn)入人體，可使心肌收縮明顯減緩，并且使血管活性增加，張力變大。劉菊秀1999年的研究表明，北五味子水提醇沉注射液可使在體蛙心單相動(dòng)作電位頻率減慢、動(dòng)作電位幅度減少、平臺期下移、平臺期縮短，可使離體蛙心心肌收縮力減弱，作用強(qiáng)于心得安[14]。2.1.5五味子提純物具有影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)為能夠抗疲勞、安定、鎮(zhèn)痛及使肌肉松弛等作用。在中醫(yī)理論中有大量記載：適量的服用五味子，可以加強(qiáng)人腦中樞神經(jīng)各部分進(jìn)行的反射性反應(yīng)時(shí)的程度，能注意力與觀察力，提高工作效率與工作質(zhì)量。且還有其它研究報(bào)告顯示：五味子的服用還可以達(dá)到明鎮(zhèn)定靜心的效果，研究報(bào)告中，五味子乙醇提取液、五味子水提取物均可使小鼠自主活動(dòng)明顯減少，延長巴比妥睡眠時(shí)間、抑制動(dòng)物攻擊行為，對抗電休克和化學(xué)性驚厥，作用與安定藥相似，尚有鎮(zhèn)痛、肌肉松弛作用[15]。2.1.6五味子延緩衰老、增強(qiáng)抗病能力作用五味子具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老的作用[16]。研究表明，它具有良好的抗衰老作用，可使衰老小鼠已萎縮的胸腺及脾臟明顯增大變厚，胸腺皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)及脾淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增加，脾小結(jié)增大，提示五味子多糖可提高衰老小鼠的免疫功能，也可明顯促進(jìn)衰老小鼠神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育[17]。實(shí)驗(yàn)證明，具備著明顯適應(yīng)原樣作用的藥材當(dāng)屬東北三寶之一的人參，可以增強(qiáng)人對非特異性刺激的防御能力，而北五味子經(jīng)過多重實(shí)驗(yàn)證明具有著與人參和其它一些小中藥類似的功效性能，雖然不及其它藥物功效明顯見效迅速，但更好的證明五味子性溫，對人體的傷害程度低，副作用小，易于人體的吸收與發(fā)揮功效。2.1.7五味子抗?jié)冏饔萌藗兩顗毫Φ脑龃螅嬍巢灰?guī)律等不良習(xí)慣易形成胃潰瘍等胃部嚴(yán)重疾病，適量服用五味子可以在不影響胃蛋白酶活性的前提下降低胃液的酸度及濃度，以較為緩和的藥理效果對胃、膽進(jìn)行保護(hù)修復(fù)。對胃部的異常反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制效果，利于對胃以及膽的修復(fù)保護(hù)。2.1.8五味子抑菌作用近些年經(jīng)過人對五味子的深入調(diào)查以及實(shí)際應(yīng)用得出：五味子醇浸出液在體外對炭疽桿菌、霍亂弧菌、白色葡萄球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌A和B、異型痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎桿菌、志賀痢疾桿菌、變形桿菌等均有抑制作用；pH值升高，抗菌作用減弱，說明其抗菌作用可能與其所含有機(jī)酸有關(guān)[18]。浸出液在體內(nèi)和體外都有抗病毒作用，并且在體外對綠膿桿菌、鼻疽桿菌亦有較強(qiáng)的抗菌作用，在軀體之外仍然具有清殺寄生類蛔蟲的功效。2.1.9其他作用黃玲等研究結(jié)果表明，五味子多糖對S180荷瘤的增長有抑制作用[19]。朱家媛等[20]在1997年的研究中發(fā)現(xiàn)，五味子能夠促進(jìn)精子的產(chǎn)生，即具有保護(hù)腎臟及增強(qiáng)生殖系統(tǒng)的作用。正常人罹患眼疾時(shí)適量服用五味子亦可達(dá)到明目、清晰視野的作用，聽力受到影響時(shí)也可加強(qiáng)人們對聲音的辨識度，對聽力有極大的改善作用。此外，有研究報(bào)告表明，五味子對糖代謝、子宮機(jī)能也具有一定的影響。2.2五味子的研發(fā)前景五味子作為藥食兩用類食品的優(yōu)秀原料，以著其優(yōu)秀的營養(yǎng)價(jià)值性能以及安全放心的食用特性，深受人們的追捧與喜愛。在我國廣闊的市場上，五味子類的酒類飲品以及果醬、果酪、果凍、果汁、果糕等日常食用制品已經(jīng)有了很可觀的需求量，五味子制品已經(jīng)被人們接受認(rèn)可。并且，隨著影響范圍的逐漸擴(kuò)大，在日本、韓國競爭激烈的食品市場上，五味子的系列產(chǎn)品也以其優(yōu)良的性能有了一席之地。從目前市場形勢分析，由于五味子藥食作用的日漸顯現(xiàn)，在醫(yī)療產(chǎn)品、保健食品的開發(fā)等層面，國內(nèi)外對五味子需求都在日益增加，五味子供不應(yīng)求[21]。因此，五味子功效的研究和深度開發(fā)成為我們新的等待研究的問題。2.3木脂素類化合物木脂素是五味子科植物中的主要活性與藥用成分，最早是從樹脂提取物中分離得到，因而得名。木脂素類化合物的結(jié)構(gòu)類型多、立體化學(xué)復(fù)雜，具有保護(hù)肝臟、預(yù)防腫瘤、預(yù)防艾滋病等多種生物活性[22]。關(guān)于五味子的化學(xué)成分的研究報(bào)道很多，提取分離后得到的化合物種類繁多，其中，三萜類化合物目前分離得到的有100多種，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、新穎獨(dú)特。木脂素類化合物為主要活性成分。2.3.1概述木脂素的概念最早是由R.D.Haworth提出來的，用來指兩分子苯丙烷通過側(cè)鏈的中心碳原子相連而構(gòu)成的二聚體。具體來說，在中藥五味子、連翹葉、細(xì)辛和刺五加等植物中都發(fā)現(xiàn)了木脂素類化合物，在鬼臼、透骨草和珠子草等草藥中亦發(fā)現(xiàn)木脂素類化合物。由于植物中大部分木脂素類化合物都是以游離狀態(tài)存在的，所以所具有的極性都比較弱，因其在2個(gè)苯環(huán)上多數(shù)有酚羥基，少的僅有一個(gè)，多的可達(dá)四五個(gè)，具有一定的酸性。沒有酚羥基的只能用非極性有機(jī)溶劑做浸出溶劑，有酚羥基的可以利用堿性水溶液做浸出溶劑，這些酚羥基也可用于木脂素的精制提煉和純化分離。提煉出的木脂素類化合物常見的都為白色結(jié)晶性固體，有旋光性，一般沒有揮發(fā)性，也不能隨水蒸氣蒸餾，只有少數(shù)在加壓下升華。且許多木脂素類化合物由于飽和的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分有立體異構(gòu)體存在。木脂素類化合物的在人體的功能特性大致分為兩個(gè)區(qū)域功能：一部分是以簡單的化學(xué)成分木脂素類化合物游離存在作用，另一部分是與構(gòu)造形成和生命要素分泌息息相關(guān)的木脂素，但又有明顯區(qū)別的新木脂素類。按其結(jié)構(gòu)的分類是以苯丙素（C6-C3）為基本單位通過不同位置聚合分類。2.3.2五味子的可利用成分木脂素五味子中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)可分為聯(lián)苯環(huán)烯木質(zhì)素、4-芳基四氫萘木質(zhì)素、螺苯駢呋喃聯(lián)苯環(huán)辛二烯木質(zhì)素、2，3-二甲基-1，4-二芳基丁烷木質(zhì)素、2，5-二芳基四氫呋喃木質(zhì)素五類[23]。五味子含有的重要成分：醇甲（Schizandrin）、醇乙（Schisandrol）、酯甲（Schisantherin）、甲素（Deoxyschizardrin）和乙素（Schisandrinb）五種木脂素類化合物，如圖2-3。2015年版《中國藥典》將五味子和華中五味子分別規(guī)定，并規(guī)定五味子的五味子醇甲含量不得少于0.40%，規(guī)定華中五味子的五味子酯甲含量不得少于0.20%[24]。圖2-3五味子木脂素成分2.4五味子的提取方法2.4.1回流提取法回流提取法是我們在實(shí)驗(yàn)室中分離天然物質(zhì)部分組分的最常識的應(yīng)用比對方法，利用不同有機(jī)溶劑有不同的溶解被提取物質(zhì)能力的原理，使目的物質(zhì)溶解于被提取液中，從而達(dá)到分離提取純化的目標(biāo)。回流提取法的優(yōu)勢就在于對于器械要求較低，裝置簡單易拼裝，且安全系數(shù)高，綠色環(huán)保，且得到的提取率較高。但對提取劑的利用并不充分，易造成浪費(fèi)變相增加實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，且因部分物質(zhì)的溶解范圍相差不是十分大，易產(chǎn)生提取物中所含其它成分較高，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠幸欢ǔ潭鹊挠绊?。但是回流法提取效率較滲漉法高，且所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間少。熱回流提取法是應(yīng)用有機(jī)溶劑進(jìn)行加熱提取，需采用加熱回流裝置，以免溶劑揮發(fā)造成損失[25]?；亓鲗?shí)驗(yàn)提取的樣品質(zhì)量體積較小時(shí)，瓶內(nèi)藥品所占據(jù)的容積應(yīng)為容量瓶的1∕3－1∕2，體積不能過多或過少，所用溶劑應(yīng)浸過藥材表面1-2cm，在水浴中加熱、回流，實(shí)驗(yàn)時(shí)間以一小時(shí)為基礎(chǔ)空白組。等待回流完全后，靜止冷卻抽濾，若有需要，可再向過濾后固體殘?jiān)屑尤胩崛?，進(jìn)行第二、三次的加熱回流，重復(fù)試驗(yàn)過程，所用時(shí)間均為約0.5h，直至有效成分基本提盡為止。2.4.2超聲提取法超聲波是指震動(dòng)頻率維持在20KHz到100MHz的高振聲波，這個(gè)頻率不在人體的接收喚起聽覺的范圍內(nèi)。超聲波提取法即是利用超聲波，通過產(chǎn)生高速的振動(dòng)能量，對被提取物質(zhì)分子進(jìn)行處理震蕩受力，利用空化效應(yīng)，即當(dāng)大能量的超聲波作用于介質(zhì)時(shí)，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴，這些小空穴瞬時(shí)閉合，并產(chǎn)生高達(dá)幾千個(gè)大氣壓的瞬間壓力，即空化現(xiàn)象，產(chǎn)生氣泡與氣泡的碎裂，產(chǎn)生的氣泡溫度高最高達(dá)5000K，內(nèi)部壓力可達(dá)1000atm。經(jīng)過一系列的機(jī)械能、內(nèi)能相互轉(zhuǎn)化傳遞后，生成大量可提取出物質(zhì)的能量，加熱和冷卻速率達(dá)到1010K/s?？纱偈褂袡C(jī)或無機(jī)類被提取成分從固體樣中浸出是超聲提取法最明顯區(qū)別于其他方法的優(yōu)點(diǎn)，超聲波促進(jìn)的傳質(zhì)作用，可以使溶劑更迅速更完全的滲透進(jìn)入到樣品基質(zhì)中。美國等擁有先進(jìn)超聲波提取法技術(shù)的國家已經(jīng)對蘿芙、吐根、耶仆蘭等藥用植物進(jìn)行了超聲提取的深入研究實(shí)驗(yàn)，并已經(jīng)獲得了十分優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果。在我國，超聲波技術(shù)作為試驗(yàn)方法中的新興佼佼者，已在各種提取工業(yè)中大放異彩，其良好的發(fā)展與應(yīng)用前景，也在受著人們廣泛認(rèn)可與關(guān)注。根據(jù)很多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，超聲輔助提取技術(shù)可以在很大程度上減少實(shí)驗(yàn)所耗時(shí)間加快試驗(yàn)進(jìn)度，并且實(shí)驗(yàn)方法較為先進(jìn)，可以提高實(shí)驗(yàn)的提取率。在目前我們所掌握的提取物質(zhì)方法中，超聲輔助提取技術(shù)因可在同等條件下增大提取效率、成本低廉已經(jīng)廣泛食品和植物化學(xué)領(lǐng)域，并且取得了良好的效果。超聲輔助提取法是在傳統(tǒng)的提取方法中加入超聲波的一種新型提取方法。首先超聲的空化作用可以破壞植物細(xì)胞壁，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)更容易滲出；其次超聲波可以使介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)加快，從而使目標(biāo)物質(zhì)的溶出速度加快；最后因?yàn)槌暡ǖ陌l(fā)射是圍繞著物質(zhì)四面進(jìn)行的，可以使提取源物質(zhì)均勻而全面的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程，提高了提取效率。利用超聲輔助提取技術(shù)不僅可以增加酶的溶出量，還可以大大地縮短提取時(shí)間，使提取過程變得簡便。然而，一些穩(wěn)定性較差的酶，一旦在超聲波的作用下就容易變性而失活，而達(dá)不到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果，所以超聲提取法的使用還需判提取源斷物質(zhì)的物化性質(zhì)。2.4.3微波提取法微波提取法（MicrowaveExtractionTechnique，MWE）是利用電磁場的作用,使固體或半固體物質(zhì)中的某些有機(jī)物成分與基體有效的分離,并能保持分析對象的原本化合物狀態(tài)的一種分離方法.此方法具有提取時(shí)間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[26]。微波實(shí)驗(yàn)方法被人們用來提取天然植物中的成分物質(zhì)，始于20世紀(jì)90年代，是微波和傳統(tǒng)溶劑提取法相結(jié)合，利用微波能量來提高萃取率的一項(xiàng)技術(shù)。浸出過程中植物細(xì)粉不凝聚不糊化，克服了熱水法易凝聚易糊化的不足。微波輔助萃取法的主要實(shí)驗(yàn)進(jìn)程分為三個(gè)：隨著時(shí)間增加，樣品物質(zhì)受到的壓力和溫度持續(xù)上升，使物質(zhì)細(xì)胞加速開裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，被測物質(zhì)脫離更加迅速。提取劑加速進(jìn)入實(shí)驗(yàn)基質(zhì)；(3)被提取物質(zhì)被溶解，有效成分溶解至提取劑中。該方法具有加熱快、時(shí)間短，提取率高等特點(diǎn)，同時(shí)因提取中減少了有機(jī)溶劑的使用而被稱為綠色技術(shù)[4]。2.4.4紫外分光光度法紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法，當(dāng)光穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化[27]。被測量樣品光波特性不同，測量后，吸收與波長的關(guān)系，可以得出三種物質(zhì)的吸收光譜測量的最大長度可以計(jì)算吸收波長λmax和最小長度的吸收波長λmin的吸收光譜。因此，通過將物質(zhì)所有的特殊范圍波長與標(biāo)準(zhǔn)光譜比較，或通過計(jì)算確定λmax，即可通過計(jì)算測得物質(zhì)提取率含量范圍。2.5本論文研究內(nèi)容及目的意義五味子優(yōu)秀的藥理作用已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在藥品、保健食品的研發(fā)、生產(chǎn)之中，保護(hù)肝臟、對心血管的修復(fù)、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠和降血脂等作用都是五味子作為藥食同源藥材的重要功能特點(diǎn)，因具有良好的增強(qiáng)身體免疫機(jī)能的作用，逐漸成為我們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常應(yīng)用到的植物類中藥。目前的研究難題取在于，隨著對五味子木脂素新產(chǎn)品種類與目標(biāo)的不斷發(fā)展進(jìn)步，五味子的需求量越來越高，逐漸成為亟待解決的問題。傳統(tǒng)五味子有效成分的提取方法耗時(shí)長、操作復(fù)雜、有機(jī)溶劑使用量大，會(huì)對環(huán)境造成污染。因此，建立開發(fā)一種節(jié)約原料、環(huán)境友好、方便快捷、提取時(shí)間短的提取方法是非常必要的。四種提取方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定五味子木脂素的最佳提取方法以及最佳提取條件，以下是本論文的主要研究內(nèi)容：第一部分：采用3種提取方法對五味子中木脂素進(jìn)行提取，單因素變量下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)。第二部分：紫外分光光度法測定提取出的木脂素的吸光度，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取率，對比選出最佳提取方法及最佳提取條件。第三部分：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

第三章實(shí)驗(yàn)部分3.1材料、試劑及儀器3.1.1實(shí)驗(yàn)材料遼寧丹東鳳城市北五味子，購于長春市寬城區(qū)一匡街吉林大藥房。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)藥品相關(guān)信息無水乙醇（色譜級）禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司（山東，中國）甲醇（色譜級）禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司（山東，中國）超純水（超純水制備機(jī)制備）禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司（山東，中國）乙腈（色譜級）禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司（山東，中國）正己烷（色譜級）禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司（山東，中國）五味子木脂素類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：五味子醇甲、五味子酯甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素（純度均大于99%）購于Dr.EhrenstorferGmbH公司（Augsburg,Germany）3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器編號名稱1.多用途恒溫超聲波提取機(jī)（JOYN-650WTC，上海喬躍電子有限公司）2.高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司3.家用微波爐4.超純水制備機(jī)（日本）5.紫外分光光度計(jì)6.精密pH試紙，北京化工廠7.萬分之一分析天平8.實(shí)驗(yàn)室用回流提取裝置3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1樣品的預(yù)處理本實(shí)驗(yàn)中將購買的北五味子，放入烘箱中，在35℃下干燥48h后取出。再用高速粉碎機(jī)將其粉碎后過40目篩，貼上標(biāo)簽后放入干燥器中備用。加標(biāo)樣品的配制是向一定量的樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品之后，充分混合與研磨制成的，加標(biāo)樣品用于方法評價(jià)中加標(biāo)回收率的測定。3.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（以五味子脂甲為標(biāo)準(zhǔn)品）對照品溶液的制備：精密稱取五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.5mg/mL的對照品溶液。精密移取五味子脂甲對照品溶液2mL，用甲醇定容至50mL為對照品A。稱10g變色酸溶于90mL蒸餾水待用。精確移取25ml對照品A用50ml容量瓶定容為對照品B，精確移取25ml對照品B用50ml容量瓶定容為對照品C，精確移取25ml對照品C用50ml容量瓶定容為對照品D，精確移取25ml對照品D用50ml容量瓶定容為對照品E，精確移取25ml對照品E用50ml容量瓶定容為對照品F，分別移取A、B、C、D、E、F對照品3mL至具塞試管搖勻。一式三份，另取甲醇3mL作為空白對照，蒸干后精密加變色酸水溶液0.5mL、水1.5mL、濃硫酸3mL，沸水浴加熱30min，放冷，用紫外分光光度計(jì)在570nm處檢測。以濃度為橫坐標(biāo)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程得y=0.04002x+0.01876，R2=0.999，濃度在0.625-20μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。總木脂素含量以五味子酯甲計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，如3-1所示。圖3-1五味子的標(biāo)準(zhǔn)曲線3.2.3回流提取法稱取五味子樣品粉末(過40目篩)1.00g，置50ml錐形瓶中，精密加入乙醇，回流提取30min，冷卻后過濾，濾液加入50ml容燒瓶中定容，搖勻[28]，如圖3-2所示。待優(yōu)化條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時(shí)間圖3-2回流提取法流程圖3.2.4超聲提取法取試驗(yàn)品（五味子）過40目篩，約0.25g，操作準(zhǔn)確稱定，投入超聲用瓶中，加乙醇約20ml至探針深入液面，封口膜封口，調(diào)整儀器表功率200W，30min，開始超聲處理。處理結(jié)束后取出，過濾，定容，取1ml，測定吸光度[29]，如圖3-3所示。下一步優(yōu)化條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時(shí)間、功率圖3-3超聲提取法流程圖3.2.5微波提取法稱取粉碎后的五味子果實(shí)0.25g，進(jìn)行微波提取，加入無水乙醇，調(diào)微波功率210W、提取時(shí)間60s，冷卻后取出，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，混勻[30]，如圖3-4所示。待優(yōu)化條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、功率、時(shí)間圖3-4微波提取法流程圖3.2.6提取率和回收率的測定提取率指的是一定質(zhì)量樣品中提取的目標(biāo)化合物占樣品總量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算如式3-1所示。（公式3-1）式中:C—供試品溶液的濃度，μg/mL；V—供試品溶液的總體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g。3.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與討論為了確定一定條件下能獲得五味子木脂素類化合物最高的提取率的提取方法，本文對會(huì)影響提取效率的諸個(gè)條件設(shè)置了單因素實(shí)驗(yàn)。3.3.1回流提取法3.3.1.1乙醇含量提取劑中乙醇含量作為回流提取的重要參數(shù)之一，是影響提取率的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種采用不同含量乙醇的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，分別是：70%、80%、90%、100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-5所示，在樣品質(zhì)量為1g，回流時(shí)間為30min，料液比為1比20的條件下，乙醇含量為90%的狀態(tài)下得到的提取率為最佳。圖3-5乙醇含量對提取率影響3.3.1.2料液比本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種不同比例下的料液比進(jìn)行了考察，分別是：1:10、1:20、1:30、1:40，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-6所示，在樣品質(zhì)量為1g，回流時(shí)間為30min，采用含量為90%的乙醇的條件下，料液比1:30條件下得到的提取率為最佳。圖3-6料液比對提取率影響3.3.1.3時(shí)間本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四組不同的回流時(shí)間進(jìn)行了考察，分別是：20min、30min、40min、50min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-7所示，在樣品質(zhì)量為1g，采用的溶劑為含量90%的乙醇，料液比為1:30的條件下，回流時(shí)間為40min的條件下得到的提取率為最佳。圖3-7回流時(shí)間對提取率影響3.3.2超聲波提取法3.3.2.1乙醇含量本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種采用不同含量乙醇的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，分別是：70%、80%、90%、100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-8所示，在樣品質(zhì)量為0.25g，提取時(shí)間為30min，料液比為1比20，功率為200W的條件下，乙醇含量為90%的條件下得到的提取率為最佳。圖3-8乙醇含量對提取率影響3.3.2.2料液比本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種不同比例下的料液比進(jìn)行了考察，分別是：1:10、1:20、1:30、1:40，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，在樣品質(zhì)量為0.25g，提取時(shí)間為30min，采用溶劑為含量90%的乙醇，功率為200W的條件下，料液比1:30條件下得到的提取率為最佳。圖3-9料液比對提取率影響3.3.2.3超聲時(shí)間本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四組不同的回流時(shí)間進(jìn)行了考察，分別是：20min、30min、40min、50min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-10所示，在樣品質(zhì)量為0.25g，溶劑乙醇含量為90%，料液比為1:20，功率為200W的條件下，回流時(shí)間為40min的條件下得到的提取率為最佳。圖3-10超聲時(shí)間對提取率影響3.3.2.4超聲功率本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四組不同功率的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，分別是：100W、200W、300W、400W，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-11所示，在樣品質(zhì)量為0.25g，溶劑為含量90%的乙醇，料液比為1:30，提取時(shí)間為40min的條件下，功率為300W的條件下得到的提取率為最佳。圖3-11超聲功率對提取率影響3.3.3微波提取法3.3.3.1乙醇含量本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種采用不同含量乙醇的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，分別是：70%、80%、90%、100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，在樣品質(zhì)量為1g，提取時(shí)間為60s，料液比為1:20，功率為140W的條件下，乙醇含量為90%的條件下得到的提取率為最佳。圖3-11乙醇含量對提取率影響3.3.3.2料液比本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四種不同比例下的料液比進(jìn)行了考察，分別是：1:10、1:20、1:30、1:40，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-12所示，在樣品質(zhì)量為1g，提取時(shí)間為60s，溶劑為含量90%的乙醇，功率為140W的條件下，料液比1:30條件下得到的提取率為最佳。圖3-12料液比對提取率影響3.3.3.3時(shí)間本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四組不同的回流時(shí)間進(jìn)行了考察，分別是：50s、60s、70s、80s實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-13所示，在樣品質(zhì)量為1g，溶劑為含量90%的乙醇，料液比為1:30，功率140W的條件下，提取時(shí)間為70s的條件下得到的提取率為最佳。圖3-13微波時(shí)間對提取率影響3.3.3.4功率本實(shí)驗(yàn)設(shè)置單因素變量對四組不同功率的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，分別是：140W、210W、280W、350W，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-14所示，在樣品質(zhì)量為1g，溶劑乙醇的含量為90%，料液比為1:30，時(shí)間70s的條件下，功率為280W的條件下得到的提取率為最佳。圖3-14功率對提取率影響3.3.4結(jié)論本論文用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了回流提取法、超聲輔助提取法、微波提取法對五味子中木脂素類化合物的提取效果。采用紫外分光光度計(jì)測定實(shí)驗(yàn)組吸光度，最后經(jīng)過實(shí)驗(yàn)計(jì)算整理結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在一定條件下，超聲波輔助提取法所測得的木脂素類化合物的提取率為5.1%，回流提取法為2.7%，微波提取法為4.6%，高于其它兩種方法，確定最佳提取方法為超聲輔助提取法，最佳提取條件為溶劑為含量90%的乙醇，料液比為1:30的條件下，功率為300W的條件下得到的提取率為最佳。圖3-15三種提取方法提取率比較

致謝星轉(zhuǎn)流逝，大學(xué)之旅依然接近尾期，回首歷途感激萬言。首先感謝本論文的指導(dǎo)老師：尊敬的解聳林老師，這篇論文是在您的關(guān)懷和無微不至的指導(dǎo)和教誨下得以完成的。感謝您從論文的選題、中、外文文獻(xiàn)的翻譯和查閱、以及實(shí)驗(yàn)方案的制定、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析、論文的思路設(shè)立、最終定稿，給予的指導(dǎo)和無私的幫助。為了使我的畢業(yè)論文更加縝密，他放棄了自己的休息時(shí)間，教案燈下的背影深深讓我感動(dòng)，為人師表誨人不倦。這種無私奉獻(xiàn)的敬業(yè)精神令人欽佩，在此我謹(jǐn)向解聳林老師致以最衷心的感謝和最誠摯的敬意！同時(shí)我也要感謝王志兵老師，在我實(shí)驗(yàn)階段給與的大力支持和幫助，我在實(shí)驗(yàn)中遇到的問題是您對我進(jìn)行細(xì)心的指導(dǎo)和講解。您認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神和深厚的理論水平都使我肅然起敬。其次我要感謝專業(yè)課程的老師們是他們讓我掌握專業(yè)課知識，提高了我面對困難的從容和解決問題的能力。祝愿老師們在未來的工作學(xué)習(xí)中意氣風(fēng)發(fā)桃李茂盛！最后，特別感謝我的同學(xué)和家人，你們是我前行的燈塔，沒有您們的鼓勵(lì)和支持真不知道怎樣克服那些惱人的困惑和晦暗的心情，正因?yàn)橛心銈兊牡姆龀郑С治夷軌蛳蛑硐電^進(jìn)，您們是我明燈是我的后盾。沒有您們，就不會(huì)有今天的我！在此向您們表示我深深的謝意!再次感謝母校，感謝那里的親人們，人生的旅途有您們真好?。。?！

參考文獻(xiàn)李坦城,安麗萍,滕昊林,etal.五味子提取物的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2014(19):80-82.于曉禮,張靜,胡秀麗,等.五味子優(yōu)良品種優(yōu)選的模式識別方法[J].應(yīng)用化學(xué),2013,30(6):723-729.HANCKE

J.L,BURGOS

R.A,AHUMADA

F.Schisandrachinensis(Turcz.)Baill[J].藥物分析學(xué)報(bào)：英文版,2012(4):240-240.程振玉,楊英杰.五味子木脂素提取工藝研究新進(jìn)展[J].吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào),2013,30(1):18-23.杜韌強(qiáng),張淑華,楊忠友.五味子生長習(xí)性與修剪[J].農(nóng)村科學(xué)實(shí)驗(yàn),2007(5):11-11.付先軍.中藥歸經(jīng)（肺經(jīng)）理論和肺系方劑配伍規(guī)律的解析及在海洋中藥研發(fā)中的應(yīng)用[D].中國海洋大學(xué),2009.谷艷菲，閆伯前，丁軻，等.五味子木脂素的功能性及其提取鑒定[J].中國野生植物資源，2013,32(5)：1-6.趙婷.五味子多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其活性研究[D].江蘇大學(xué).2009.舒永志,成亮,楊培明.黑老虎的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2011,42(4).ConstantS,BassetC,DumasC,etal.Reactiveorganosolvligninextractionf