新疆維吾爾自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)馬鈴薯甲蟲抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范2011-03-10發(fā)布2011-04-10實施新疆維吾爾自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：姜衛(wèi)華、李國清、郭文超、吐爾遜.阿合買提、許建軍、何江。1DB65/T3240—2011馬鈴薯甲蟲抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范本規(guī)范規(guī)定的有關(guān)馬鈴薯甲蟲抗藥性監(jiān)測術(shù)語、定義、原理、儀器、用具、藥品及抗性測定方法，適用于馬鈴薯甲蟲的抗藥性監(jiān)測。本規(guī)范適用于馬鈴薯甲蟲發(fā)生區(qū)的抗藥性監(jiān)測。2.規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用時必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T8321農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB4285農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)3.術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1毒力(Toxicity)指藥劑本身對不同生物直接作用的性質(zhì)和程度。3.2致死中量(LD50)或致死中濃度(LC50)這些都是表示藥劑毒力程度的指標(biāo)。殺死一種昆蟲種群50%的個體所需要的劑量稱為致死中量(LD??),表示單位為μg/頭(μg/individual);殺死一種昆蟲種群50%的個體所需要的藥劑濃度稱為致死中濃度(LC?0)。表示單位為3.3毒力回歸線以測試試蟲死亡率機(jī)率值(Y)為縱坐標(biāo)，藥劑劑量對數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)的線性回歸方程，可以計算某種藥劑對測試對象的毒力。指昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力在其群體中發(fā)展起來的現(xiàn)象。某個昆蟲種群由于相同抗性機(jī)理或相似作用機(jī)制，對丁選擇藥劑以外的其它從未使用過2DB65/T3240—2011的一種藥劑或一類藥劑也產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象。3.6多種抗藥性(Multipleresistance)指某個昆蟲種群由于不同機(jī)制，對許多藥劑都產(chǎn)生抗藥性。3.7負(fù)交互抗性(Negativecrossresistance)指某個昆蟲種群對一種殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性后，反而對另一種殺蟲劑表現(xiàn)特別敏感的現(xiàn)3.8抗藥性監(jiān)測(Resistancemonitoring)指通過生物測定、解毒酶活性分析、靶標(biāo)敏感性測定或分子生物學(xué)等技術(shù)，確證昆蟲種群是否產(chǎn)生抗性，如果產(chǎn)生抗性，監(jiān)測抗性水平和變化動態(tài)。3.9發(fā)生區(qū)指馬鈴薯甲蟲發(fā)生分布的地區(qū)。3.10定點調(diào)查為便于比較年度間同一地區(qū)馬鈴薯甲蟲抗藥性的發(fā)展動態(tài)，確定相對固定的發(fā)生區(qū)監(jiān)測馬鈴薯甲蟲的抗藥性水平。4.儀器、用具及藥品4.1儀器、用具4.1.1Hamilton微量進(jìn)樣器；4.1.2塑料培養(yǎng)皿(直徑9cm);4.1.3Eppendorf管(2mL或1.5mL);4.1.4刻度移液管及吸耳球；4.1.5離心管架；4.1.6鑷子；4.1.7標(biāo)簽；4.1.8定性濾紙；4.1.9剪刀；4.1.10記號筆；4.1.11封口膜；4.1.12一次性手套；4.1.13膠帶：4.1.14毛筆；4.1.15皮筋；DB65/T3240—201134.1.17采蟲、養(yǎng)蟲器具(水桶等)。4.2藥品4.2.1殺蟲劑原藥或制劑；4.2.2丙酮；4.2.3Triton-100。5抗藥性監(jiān)測5.1監(jiān)測點的確定5.1.1設(shè)置原則監(jiān)測點的設(shè)置根據(jù)新疆北疆馬鈴薯甲蟲的發(fā)生分布區(qū)結(jié)合地理、行政分化區(qū)，在各個地州中選擇馬鈴薯甲蟲發(fā)生嚴(yán)重的代表性種植區(qū)。5.1.2監(jiān)測點的數(shù)量在新疆北疆馬鈴薯甲蟲發(fā)生區(qū)，以地州行政區(qū)劃為單位，每個地州選擇具有代表性馬鈴薯種植鄉(xiāng)鎮(zhèn)2～3個，每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)設(shè)置監(jiān)測點1個，每個監(jiān)測點面積不少于3333.35m2。5.2監(jiān)測時間馬鈴薯甲蟲的發(fā)生期，通常每年從5月份開始至10月份結(jié)束。5.3監(jiān)測方法5.3.1抗藥性水平的劃分5.3.1.1敏感品系和抗性品系5.3.1.1.1敏感品系敏感品系指對藥劑尚未產(chǎn)生抗性的昆蟲群體，可以經(jīng)實驗室培養(yǎng)和繁殖，也可從普遍未用過藥劑的農(nóng)田或滋生處采集。5.3.1.1.2抗性品系抗性品系指對藥劑已產(chǎn)生抗性的昆蟲種群，抗性的界定見5.3.1.4。5.3.1.2敏感基線是指某種藥劑對害蟲敏感品系毒力回歸線的測定，敏感基線是比較抗藥性有無和抗藥性水平高低的標(biāo)準(zhǔn)。5.3.1.3抗性水平的確定一般通過比較害蟲抗性品系和敏感品系的致死中量(致死中濃度)的倍數(shù)來確定。兩個品系對同一種藥劑的LD?o(LC?0)值的95%置信限完全不重迭時視為差異顯著。4DB65/T3240—2011RR——抗性倍數(shù)LD?0(FP)——田間種群的致死中量LD?o(SP)——敏感種群的致死中量5.3.1.4抗性水平具體劃分如下：a)敏感——抗性倍數(shù)為2倍以下；b)低水平抗性——抗性倍數(shù)為2~10倍；c)中等水平抗性——抗性倍數(shù)為10.1~30倍；d)高水平抗性——抗性倍數(shù)為30.1~100倍；e)極高水平抗性——抗性倍數(shù)為100倍以上。5.3.2定點監(jiān)測每個監(jiān)測點采用GPS定位定點調(diào)查取樣，對馬鈴薯甲蟲的抗藥性動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測。5.3.3測試對象5.3.3.1馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲選取日齡2d以上，大小、體重均勻、健康的個體作為測試對象。5.3.3.2馬鈴薯甲蟲成蟲可選取大于3日齡、鞘翅硬化、腹部飽滿、已經(jīng)充分取食的成蟲個體作為標(biāo)準(zhǔn)試蟲，不分雌雄。5.3.4試蟲的采集和飼養(yǎng)試蟲可通過田間采集或室內(nèi)飼養(yǎng)獲取。5.3.4.1田間采集監(jiān)測點的馬鈴薯甲蟲符合測試所需的蟲態(tài)(成蟲或4齡幼蟲)時，可直接進(jìn)行采集。田間試蟲足量，采用五點取樣法采集試蟲；田間蟲量較少時，可進(jìn)行全田采集。5.3.4.2室內(nèi)飼養(yǎng)若田間試蟲未達(dá)測定標(biāo)準(zhǔn)化要求時，可將田間低齡幼蟲或卵采集帶回室內(nèi)，放置于直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入新鮮馬鈴薯葉片，在溫度(25±1)℃、相對濕度50%-80%、光照16h條件下進(jìn)行飼養(yǎng)至所需蟲態(tài)。5DB65/T3240—20115.3.5供試藥劑在了解當(dāng)?shù)伛R鈴薯甲蟲防治用藥的背景的基礎(chǔ)上，選擇測試藥劑的原藥或制劑。5.3.6溶劑原藥由丙酮溶解配制成母液。對于不溶于丙酮的一些水溶性藥劑，如殺蟲雙、巴丹等，5.3.7藥劑配制5.3.7.1設(shè)定藥劑濃度范圍的預(yù)備試驗根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)或田間藥劑推薦使用量設(shè)計若干濃度，以設(shè)置3～5個濃度為宜，每個濃度選擇10～20個馬鈴薯甲蟲測試標(biāo)準(zhǔn)蟲態(tài)進(jìn)行預(yù)備生物測定試驗，直至獲取試蟲處理后死亡率在10%～90%的濃度范圍。5.3.7.2藥劑的正式配制原藥用丙酮溶解成母液，根據(jù)預(yù)備測試結(jié)果所得出的濃度范圍，等比例稀釋5～6個濃度。一般地，有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、新煙堿類及生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑以2倍比例稀釋，而擬除蟲菊酯類殺蟲劑以5倍比例稀釋。5.3.8測定方法測定方法為點滴法(Dropletapplication或Topicalapplication)。此方法是使用精密定量的微量點滴器，將藥劑0.05μL~1μL點滴于馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲或成蟲體上。點滴法能夠準(zhǔn)確控制所需要的藥劑容量。待丙酮揮發(fā)后，殺蟲藥劑便殘留在蟲體表皮上。這一方法的最大優(yōu)點是可以精確地計算出每頭幼蟲接觸的藥量，比浸漬法及噴霧法準(zhǔn)確。點滴馬鈴薯甲蟲時，每種藥劑5～6個濃度，每個濃度最少3次重復(fù)，每重復(fù)測定需蟲量10頭。5.3.9點滴部位對于馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲，選擇腹部背面第三、四節(jié)為點滴部位；對丁馬鈴薯甲蟲成蟲，選擇腹部腹面第二節(jié)為點滴部位。5.3.10點滴后的飼養(yǎng)馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲或成蟲處理后，10頭一組置于培養(yǎng)皿(直徑9cm)中，加入營養(yǎng)生長期至生殖生長前期的馬鈴薯新鮮葉片作食料。飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃、相對濕度50%～80%、光照16h。每24h更換一次馬鈴薯葉片。5.3.11檢查效果的時間馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲或成蟲處理后，有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯和有機(jī)氯類殺6蟲劑的致死效果24h后檢查，多殺菌素、阿維菌素、新煙堿類、昆蟲生長調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑的致死效果72h后檢查。5.3.12試蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)5.3.12.1馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)滿足以下其中一條即為死亡：a)蟲體變色、變軟、身體有黑褐色汁液流出者：b)用鑷子輕輕觸動背部數(shù)次后能移動，但行動遲緩者；c)翻轉(zhuǎn)蟲體足部抖動，但無行動能力者。5.3.12.2馬鈴薯甲蟲成蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)滿足以下其中一條即為死亡：a)蟲體變色、發(fā)黑、身體干癟者；b)趴著不動、用鑷子輕輕觸擊其前胸背板數(shù)次仍無自主反應(yīng)者；c)蟲體翻轉(zhuǎn)、四肢快速小幅抖動、不能自行翻身者。5.3.13數(shù)據(jù)處理5.3.13.1根據(jù)點滴器容積，計算各個濃度每頭幼蟲或成蟲的受藥量，單位以μg/頭計算。用Abbott公式求出校正死亡率：式中：M——校正死亡率；x——處理組死亡率；y——對照組死亡率這個公式根據(jù)假定對照死亡率與被藥劑處理而產(chǎn)生的處理死亡率彼此獨立，并且在對照死亡率小于20%時成立。“注：Abbott.1925”。5.3.13.2查機(jī)率值表，將校正死亡率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值(Probits),同時將劑量(μg/頭)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值。5.3.13.3以死亡率機(jī)率值(Y)為縱坐標(biāo)，劑量對數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)，求出毒力回歸線。5.3.13.4根據(jù)毒力回歸線計算出LD?0及其置信限。5.3.14抗性判斷抗藥性是否產(chǎn)生以及抗藥性的水平根據(jù)定義5.3.1.4判斷。7(資料性附錄)體長(11.25±0.93)mm,寬(6.33±每一鞘翅上具黑色縱條紋5條，第1與第3縱帶在尾部交會。頭下口式，橫寬，背方稍隆起，向前胸縮入達(dá)眼處。觸角11節(jié)，第1節(jié)粗而長，第2節(jié)很短，第5、6節(jié)約等長，第6節(jié)顯著寬于第5節(jié)，末節(jié)呈圓錐形?？谄骶捉朗?，上顎有3個明顯的齒，下顎須3節(jié)向端膨粗，向放寬，趾節(jié)顯4節(jié)，第4節(jié)極短，爪基部無附齒。雌雄兩性成蟲外形差異不大，雌蟲個體一般較大，雄蟲最末腹板比較隆起，具一縱凹線，雌蟲無上述凹線。(見圖1、圖2)頭寬(0.90±0.08)mm;3齡幼蟲體長(8.31±0.35)mm,頭寬(1.39±0.12)mm;4齡幼蟲體長(13.94±0.83)mm,頭寬(2.29±0.15)mm。體色1、2齡幼蟲暗褐色，3齡以后逐漸變?yōu)榉奂t色或橙黃色。頭部黑色，頭為下口式兩側(cè)各有6個疣狀小眼分成2組，上方4個，下方2個和1個3節(jié)的觸角，上唇半圓形，中間有缺刻。前胸明顯大于中胸和后胸，后緣有褐色寬帶。中胸和后胸各有3個斑點，每側(cè)各有1個，中間有2個。1齡幼蟲前胸背板骨片全側(cè)有兩行大的暗色骨片，即氣門骨片和上側(cè)骨片。腹節(jié)上的氣門骨片呈瘤狀突出，包圍氣門，起，以后各節(jié)急劇縮小，末端細(xì)尖。腹部共有9節(jié)，1-7節(jié)背面兩側(cè)各有2個斑點，上面的1個較大，位于氣門的周圍。腹部腹面有3行小斑點，斑點有密集的短剛毛組成。前胸背板及腹部第8、9節(jié)背部有黑色素斑。足黑褐色。(見圖3、圖4)為離蛹，體長(9.49±0.37)mm,寬(6.24±0.25)mm。黃色或桔黃色。體側(cè)各有一排黑色小斑點。橢圓形，頂部鈍尖。卵長體長(1.83±0.08)mm,寬(0.83±0.06)mm。橙黃色，少數(shù)為桔紅色。8DB65/T3240--2011出效2-不騰下款上額舷角頭天r0.2MX0.1M2MMd9DB65/T3240—2011C