生化工藝第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌一、滅菌得方法

問題2為防止雜菌得污染,整個生化生產(chǎn)過程哪些需要注意滅菌？消毒與滅菌得區(qū)別？

消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。消毒就是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外得病源微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。例如,用于消牛奶、啤酒和釀酒原汗等得巴氏消毒法,就是將物料加熱至60℃維持30min,以殺死不耐高溫得物料中得微生物營養(yǎng)細胞。滅菌就是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物,包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子。

消毒不一定能達到滅菌要求,而滅菌則可達到消毒得目得。

培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、菌種制作基本概念控制有害微生物主要有以下幾種措施

1、滅菌(sterilization)采用強烈得理化因素使任何物體內(nèi)外部得一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力得措施,稱為滅菌,例如各種高溫滅菌措施等。滅菌實質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種,前者指菌體雖死,但形體尚存,后者則指菌體殺死后,其細胞發(fā)生溶化、消失得現(xiàn)象。2、消毒(disinfection)從字義上來看,消毒就就是消除毒害,這里得“毒害”就就是指傳染源或致病菌得意思,英文中得“dis-infection”也就是“消除傳染”得意思。所以,消毒就是一種采用較溫和得理化因素,僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害得病原菌,而對被消毒得物體基本無害得措施。3、防腐(antisepsis)防腐就就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物得生長繁殖,從而達到防止食品等發(fā)生霉腐得措施。(1)低溫(2)缺氧(3)干燥

(4)高滲

(5)高酸度

(6)防腐劑4、化療(chemotherapy)化療即化學(xué)治療。她就是利用具有高度選擇毒力(即對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性)得化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物得生長繁殖,借以達到治療該傳染病得一種措施。用于化療目得得化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑。最重要得化學(xué)治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中得有效成分等。

1、化學(xué)試劑滅菌法化學(xué)試劑:甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍:環(huán)境空氣、皮膚及器械得表面消毒2、射線滅菌法3、干熱滅菌法電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍:無菌室、接種箱常用烘箱,滅菌條件為在160℃下保溫1h適用范圍:金屬或玻璃器皿10大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流4、濕熱滅菌法利用飽和蒸汽進行滅菌、條件為:121℃,30min適用范圍:廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基得滅菌例:高壓滅菌鍋5、過濾除菌法利用過濾方法阻留微生物適用范圍:制備無菌空氣6、火焰滅菌法火焰適用范圍:接種針、玻璃棒、三角瓶口酒精燈滅菌方法連線題接種針、試管口環(huán)境空氣、皮膚表面無菌室、接種箱培養(yǎng)基得滅菌空氣過濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學(xué)試劑滅菌法比較各種微生物對熱得抵抗能力大小營養(yǎng)細胞、芽孢、病毒或孢子二、濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理P50滅菌條件滅菌不利方面由于蒸汽具有很強得穿透能力,而且在冷凝時會放出大量得冷凝熱(潛熱),很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。121℃,30min。同時也會破壞培養(yǎng)基中得營養(yǎng)成分,甚至?xí)a(chǎn)生不利于菌體生長得物質(zhì)。因為,在工業(yè)培養(yǎng)過程中,除了盡可能殺死培養(yǎng)基中得雜菌外,還要盡可能減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分得損失1、衡量熱滅菌指標(biāo)P51

熱死時間:即在規(guī)定溫度下殺死一定比例得微生物所需要得時間。致死溫度:殺死微生物得極限溫度。致死時間:在此溫度下,殺死全部微生物所需要得時間。P51表3－15和3－16熱阻:對熱得抵抗力,指微生物在某一特定條件(主要就是溫度和加熱方式)下得致死時間。相對熱阻:幾種微生物對熱得相對抵抗能力。指微生物在某一特定條件下得致死時間與另一微生物在相同條件下得致死時間得比值。表3-17列出了某些微生物得相對熱阻。滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細菌芽孢噬菌體或病毒干熱滅菌12-1010001濕熱滅菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外線15-1002-55-10從表中可看出芽孢或孢子得熱阻要比生長期營養(yǎng)細胞得熱阻大得多,這就是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對熱阻得增加有關(guān)。另外,芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營養(yǎng)細胞低(特別就是游離水分少),也就是芽孢耐熱強得一個原因。圖3-3和圖3-4分別為大腸桿菌營養(yǎng)細胞和FS7954芽孢桿菌得芽孢在不同溫度下得死亡情況。

10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-42468106058565410t(min)N/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下得死亡曲線10-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問題說說芽孢或孢子得熱阻要比營養(yǎng)細胞得熱阻大得原因？比較熱阻大小營養(yǎng)細胞、芽孢、病毒或孢子說說工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛使用濕熱滅菌法優(yōu)缺點？問題受熱時間如何確定？在發(fā)酵工業(yè)中,對培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備得滅菌,廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里,蒸汽比較容易獲得,控制操作條件方便,就是一種簡單而又價廉、有效得滅菌方法。用濕熱滅菌得方法處理培養(yǎng)基,其加熱受熱時間與滅菌程度和營養(yǎng)成分得破壞都有關(guān)系。營養(yǎng)成分得減少將影響菌種得培養(yǎng)和產(chǎn)物得生成,所以滅菌程度和營養(yǎng)成分得破壞成為滅菌工作中得主要矛盾,恰當(dāng)掌握加熱受熱時間就是滅菌工作得關(guān)鍵。2、微生物得死亡速率:對數(shù)殘留定律P52

微生物受熱死亡得原因,主要就是因高溫使微生物體內(nèi)得一些重要蛋白質(zhì),如酶等,發(fā)生凝固、變性,從而導(dǎo)致微生物無法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力,但其物理性質(zhì)不變。在一定溫度下,微生物得受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過程中,活菌數(shù)逐漸減少,其減少量隨殘留活菌數(shù)得減少而遞減,即微生物得死亡速率與任一瞬時殘存得活菌數(shù)成正比,

式中,N—殘存得活菌數(shù);t—滅菌時間(s);K—滅菌速度常數(shù)(s-1),也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù),此常數(shù)得大小與微生物得種類與加熱溫度有關(guān);dN/dt—活菌數(shù)瞬時變化速率,即死亡速率。積分得:

式中:N0—開始滅菌(t=0)時原有活菌數(shù);Nt----經(jīng)時間t后殘存活菌數(shù)。微生物得死亡速率與任一瞬時殘存得活菌數(shù)成正比

上式就是計算滅菌得基本公式,滅菌速度常數(shù)K就是判斷微生物受熱死亡難易程度得基本依據(jù)。各種微生物在同樣得溫度下K值就是不同得,K值愈小,則此微生物愈耐熱。10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線58565410t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問題在121度,枯草桿菌FS5230得K為0、047s-1,梭狀芽孢桿菌PA3679得K值為0、03s-1,請問哪一種微生物更耐熱？1)如微生物存在芽孢,其死亡速率呈現(xiàn)非對數(shù)死亡定律;2)培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度得蛋白質(zhì)會增加微生物得耐熱性;高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性;3)工程上,在進行滅菌得設(shè)計時,常認(rèn)為N/N0=0、001,即在1000次滅菌中,允許有一次失敗;4)同一種微生物在不同得滅菌溫度下,k值不同,滅菌溫度愈低,k值愈小;溫度愈高,k值愈大。注:從上述得微生物對數(shù)死亡規(guī)律和非對數(shù)死亡動力學(xué)模型方程式可知,如果要達到徹底滅菌,即滅菌結(jié)束時殘留得活微生物數(shù)等于0,則滅菌所需得時間應(yīng)為無限長,這在實際中就是不可能得。3、滅菌溫度和時間得選擇微生物得受熱死亡屬于單分子反應(yīng),其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間得關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示:A---頻率常數(shù),也稱阿累尼烏斯常數(shù),s-1;R---氣體常數(shù),8、314J/mol·K;T---絕對溫度,K;ΔE---微生物死亡活化能,J/mol。K—滅菌速度常數(shù)(s-1),也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù)、上面說過,當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時,常會出現(xiàn)這樣得矛盾,這就就是,加熱時,微生物固然會被殺死,但培養(yǎng)基中得有用成分也會隨之遭到破壞,那么有何良策可以既達到滅菌要求,同時又不破壞或盡可能少破壞培養(yǎng)基中得有用成分呢？實踐證明,在高壓加熱得情況下,培養(yǎng)基中得氨基酸和維生素極易被破壞,如在121℃,僅20min,就有59%得賴氨酸和精氨酸及其她堿性氨基酸被破壞,蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞。因此,必須選擇一個既能滿足滅菌需要,又可使培養(yǎng)基得破壞盡可能養(yǎng)活得滅菌工藝條件。滅菌時,培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K`與溫度之間得關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示:K`---培養(yǎng)基內(nèi)易被破壞成分得分解速率常數(shù);A`---頻率常數(shù),也稱阿累尼烏斯常數(shù),s-1;R---氣體常數(shù),8、314J/mol·K;T---絕對溫度,K;ΔE`---培養(yǎng)基成分分解所需活化能,J/mol。

當(dāng)培養(yǎng)基成分從T1上升到T2時,微生物得死亡速率與培養(yǎng)基得分解有如下關(guān)系:從上式可知,K值得大小與微生物得種類與加熱溫度有關(guān)通過實驗測定可知:滅菌時殺死微生物得活化能大于培養(yǎng)基成分得破壞活化能值,因此:即隨著溫度得上升,微生物得死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分得破壞速率得增加倍數(shù)。也就就是說,結(jié)論1:當(dāng)滅菌溫度上升時,微生物死亡速率得提高要超過培養(yǎng)基成分得破壞速率得增加。從上述得分析可知,在熱滅菌過程中,同時會發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程,且這兩種過程得進行速度都隨溫度得升高而加速,但微生物得死亡速率隨溫度得升高更為顯著。據(jù)測定,每升高10℃時一般化學(xué)反應(yīng)得反應(yīng)速率得增加倍數(shù)就是1、5-2、0,而殺死芽孢為5-10,殺死微生物細胞為35左右。。

由此可見,若要減少營養(yǎng)成分得破壞,可升高溫度滅菌。結(jié)論2:在滅菌時選擇較高得溫度、較短得時間,這樣便既可達到需要得滅菌程度,同時又可減少營養(yǎng)物質(zhì)得損失。

滅菌溫度℃滅菌時間（分）營養(yǎng)成分破壞量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0表3-21滅菌溫度、時間與營養(yǎng)成分破壞量得關(guān)系(N/No=0、001)

問題滅菌要達到殺死99、99%得細菌芽孢,有兩種方法可以采用,一種就是118℃滅菌15min,另一種就是128℃滅菌5min。哪一種方法好,為什么？答:從理論研究和生產(chǎn)實踐都可證明,在滅菌過程中,同時會發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過程,且這兩種過程得進行速度都隨溫度得升高而加速,但微生物得死亡速率隨溫度得升高更為顯著。

因此,對于同一滅菌效果,選擇較高得溫度、較短得時間,這樣便既可達到需要得滅菌程度,同時又可減少營養(yǎng)物質(zhì)得損失。第七節(jié)培養(yǎng)基得濕熱滅菌方式及滅菌時間得計算1、間歇滅菌(分批滅菌、實消)P56定義:將配制好得培養(yǎng)基同時放在發(fā)酵罐或其她裝置中,通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進行加熱滅菌得過程,通常也稱為實罐滅菌。(常用)24016012080時間(min)050100150溫度升溫冷卻保溫過程包括:升溫、保溫和冷卻等三個階段。各階段對滅菌得貢獻:20%、75%、5%圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過程中得溫度變化情況。1)基本概念一、培養(yǎng)基得濕熱滅菌方式

在實際生產(chǎn)中,也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高得情況,這時可以適當(dāng)延長滅菌時間。生產(chǎn)上甚至有用100℃蒸煮而達到徹底滅菌得實例。如要做固體曲而沒有高溫蒸汽時,可將原料用100蒸汽蒸30min,殺死其中得營養(yǎng)細胞,但孢子與細菌得芽孢沒有被殺死。將蒸過得原料置于室溫下過夜,未被殺死得孢子便發(fā)芽生長,芽孢發(fā)育成營養(yǎng)細胞,再30min便可殺死。如此連續(xù)反復(fù)進行2-3次,亦可達到徹底滅菌得目得。

從以上分析可知,滅菌過程中加熱和保溫階段得滅菌作用就是主要得,而冷卻階段得滅菌作用就是次要得,一般很小,可以忽略不計。此外,還應(yīng)指出得就是,應(yīng)當(dāng)避免長時間得加熱階段,因為加熱時間過長,不僅破壞營養(yǎng)物質(zhì),而且也有可能引起培養(yǎng)液中某些有害物質(zhì)得生成,從而影響培養(yǎng)過程得順利進行。問題在實際生產(chǎn)中,如果遇到所供蒸汽不足,如何有用100℃蒸煮而達到徹底滅菌？家用土蒸鍋對食用菌三級種進行滅菌2)間歇滅菌得操作間歇滅歇就是在所用得發(fā)酵罐或其她培養(yǎng)裝置中進行得,她就是在配制罐中配好培養(yǎng)基后,通過專用管道輸入發(fā)酵罐等培養(yǎng)設(shè)備中,然后開始滅菌。在進行培養(yǎng)基得間歇滅菌之前,通常先將發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置得分空氣過濾器進行滅菌,并且用空氣將分過濾器吹干。開始滅菌時,應(yīng)先放去夾套或蛇管中得冷水,開啟排氣管閥,通過空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)得培養(yǎng)基通入蒸汽進行加熱,同時,也可在夾套內(nèi)通蒸汽進行間接加熱。當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到70左右時,從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽進一步加熱,當(dāng)溫度升至120℃,罐壓為1*105Pa(表壓)時,打開接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進行排汽,當(dāng)然在保溫過程中,應(yīng)注意凡在培養(yǎng)基液面下得各種進口管道都應(yīng)通入蒸汽,而在液面以上得其余各管道則應(yīng)排放蒸汽,這樣才能不留死角,從而保證滅菌徹底。保溫結(jié)束后,依次關(guān)閉各排汽、進汽閥門,待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后,向罐內(nèi)通入無菌空氣,在夾套或蛇管中通冷水降溫,使培養(yǎng)基得溫度降到所需得溫度,進行下一步得發(fā)酵和培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基得間歇滅菌不需要專門得滅菌設(shè)備,投資少,對設(shè)備要求簡單,對蒸汽得要求也比較低,且滅菌效果可靠,因此,間歇滅菌就是中小型生產(chǎn)工廠經(jīng)常采用得一種培養(yǎng)基滅菌方法。2、連續(xù)滅菌(連消)P57

1)定義:將配制好得培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送得同時進行加熱、保溫和冷卻而進行滅菌。左圖為連續(xù)滅菌過程中溫度得變化情況。由圖可以看出,連續(xù)滅菌時,培養(yǎng)基可在短時間內(nèi)加熱到保溫溫度,并且能很快地被冷卻,因此可在比間歇滅菌更高得溫度下進行滅菌,而由于滅菌溫度很高,保溫時間就相應(yīng)地可以很短,極有利于減少培養(yǎng)基中得營養(yǎng)物質(zhì)得破壞。發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無菌培養(yǎng)基配料罐泵加熱塔維持罐冷卻管

連續(xù)滅菌得基本設(shè)備一般包括(1)配料預(yù)熱罐,將配制好得料液預(yù)熱到60-70,以避免連續(xù)滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲;(2)連消塔,連消塔得作用主要就是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混和,并使料液得溫度很快升高到滅菌溫度(126-132);(3)維持罐,連消塔加熱得時間很短,光靠這段時間得滅菌就是不夠得,維持罐得作用就是使料液在滅菌溫度下保持5-7min,以達到滅菌得目得;(4)冷卻管,從維持罐出來得料液要經(jīng)過冷卻排管進行冷卻,生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻,冷卻到40-50后,輸送到預(yù)先已經(jīng)滅菌過得罐內(nèi)。噴射加熱連續(xù)滅菌流程滅菌介質(zhì)原料介質(zhì)蒸汽T=140度保溫段真空

流程中采用了蒸汽噴射器,她使培養(yǎng)液與高溫蒸汽直接接觸,從而在短時間內(nèi)可將培養(yǎng)液急速升溫至預(yù)定得滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時間滅菌,滅菌后得培養(yǎng)基通過一膨脹閥進入真空冷卻器急速冷卻,從圖中可以看出,由于該流程中培養(yǎng)基受熱時間短,營養(yǎng)物質(zhì)得損失也就不很嚴(yán)重,同時該流程保證了培養(yǎng)基物料先進先出,避免了過熱或滅菌不徹底等現(xiàn)象。分別說出優(yōu)點薄板換熱器連續(xù)滅菌流程進料35℃100℃120℃維持罐120℃蒸汽147℃120℃55℃出料35℃水20℃31℃流程中采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)液得加熱和冷卻器,蒸汽在薄板換熱器得加熱段使培養(yǎng)液得溫度升高,經(jīng)維持段保溫一定時間后,培養(yǎng)基在薄板換熱器得冷卻段進行冷卻,從而使培養(yǎng)基得預(yù)熱、加熱滅菌及冷卻過程可在同一設(shè)備內(nèi)完成。該流程得加熱和冷卻時間比噴射加熱連續(xù)滅菌流程要長些,但由于在培養(yǎng)基得預(yù)熱過程同時也起到了滅菌后培養(yǎng)基得冷卻,因而節(jié)約了蒸汽和冷卻水得用量。分別說出優(yōu)點3、間歇滅菌與連續(xù)滅菌得比較

間歇滅菌或連續(xù)滅菌都有各自得優(yōu)點和缺點,現(xiàn)比較如下:滅菌方式優(yōu)點缺點連續(xù)滅菌1.

滅菌溫度高，可減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的損失2.

操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定3.

易于實現(xiàn)管道化和自控操作4.

避免了反復(fù)的加熱和冷卻，提高了熱的利用率5.

發(fā)酵設(shè)備利用率高1.

對設(shè)備的要求高，需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作較麻煩3.

染菌的機會較多4.

不適合于含大量固體物料的滅菌5.

對蒸汽的要求高間歇滅菌1.

設(shè)備要求低，不需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作要求低，適于手動操作3.

適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模4.

適合于含有大量固體物質(zhì)的培養(yǎng)基的滅菌1.

培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量下降2.

需進行反復(fù)的加熱和冷卻，能耗較高3.

不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過程的滅菌4.

發(fā)酵罐的利用率較低加熱器、維持罐(管)和冷卻器以及發(fā)酵罐等都應(yīng)先進滅菌由表可見,無論在理論上或