ICS65.020.30CCSB4341IDB41/T2273—2022前言 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14同期發(fā)情和人工授精 15胚胎生產與移植 26妊娠牛飼養(yǎng)管理 5附錄A （資料性）供體牛信息記錄表及胚胎冷凍記錄表樣式6 7附錄C（資料性）受體牛胚胎移植記錄表 8DB41/T2273—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由河南省農業(yè)農村廳提出并歸口。本文件起草單位：河南省畜牧總站、河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：張子敬、劉賢、呂世杰、王二耀、茹寶瑞、李志明、王李輝、吳勝軍、蔡雯雯、施巧婷、郎利敏、黃輝、夏宗軍、丁涵、徐美芳、趙楊楊、馬超峰、辛曉玲、于翔、王獻偉、馬文濤、李靜、王培育、朱肖亭、楚秋霞、付泰、王歐陽、余亞飛、李惠、劉艷麗、蔡順姬、余洪濤、周應海、黃永震、徐照學。DB41/T2273—20221肉牛快速擴繁技術規(guī)程本文件規(guī)定了肉?？焖贁U繁中同期發(fā)情、超數排卵、胚胎移植等要求和方法。本文件適用于規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖的快速擴繁。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4143牛冷凍精液NY/T1335牛人工授精技術規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1供體牛提供胚胎的母牛。3.2受體牛接受胚胎的母牛。3.3同期發(fā)情利用外源激素控制并調整母牛群體發(fā)情周期進程，使其在規(guī)定時間內集中發(fā)情。3.4超數排卵利用外源激素誘發(fā)母牛卵巢多個卵泡發(fā)育，并同時排出多個具有受精能力的卵子。3.5人工授精借助專門器械將公牛精液輸入發(fā)情母牛的生殖道內使其受孕的過程。3.6胚胎移植將供體牛體內或其它方式獲得的早期胚胎，移植到對應生殖周期的受體牛體內，使之繼續(xù)發(fā)育的生物技術。4同期發(fā)情和人工授精DB41/T2273—202224.1同期發(fā)情方法4.1.1二次前列腺素（PG）法適配母牛任選一天肌肉注射PG，9d～13d進行第二次注射，24h～72h觀察發(fā)情。4.1.2黃體酮緩釋陰道栓法適配母牛任選一天放入黃體酮緩釋陰道栓，5d～7d撤栓并注射PG，24h～72h觀察發(fā)情。4.2人工授精冷凍精液應符合GB/T4143的要求。人工授精操作按照NY/T1335的規(guī)定。5胚胎生產與移植5.1供體牛選擇與飼養(yǎng)管理5.1.1供體牛選擇品種優(yōu)良，系譜清晰，體型外貌和生產性能評級一級以上，生殖器官正常，無繁殖障礙疾病。年齡15月齡至8周歲。青年牛應為15月齡～18月齡，體況中上等且至少有兩次正常發(fā)情記錄；經產牛應為產后60d以上，有兩次正常發(fā)情記錄且子宮恢復正常。確定為供體牛前應進行檢疫，有傳染性疾病的母牛不能作為供體。5.1.2供體牛飼養(yǎng)管理保持飼養(yǎng)環(huán)境良好，避免應激反應。提供合理的配合日糧和清潔飲水。超數排卵前3周加強飼養(yǎng)管理，補充維生素和微量元素，保持中等以上膘情。5.2供體牛超數排卵及人工授精5.2.1超數排卵5.2.1.1同期發(fā)情方法準備工作完成后，同期發(fā)情方法按照4.1的規(guī)定。5.2.1.2超數排卵方法以母牛發(fā)情當天為0d，第9d～13d中的任意一天開始，每天早（7:00～8:00）和晚（19:00～20:00）各注射1次促卵泡素（FSH連續(xù)4d遞減注射。注射FSH期間第3d晚和第4d早同時注射0.4mg～0.6mgPG。超數排卵藥品使用根據不同生產廠家的推薦量結合體重稍作調整。5.2.1.3供體牛發(fā)情鑒定最后一次注射FSH后，每隔6h觀察是否發(fā)情，每次觀察不少于30min。以母牛被跨穩(wěn)定作為發(fā)情標準，準確記錄時間。5.2.2人工授精精液劑量加倍，按照4.1.2規(guī)定操作，間隔12h重復操作一次。5.3非手術沖胚及胚胎質量鑒定DB41/T2273—202235.3.1沖胚步驟5.3.1.1供體牛人工授精后6d～7d沖胚。沖胚前，所用儀器、器皿等應經過嚴格的消毒滅菌處理。沖胚管應檢查氣囊是否漏氣。5.3.1.2將供體牛保定，清除糞便，在薦椎和第一尾椎結合處或第一尾椎和第二尾椎結合處注射普魯卡因實行硬膜外麻醉，直至尾巴松弛柔軟無張力。普魯卡因用量依據說明書。5.3.1.3麻醉后將牛尾固定，清潔會陰部及外陰，酒精棉球或噴霧消毒外陰，用滅菌衛(wèi)生紙擦干。5.3.1.4用擴張棒擴張子宮頸，再用黏液棒抽出黏液。5.3.1.5此時直腸易進空氣形成空洞，使用抽氣筒排出空氣，利于直腸把握。5.3.1.6沖胚管裝配內芯，并用沖胚液潤滑，慢慢插入一側子宮角，當沖胚管到達子宮角大彎處，旋開內芯旋鈕，拔出內芯5cm左右，握緊內芯和沖胚管并向前推進，使內芯再次到達子宮角大彎處。重復內芯拔出和一體前進1～3次。給沖胚管氣囊充氣5mL確定沖胚管到達子宮角前端。沖胚液可用杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）或商用沖胚液。5.3.1.7給沖胚管氣囊充氣約8mL～14mL，抽出內芯，把三通管與沖胚管連接，連上集卵濾皿。5.3.1.8夾住三通管的回流端，將20mL～30mL沖胚液通過注入端注入子宮角。夾住注入端，松開回流端使子宮角液體回流到集卵濾皿。重復幾次，每次增加沖胚液5mL～10mL，每個子宮角總用量400mL~500mL。5.3.1.9完成后排出氣囊空氣，另一側子宮進行相同操作。抽出沖胚管，使前端位于子宮體，灌注抗生素，肌注PG，做好采胚記錄（見表A.1）。5.3.2胚胎質量鑒定5.3.2.1搜集胚胎集卵濾皿放在40～100倍體視顯微鏡下，逐格檢查，撿出的胚胎用培養(yǎng)液清洗3次，放入蓋有礦物油的培養(yǎng)液中35℃~37℃暫存，撿胚完成后進行等級鑒定。培養(yǎng)液可用10%牛血清M199或其它商用培養(yǎng)液。5.3.2.2胚胎發(fā)育期此時胚胎處于以下發(fā)育期：桑椹胚(M)、致密桑椹胚(CM)、囊胚(B)、擴張囊胚(EXB)。胚胎發(fā)育形態(tài)圖見附錄B。5.3.2.3胚胎質量等級鑒定根據胚胎形態(tài)將胚胎依次分為A、B、C、D四級。A級：優(yōu)秀胚。胚胎整體邊緣輪廓清晰，透明帶完整光滑，立體結構明顯，實質均勻，透明度適中，碎片量少于10%或者沒有，胚胎的發(fā)育階段與預期的發(fā)育階段一致。B級：良好胚。胚胎整體邊緣輪廓清晰，立體結構明顯，碎片小于20%，透明度稍暗或稍淺。C級：一般胚。輪廓不清晰，透明度過暗或過淡，碎片化超過30%～40%。D級：不可用胚。未受精的卵子、16細胞以下和碎片化率50%以上的受精卵。5.4胚胎冷凍保存及解凍5.4.1胚胎冷凍與保存5.4.1.1胚胎清洗A級、B級胚胎在保持液中清洗4～6次。保持液使用商用保持液。DB41/T2273—202245.4.1.2胚胎平衡胚胎用冷凍液清洗4～6次，室溫下平衡5min。冷凍液使用乙二醇商用冷凍液。5.4.1.3胚胎裝管將平衡后的胚胎裝入0.25mL細管，裝管順序見圖1。圖1胚胎裝管圖裝管后做好胚胎情況標記，內容包括：生產日期、母牛號、公牛號、數量、發(fā)育期、質量。5.4.1.4胚胎冷凍冷凍儀降溫至-6℃,放入裝有胚胎的細管平衡5min，用液氮冷凍后的鑷子輕觸細管植冰，繼續(xù)平衡5min，以0.6℃/min的速率下降至-35℃,平衡5min后投入液氮，記錄冷凍情況（見表A.2）。5.4.2胚胎解凍取出裝有胚胎的細管，空氣中停留5s～10s后，迅速放入35℃~37℃水浴45s。擦干細管，拔出細管塞，裝入移植槍并移植。5.5受體牛選擇及飼養(yǎng)管理5.5.1受體牛選擇骨盆較寬，體型勻稱，體高130cm以上，乳房發(fā)育良好，性情溫順，營養(yǎng)良好，中等膘情。青年牛體重達到成年母牛體重的75%；經產牛3胎以下，應有兩個以上連續(xù)的正常發(fā)情周期，泌乳性能、產犢性能良好，無連續(xù)兩次人工授精未孕記錄。牛體健康，子宮彈性、厚薄正常，卵巢發(fā)育正常。5.5.2受體牛飼養(yǎng)管理單獨分群、編號、飼養(yǎng)，保持環(huán)境良好，避免應激反應，保證必要運動，滿足營養(yǎng)需要。移植前6~8周開始補飼，日增重應保持在0.3kg～0.4kg。移植前5周補充維生素A、維生素D、維生素E及硒、鋅等微量元素。5.6胚胎移植5.6.1受體牛同期發(fā)情DB41/T2273—20225按照4.1的規(guī)定。5.6.2受體牛發(fā)情鑒定5.6.3受體牛胚胎移植方法5.6.3.1以發(fā)情當天定為0d，于7d～8d進行移植。移植前對受體牛進行直腸檢査，黃體達到A級的母牛用于移植。5.6.3.2受體牛麻醉，按照5.3.1.2的規(guī)定。5.6.3.3清洗消毒外陰部并擦干。對照胚胎記錄表和受體牛發(fā)情記錄，胚胎發(fā)育期與受體牛生理時間相對應：桑椹胚、致密桑椹胚、囊胚對應受體牛發(fā)情后7d；擴張囊胚對應受體牛發(fā)情后8d。5.6.3.4裝好胚胎的移植槍套上硬外套管，再套上無菌外套膜。于子宮頸口撕破外套膜，使移植槍前段到達黃體側子宮角前端，注入胚胎。5.6.3.5做好移植記錄。胚胎移植記錄表見附錄C。6妊娠牛飼養(yǎng)管理人工授精或移植后30d～60d進行妊娠檢查，對妊娠牛加強護理，防止應激。產前2個月適當限制能量攝入，保持適量運動，同時保證足量的維生素和微量元素。圍產期加強管理。分娩時做好護理，必要時助產或剖腹產。超出預產期10d的母牛應誘導分娩。DB41/T2273—20226供體牛信息記錄表及胚胎冷凍記