基于IGPD靶標(biāo)：頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景細(xì)菌生物被膜（Bacterialbiofilm，BF）是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境，附著于惰性或活性實(shí)體表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將自身包裹其中而形成的具有三維結(jié)構(gòu)的微生物群落。這種特殊的生存方式使得細(xì)菌能夠在各種環(huán)境中存活，包括食品、食品加工設(shè)備、自來(lái)水管道、工業(yè)管道、通風(fēng)設(shè)備、醫(yī)療器械甚至病理狀態(tài)下的人體組織器官表面等。生物被膜中的細(xì)菌與浮游細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性以及對(duì)環(huán)境因子的敏感性等方面都存在顯著差異，尤其是對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的抵抗力，這給臨床治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致許多慢性和難治性感染疾病反復(fù)發(fā)作。在眾多能夠形成生物被膜的細(xì)菌中，木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus）作為一種血漿凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulasenegativestaphylococcus，CNS），廣泛存在于動(dòng)物和人的皮膚中。過(guò)去，它通常被認(rèn)為是非致病性細(xì)菌，但近年來(lái)的研究表明，木糖葡萄球菌可引發(fā)動(dòng)物隱性乳房炎和人類的某些細(xì)菌性感染，如急性腎盂腎炎、根管感染、尿路感染等，并且還具有抗生素耐藥性。更為關(guān)鍵的是，木糖葡萄球菌具有很強(qiáng)的形成生物被膜的能力，這使得它能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)感染，并且由于生物被膜的物理屏障作用，進(jìn)一步加劇了細(xì)菌的耐藥性，使得相關(guān)感染的治療變得更加困難。目前，針對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜感染的治療，臨床上主要依賴抗生素。然而，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，傳統(tǒng)抗生素的治療效果逐漸下降。因此，開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物或治療策略來(lái)抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成，成為了當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。頭孢喹肟（Cefquinome）作為第四代頭孢菌素類抗生素，具有廣譜、高效、耐酶等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)的抗菌活性。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)頭孢喹肟在一定程度上能夠干預(yù)細(xì)菌生物被膜的形成，但其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。咪唑甘油磷酸酯脫水酶（Imidazoleglycerolphosphatedehydratase，IGPD）是微生物體內(nèi)組氨酸生物合成的關(guān)鍵酶之一，由于其僅存在于細(xì)菌和植物中，因此成為了一個(gè)具有潛力的藥物靶點(diǎn)。研究表明，L-組氨酸的合成與木糖葡萄球菌的生物被膜形成有關(guān)，而IGPD是L-組氨酸合成通路中第一個(gè)具有專一合成L-組氨酸的酶?；诖?，本研究擬以IGPD為靶標(biāo)，深入探討頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型的抗木糖葡萄球菌生物被膜感染的藥物和治療策略提供理論依據(jù)。1.2細(xì)菌生物被膜研究進(jìn)展1.2.1細(xì)菌生物被膜簡(jiǎn)介細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌在自然環(huán)境中普遍存在的一種生存形式，它是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境，附著于惰性或活性實(shí)體表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將自身包裹其中而形成的具有三維結(jié)構(gòu)的微生物群落。這一結(jié)構(gòu)使得細(xì)菌能夠在各種復(fù)雜的環(huán)境中存活，包括食品、食品加工設(shè)備、自來(lái)水管道、工業(yè)管道、通風(fēng)設(shè)備、醫(yī)療器械甚至病理狀態(tài)下的人體組織器官表面等。從結(jié)構(gòu)上看，細(xì)菌生物被膜呈現(xiàn)出復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。以典型的模型化生物被膜為例，按從外到內(nèi)依次可分為生物膜主體層、連接層、調(diào)節(jié)層和基質(zhì)層。其中，生物膜主體層是細(xì)菌聚集的主要區(qū)域，包含了大量的細(xì)菌細(xì)胞以及它們分泌的胞外聚合物；連接層起到連接生物膜主體層和調(diào)節(jié)層的作用；調(diào)節(jié)層則主要參與生物膜與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞；基質(zhì)層是生物膜附著的基礎(chǔ)，通常由被膜表面吸附的有機(jī)或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成。細(xì)菌生物被膜的成分十分復(fù)雜，除了水和細(xì)菌外，還含有多種生物大分子。其中，多糖是生物被膜中胞外基質(zhì)的主要成分之一，如藻酸鹽在銅綠假單胞菌生物膜中起著重要作用，它可能在生物膜結(jié)構(gòu)中充當(dāng)細(xì)胞間的連接物質(zhì)，有利于形成較厚的生物膜。蛋白質(zhì)也是生物被膜的重要組成部分，參與生物膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能調(diào)節(jié)。此外，DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物質(zhì)也存在于生物被膜中，它們共同構(gòu)成了生物被膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，賦予了生物被膜獨(dú)特的生理特性。細(xì)菌生物被膜對(duì)微生物的生存和感染具有至關(guān)重要的意義。在生存方面，生物被膜為細(xì)菌提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，保護(hù)細(xì)菌免受外界不利因素的影響，如抗生素、消毒劑、宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等。生物被膜內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)能夠有效地進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和能量傳遞，確保細(xì)菌獲得充足的養(yǎng)分，維持正常的生命活動(dòng)。在感染方面，生物被膜的存在使得細(xì)菌能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，引發(fā)慢性和難治性感染疾病。例如，在醫(yī)療器械相關(guān)感染中，細(xì)菌在導(dǎo)管表面形成生物被膜，導(dǎo)致感染難以徹底清除，增加了患者的痛苦和治療成本。生物被膜還可能導(dǎo)致食品污染，引發(fā)食源性疾病，對(duì)食品安全構(gòu)成威脅。1.2.2細(xì)菌生物被膜的形成細(xì)菌生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的過(guò)程，一般可分為以下幾個(gè)階段：調(diào)節(jié)膜的形成：在生物被膜形成的初始階段，形成生物被膜的表面會(huì)先吸附細(xì)菌賴以附著的有機(jī)或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)生物材料植入體內(nèi)或自身組織發(fā)生病變時(shí)，體液如唾液、血液、尿液、胃腸道液等會(huì)迅速覆蓋在表面，形成一個(gè)2-10nm的蛋白吸附層，即調(diào)節(jié)膜。調(diào)節(jié)膜表面的蛋白、糖蛋白、糖脂等作為特異受體，可選擇性地與細(xì)菌黏附，為后續(xù)細(xì)菌的附著提供基礎(chǔ)。細(xì)菌可逆性附著：最初，細(xì)菌通過(guò)沉積、Brown運(yùn)動(dòng)、經(jīng)液體流動(dòng)以及細(xì)菌表面和調(diào)節(jié)膜間的靜電吸引等方式，實(shí)現(xiàn)可逆性附著在調(diào)節(jié)膜上。在這個(gè)階段，浮游細(xì)菌和附著細(xì)菌之間處于動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)菌與表面的連接方式相對(duì)較弱，容易脫離。這種可逆狀態(tài)使得細(xì)菌能夠在表面短暫停留，感知環(huán)境信息，為進(jìn)一步的附著做準(zhǔn)備。細(xì)菌不可逆性黏附：隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞膜連接感應(yīng)蛋白得到加強(qiáng)，細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物和黏附表面結(jié)合得非常牢固，進(jìn)入不可逆性黏附階段。細(xì)菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，特別是blaPER-1等，在這個(gè)過(guò)程中起到重要作用。此時(shí)，細(xì)菌與表面的結(jié)合力顯著增強(qiáng)，難以被外力輕易去除，為生物被膜的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。細(xì)菌繁殖：黏附的細(xì)菌開(kāi)始分裂、增殖，形成微小的菌落，這些菌落是生物被膜的基本組成單位。利用激光共聚焦顯微鏡（CSLM）可以觀察到，成熟的細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)高度組織化，由類似蘑菇形狀的微菌落組成，微菌落之間圍繞著水通道。這些水通道在生物被膜中發(fā)揮著重要的物質(zhì)運(yùn)輸作用，能夠運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排除廢物等，為細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝提供了必要的條件。群體感應(yīng)系統(tǒng)（QSS）在這個(gè)階段對(duì)細(xì)菌生物膜的形成和成熟起著關(guān)鍵作用。它是同種或不同種細(xì)菌通過(guò)對(duì)自身所處環(huán)境、群體密度的感知來(lái)進(jìn)行交流和反應(yīng)的一種機(jī)制。當(dāng)環(huán)境變化，如細(xì)菌密度改變或營(yíng)養(yǎng)條件變化時(shí)，細(xì)菌表面會(huì)產(chǎn)生和分泌特定的信號(hào)分子，一般稱為信息激素或自身誘導(dǎo)素。當(dāng)信號(hào)分子濃度隨著細(xì)菌數(shù)目的增加而聚集達(dá)到一定程度后，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外會(huì)感知并引發(fā)一系列的調(diào)節(jié)，從而影響生物被膜的形成和發(fā)展。目前已知的信息激素有?；呓z氨酸（AHI）、PQSs（庚基羥基）、AL-2、循環(huán)二肽和寡肽等。細(xì)菌播散：細(xì)菌能從生物被膜中脫離，主要通過(guò)外力、波狀遷移的物理運(yùn)動(dòng)或者自我消解等方式，播散到其他環(huán)境，從而引起新的感染。在大腸埃希菌的生物被膜中，RNA連接蛋白CsrA被發(fā)現(xiàn)是生物被膜分解的始動(dòng)因子。細(xì)菌的播散使得生物被膜能夠在更廣泛的范圍內(nèi)傳播，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)和范圍。細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程受到多種因素的影響。溫度是一個(gè)重要因素，適中的溫度能夠促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成和發(fā)展，而高溫和低溫則可能減緩或抑制生物被膜的形成。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給也至關(guān)重要，細(xì)菌生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、磷源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足或不平衡，都會(huì)影響細(xì)菌生物被膜的形成。溶氧量同樣對(duì)生物被膜形成有影響，過(guò)高或過(guò)低的溶氧量都會(huì)干擾細(xì)菌的代謝和分解能力，進(jìn)而影響生物被膜的形成。此外，細(xì)菌自身的黏附素、金屬離子、基因以及噬菌體等因素也會(huì)對(duì)生物被膜的形成產(chǎn)生作用。例如，多聚葡糖酸（PGA）作為牙周炎病原體放線菌胞外基質(zhì)的主要成分，在放線菌生物被膜的黏附、分離和播散過(guò)程中起一定作用；鐵離子（Fe3+）能通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的釋放起到穩(wěn)固生物被膜的作用，而金屬鎵通過(guò)對(duì)鐵的置換，能阻斷鐵依賴的菌體內(nèi)多種代謝途徑，有效地阻止生物被膜的形成。1.2.3細(xì)菌生物被膜的信號(hào)調(diào)節(jié)在細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中，存在多種信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，這些機(jī)制對(duì)生物被膜的形成和發(fā)展起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorumsensingsystem，QSS）是其中一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。它是細(xì)菌通過(guò)監(jiān)測(cè)群體密度來(lái)調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)的一種方式，保證了生物被膜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和廢物的排出，避免細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)而造成空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏。在這個(gè)系統(tǒng)中，?；呓z氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserinelactone，AHL）是生物被膜內(nèi)細(xì)胞間主要的信號(hào)傳遞分子。以銅綠假單胞菌為例，其細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)（LasR-LasI信號(hào)系統(tǒng)）在生物被膜形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，主要參與細(xì)菌生物被膜的分化。當(dāng)細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)健全時(shí)，能夠產(chǎn)生有效的抗菌生物被膜；而群體感應(yīng)系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌，則不能產(chǎn)生完整的生物被膜。如果在群體感應(yīng)系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌中加入AHL，細(xì)菌就又恢復(fù)了產(chǎn)生完整生物被膜的能力；相反，在群體感應(yīng)系統(tǒng)健全的細(xì)菌中加入群體感應(yīng)拮抗劑，則會(huì)形成結(jié)構(gòu)稀松的不完整生物被膜。群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorumsensingsystem，QSS）是其中一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。它是細(xì)菌通過(guò)監(jiān)測(cè)群體密度來(lái)調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)的一種方式，保證了生物被膜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和廢物的排出，避免細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)而造成空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏。在這個(gè)系統(tǒng)中，酰化高絲氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserinelactone，AHL）是生物被膜內(nèi)細(xì)胞間主要的信號(hào)傳遞分子。以銅綠假單胞菌為例，其細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)（LasR-LasI信號(hào)系統(tǒng)）在生物被膜形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，主要參與細(xì)菌生物被膜的分化。當(dāng)細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)健全時(shí)，能夠產(chǎn)生有效的抗菌生物被膜；而群體感應(yīng)系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌，則不能產(chǎn)生完整的生物被膜。如果在群體感應(yīng)系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌中加入AHL，細(xì)菌就又恢復(fù)了產(chǎn)生完整生物被膜的能力；相反，在群體感應(yīng)系統(tǒng)健全的細(xì)菌中加入群體感應(yīng)拮抗劑，則會(huì)形成結(jié)構(gòu)稀松的不完整生物被膜。除了群體感應(yīng)系統(tǒng)，雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-componentsignaltransductionsystems，TCSs）也在細(xì)菌生物被膜形成中發(fā)揮重要作用。TCSs由組氨酸蛋白激酶（Histidineproteinkinases，HPKs）和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（Responseregulators，RRs）組成。HPKs能夠感知外界環(huán)境信號(hào)，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、滲透壓、溫度等變化，然后自身發(fā)生磷酸化，并將磷酸基團(tuán)傳遞給RRs。RRs被磷酸化后，會(huì)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的生理行為，包括生物被膜的形成。例如，在金黃色葡萄球菌中，WalKR雙組分系統(tǒng)參與調(diào)控生物被膜的形成，缺失WalKR會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成能力下降。環(huán)二鳥(niǎo)苷酸（Cyclicdiguanylate，c-di-GMP）作為一種廣泛存在于細(xì)菌中的第二信使，也參與了生物被膜形成的信號(hào)調(diào)節(jié)。c-di-GMP的水平在細(xì)菌內(nèi)受到合成酶和降解酶的調(diào)控，當(dāng)c-di-GMP水平升高時(shí)，會(huì)促進(jìn)細(xì)菌從浮游狀態(tài)向生物被膜狀態(tài)轉(zhuǎn)變。它可以通過(guò)與一些效應(yīng)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、胞外多糖合成等過(guò)程，進(jìn)而影響生物被膜的形成。在銅綠假單胞菌中，c-di-GMP能夠促進(jìn)胞外多糖的合成，增強(qiáng)細(xì)菌之間的黏附，有利于生物被膜的形成。1.2.4凝固酶陰性葡萄球菌生物被膜形成的分子機(jī)制凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulasenegativestaphylococcus，CNS）是一類重要的條件致病菌，其中木糖葡萄球菌作為CNS的一種，具有很強(qiáng)的形成生物被膜的能力。其生物被膜形成的分子機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵因素。ica操縱子是木糖葡萄球菌生物被膜形成的重要分子機(jī)制之一。ica操縱子包含icaA、icaB、icaC和icaD四個(gè)基因，它們共同參與了多糖細(xì)胞間黏附素（Polysaccharideintercellularadhesin，PIA）的合成。PIA是一種胞外多糖，在細(xì)菌間的黏附和生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。icaA和icaD編碼合成PIA的關(guān)鍵酶，icaB和icaC則參與PIA的轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾。當(dāng)ica操縱子表達(dá)上調(diào)時(shí)，PIA合成增加，促進(jìn)細(xì)菌間的黏附，有利于生物被膜的形成；反之，ica操縱子表達(dá)受到抑制時(shí)，生物被膜形成能力下降。ica操縱子是木糖葡萄球菌生物被膜形成的重要分子機(jī)制之一。ica操縱子包含icaA、icaB、icaC和icaD四個(gè)基因，它們共同參與了多糖細(xì)胞間黏附素（Polysaccharideintercellularadhesin，PIA）的合成。PIA是一種胞外多糖，在細(xì)菌間的黏附和生物被膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用。icaA和icaD編碼合成PIA的關(guān)鍵酶，icaB和icaC則參與PIA的轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾。當(dāng)ica操縱子表達(dá)上調(diào)時(shí)，PIA合成增加，促進(jìn)細(xì)菌間的黏附，有利于生物被膜的形成；反之，ica操縱子表達(dá)受到抑制時(shí)，生物被膜形成能力下降。除了ica操縱子，一些表面蛋白也參與了木糖葡萄球菌生物被膜的形成。例如，纖維連接蛋白結(jié)合蛋白（Fibronectin-bindingproteins，F(xiàn)nBPs）能夠與宿主細(xì)胞表面的纖維連接蛋白結(jié)合，促進(jìn)細(xì)菌在宿主組織表面的黏附，進(jìn)而為生物被膜的形成提供基礎(chǔ)。此外，一些自溶素也與生物被膜形成有關(guān)，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞壁的代謝，影響細(xì)菌的聚集和生物被膜的結(jié)構(gòu)。研究還發(fā)現(xiàn)，木糖葡萄球菌生物被膜形成與L-組氨酸的合成密切相關(guān)。咪唑甘油磷酸酯脫水酶（IGPD）是L-組氨酸合成通路中第一個(gè)具有專一合成L-組氨酸的酶。當(dāng)IGPD的活性受到抑制時(shí)，L-組氨酸合成受阻，進(jìn)而影響木糖葡萄球菌生物被膜的形成。這表明IGPD在木糖葡萄球菌生物被膜形成的分子機(jī)制中可能扮演著重要角色，為研究木糖葡萄球菌生物被膜形成機(jī)制和開(kāi)發(fā)干預(yù)策略提供了新的靶點(diǎn)。1.2.5干預(yù)細(xì)菌生物被膜形成的策略針對(duì)細(xì)菌生物被膜帶來(lái)的感染和耐藥問(wèn)題，目前研究人員開(kāi)發(fā)了多種干預(yù)策略，主要包括物理、化學(xué)和生物干預(yù)策略。物理干預(yù)策略：物理干預(yù)策略主要通過(guò)物理手段破壞或抑制生物被膜的形成。常見(jiàn)的方法包括機(jī)械清洗、超聲處理和紫外線照射等。機(jī)械清洗是一種簡(jiǎn)單直接的方法，通過(guò)物理摩擦去除物體表面的生物被膜，常用于醫(yī)療器械、食品加工設(shè)備等的清潔。然而，這種方法對(duì)于一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)或難以觸及的部位效果有限，且可能無(wú)法徹底清除生物被膜，容易導(dǎo)致生物被膜的再次形成。超聲處理利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌從表面脫落。研究表明，適當(dāng)頻率和強(qiáng)度的超聲處理能夠有效地減少生物被膜的量。但超聲處理也存在局限性，如對(duì)設(shè)備要求較高，可能對(duì)處理對(duì)象造成損傷，且在實(shí)際應(yīng)用中需要考慮超聲的穿透性和均勻性等問(wèn)題。紫外線照射則通過(guò)破壞細(xì)菌的DNA結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而減少生物被膜的形成。紫外線照射具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)化學(xué)殘留等優(yōu)點(diǎn)，但它的穿透能力較弱，只能作用于生物被膜表面的細(xì)菌，對(duì)于深層細(xì)菌的殺滅效果不佳?；瘜W(xué)干預(yù)策略：化學(xué)干預(yù)策略主要利用化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制或破壞生物被膜?？股厥浅Ｓ玫幕瘜W(xué)干預(yù)物質(zhì)之一，但由于生物被膜中的細(xì)菌對(duì)抗生素具有很強(qiáng)的耐藥性，傳統(tǒng)抗生素的治療效果往往不理想。為了提高抗生素的療效，研究人員開(kāi)發(fā)了一些新型抗生素和抗生素遞送系統(tǒng)。例如，將抗生素與納米材料結(jié)合，利用納米材料的高比表面積和靶向性，提高抗生素在生物被膜中的滲透和富集，增強(qiáng)對(duì)抗生物被膜細(xì)菌的殺滅作用。此外，一些非抗生素類化學(xué)物質(zhì)，如消毒劑、表面活性劑等，也可用于干預(yù)生物被膜形成。消毒劑能夠直接殺滅細(xì)菌，破壞生物被膜結(jié)構(gòu)，但長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)環(huán)境有一定的影響。表面活性劑可以降低生物被膜與表面的黏附力，促進(jìn)生物被膜的脫落，但高濃度的表面活性劑可能對(duì)人體和環(huán)境造成危害。生物干預(yù)策略：生物干預(yù)策略利用生物制劑或生物活性物質(zhì)來(lái)抑制生物被膜的形成。噬菌體作為一種能夠特異性感染細(xì)菌的病毒，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。噬菌體可以識(shí)別并感染生物被膜中的細(xì)菌，通過(guò)裂解細(xì)菌來(lái)破壞生物被膜結(jié)構(gòu)。研究表明，將噬菌體整合到生物被膜的基質(zhì)中，能夠有效地清除生物被膜。但噬菌體的應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)，如噬菌體的宿主特異性較強(qiáng)，需要針對(duì)不同的細(xì)菌選擇合適的噬菌體，且噬菌體可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗性。此外，一些生物活性物質(zhì)，如酶、益生菌等，也可用于干預(yù)生物被膜形成。酶可以降解生物被膜中的胞外聚合物，破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)；益生菌則通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)，抑制病原菌生物被膜的形成。1.3頭孢菌素及頭孢喹肟影響生物被膜形成的研究進(jìn)展1.3.1頭孢菌素及頭孢喹肟簡(jiǎn)介頭孢菌素是一類廣泛應(yīng)用于臨床的β-內(nèi)酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐青霉素酶、過(guò)敏反應(yīng)較青霉素類少見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)。自1948年發(fā)現(xiàn)第一種頭孢菌素——頭孢菌素C以來(lái)，頭孢菌素類抗生素經(jīng)歷了快速的發(fā)展，根據(jù)其抗菌譜、抗菌活性、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性及腎毒性等特性，目前已被分為五代。第一代頭孢菌素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，如頭孢唑林、頭孢拉定等，可用于治療呼吸道和尿路感染、皮膚及軟組織感染等常見(jiàn)疾病。然而，它們對(duì)革蘭氏陰性菌的作用相對(duì)較弱，且易被細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶所破壞。第二代頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用略遜于第一代，但對(duì)革蘭氏陰性菌有明顯增強(qiáng)，對(duì)厭氧菌也有一定作用，如頭孢呋辛、頭孢克洛等。其對(duì)多種β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性較第一代有所提高，可用于治療肺炎、膽道感染、菌血癥等多種感染疾病。第三代頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用不及第一、二代，但對(duì)革蘭氏陰性桿菌，包括腸桿菌類、銅綠假單胞菌及厭氧菌等具有強(qiáng)大的抗菌活性，如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶等。它們對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，可用于危及生命的敗血癥、腦膜炎、肺炎、骨髓炎及尿路嚴(yán)重感染的治療。第四代頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌和革蘭氏陰性桿菌均有高效，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，如頭孢吡肟、頭孢匹羅等，可用于治療對(duì)第三代頭孢菌素耐藥的細(xì)菌感染。第五代頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用強(qiáng)于前四代，尤其對(duì)耐甲氧西林金葡菌、耐萬(wàn)古霉素金葡菌、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、耐青霉素的肺炎鏈球菌等具有良好的抗菌活性，對(duì)一些厭氧菌也有抗菌作用，如頭孢洛林、頭孢吡普等。頭孢喹肟作為第四代頭孢菌素，其化學(xué)名為(6R,7R)-7-[(2Z)-(2-氨基-4-噻唑基)(甲氧亞氨基)乙酰氨基]-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特性。它的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的抗菌活性和對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性。頭孢喹肟具有廣譜抗菌作用，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌等。在臨床應(yīng)用中，頭孢喹肟主要用于治療動(dòng)物的呼吸道感染、泌尿生殖道感染、皮膚軟組織感染等疾病。在獸醫(yī)領(lǐng)域，它常被用于治療奶牛乳房炎、豬呼吸道疾病綜合征等，能夠有效地控制感染，減少疾病的發(fā)生和傳播，提高動(dòng)物的健康水平和生產(chǎn)性能。1.3.2頭孢菌素及頭孢喹肟對(duì)生物被膜的影響隨著對(duì)細(xì)菌生物被膜研究的深入，發(fā)現(xiàn)頭孢菌素類抗生素在一定程度上能夠干預(yù)生物被膜的形成。研究表明，某些頭孢菌素可以抑制細(xì)菌生物被膜的初始黏附階段，減少細(xì)菌在表面的附著數(shù)量。這可能是因?yàn)轭^孢菌素能夠影響細(xì)菌表面的黏附素表達(dá)或活性，從而降低細(xì)菌與表面的親和力。頭孢菌素還可能干擾細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，如群體感應(yīng)系統(tǒng)。通過(guò)抑制信號(hào)分子的合成或干擾信號(hào)傳遞，頭孢菌素可以阻礙生物被膜的成熟和發(fā)展，使其結(jié)構(gòu)變得松散，降低生物被膜的穩(wěn)定性。關(guān)于頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的影響，目前相關(guān)研究相對(duì)較少，但已有的研究表明其具有潛在的干預(yù)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，一定濃度的頭孢喹肟能夠顯著減少木糖葡萄球菌生物被膜的形成量。通過(guò)結(jié)晶紫染色等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著頭孢喹肟濃度的增加，生物被膜的吸光度值明顯降低，表明生物被膜的總量減少。進(jìn)一步的掃描電子顯微鏡觀察顯示，經(jīng)頭孢喹肟處理后的木糖葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)變得不完整，細(xì)菌之間的連接松散，胞外聚合物的分泌減少。這說(shuō)明頭孢喹肟可能通過(guò)破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)，影響細(xì)菌之間的黏附和聚集，從而抑制生物被膜的形成。然而，目前對(duì)于頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的具體機(jī)制尚未完全明確。有研究推測(cè)，頭孢喹肟可能通過(guò)抑制木糖葡萄球菌中與生物被膜形成相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。ica操縱子作為木糖葡萄球菌生物被膜形成的關(guān)鍵基因，頭孢喹肟是否能夠影響ica操縱子的表達(dá)，進(jìn)而抑制多糖細(xì)胞間黏附素（PIA）的合成，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。頭孢喹肟與木糖葡萄球菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁相互作用，影響其生理功能，從而間接影響生物被膜形成的可能性也不能排除。因此，深入研究頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型的抗生物被膜感染藥物和治療策略具有重要意義。1.4咪唑甘油磷酸酯脫水酶及組氨酸研究進(jìn)展1.4.1咪唑甘油磷酸酯脫水酶簡(jiǎn)介咪唑甘油磷酸酯脫水酶（Imidazoleglycerolphosphatedehydratase，IGPD），在微生物組氨酸生物合成途徑中占據(jù)關(guān)鍵地位。它能夠催化咪唑甘油磷酸酯（Imidazoleglycerolphosphate，IGP）脫水生成咪唑丙酮酸磷酸酯（Imidazolepyruvatephosphate，IPP），這是L-組氨酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。其反應(yīng)機(jī)制基于酸堿催化原理，IGPD的活性位點(diǎn)氨基酸殘基通過(guò)提供或接受質(zhì)子，促進(jìn)IGP分子中特定化學(xué)鍵的斷裂與重組，從而高效完成脫水反應(yīng)。在大腸桿菌中，IGPD由hisB基因編碼，其表達(dá)水平受到細(xì)胞內(nèi)組氨酸濃度的嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)組氨酸含量較低時(shí)，hisB基因表達(dá)上調(diào)，促使IGPD合成增加，以滿足組氨酸的合成需求；反之，當(dāng)組氨酸濃度過(guò)高時(shí)，hisB基因表達(dá)被抑制，IGPD合成減少，避免組氨酸的過(guò)度積累。在金黃色葡萄球菌等多種病原菌中，IGPD的正常功能對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、存活以及致病性發(fā)揮著不可或缺的作用。一旦IGPD活性受到抑制，細(xì)菌無(wú)法合成足夠的組氨酸，進(jìn)而影響細(xì)菌蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成，最終阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖。這使得IGPD成為極具潛力的抗菌藥物研發(fā)靶點(diǎn)，針對(duì)IGPD的抑制劑有望為新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新途徑。1.4.2IGPD分子結(jié)構(gòu)IGPD的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式，由多個(gè)α-螺旋和β-折疊相互交織形成緊密且穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)。其活性位點(diǎn)通常位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的凹陷區(qū)域，周圍環(huán)繞著特定的氨基酸殘基，這些殘基對(duì)于底物的識(shí)別與結(jié)合以及催化反應(yīng)的進(jìn)行起著關(guān)鍵作用。在枯草芽孢桿菌的IGPD結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)金屬離子（通常為Mn2+）緊密結(jié)合在活性位點(diǎn)，它們不僅參與底物的配位，還通過(guò)穩(wěn)定反應(yīng)中間體，顯著促進(jìn)脫水反應(yīng)的順利進(jìn)行。金屬離子與底物IGP分子中的特定原子形成配位鍵，使底物分子處于有利于反應(yīng)的構(gòu)象，同時(shí)降低反應(yīng)的活化能，大大提高了IGPD的催化效率。研究還發(fā)現(xiàn)，IGPD活性位點(diǎn)附近的一些氨基酸殘基通過(guò)與底物形成氫鍵、離子鍵或疏水相互作用等非共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的精準(zhǔn)識(shí)別與緊密結(jié)合。這些相互作用確保底物在活性位點(diǎn)的正確定位，為后續(xù)的催化反應(yīng)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。IGPD的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)其功能至關(guān)重要，任何影響其結(jié)構(gòu)完整性的因素，如基因突變導(dǎo)致的氨基酸替換、化學(xué)修飾以及溫度、pH值等環(huán)境因素的劇烈變化，都可能改變活性位點(diǎn)的構(gòu)象，進(jìn)而影響底物的結(jié)合與催化活性，最終導(dǎo)致IGPD功能受損。1.4.3IGPD抑制劑目前，科研人員已發(fā)現(xiàn)多種IGPD抑制劑，這些抑制劑的作用機(jī)制各有特點(diǎn)。其中，一些抑制劑通過(guò)與IGPD的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，直接阻斷底物IGP的結(jié)合，從而抑制酶的催化活性。例如，某類小分子化合物能夠與IGPD活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基形成強(qiáng)相互作用，占據(jù)底物結(jié)合空間，使得IGP無(wú)法進(jìn)入活性位點(diǎn)，有效抑制了組氨酸的合成。還有一些抑制劑通過(guò)與IGPD的別構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，引發(fā)蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，間接影響活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能。別構(gòu)抑制劑的結(jié)合導(dǎo)致IGPD分子發(fā)生構(gòu)象變化，使活性位點(diǎn)的形狀、電荷分布等發(fā)生改變，降低了活性位點(diǎn)對(duì)底物的親和力，從而抑制酶的活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，這些抑制劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制效果。當(dāng)添加特定的IGPD抑制劑到細(xì)菌培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度明顯減緩，生物量顯著減少。這是因?yàn)橐种苿┳钄嗔私M氨酸的合成途徑，細(xì)菌缺乏必要的組氨酸來(lái)合成蛋白質(zhì)等生物大分子，生長(zhǎng)和繁殖受到嚴(yán)重阻礙。IGPD抑制劑在抗菌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。它們?yōu)殚_(kāi)發(fā)新型抗菌藥物提供了全新的思路和方向，有望解決日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。相較于傳統(tǒng)抗生素，IGPD抑制劑具有獨(dú)特的作用靶點(diǎn)，不易受到細(xì)菌已有的耐藥機(jī)制影響，為臨床治療細(xì)菌感染性疾病提供了新的有效手段。目前IGPD抑制劑的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。在未來(lái)的研究中，需要進(jìn)一步優(yōu)化抑制劑的結(jié)構(gòu)，提高其活性和選擇性，降低毒副作用，同時(shí)深入研究其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性，為其臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。1.4.4L-組氨酸簡(jiǎn)介L(zhǎng)-組氨酸是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的α-氨基酸，其側(cè)鏈含有一個(gè)咪唑基團(tuán)，這一獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予了L-組氨酸許多重要的生理功能。在細(xì)菌生理活動(dòng)中，L-組氨酸扮演著不可或缺的角色。它是細(xì)菌合成蛋白質(zhì)的重要原料之一，參與構(gòu)成各種酶、結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白等，對(duì)維持細(xì)菌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和生理功能起著關(guān)鍵作用。L-組氨酸還參與細(xì)菌體內(nèi)的多種代謝途徑，如在嘌呤和嘧啶的合成過(guò)程中，L-組氨酸提供氮源，促進(jìn)核酸的合成，對(duì)細(xì)菌的遺傳信息傳遞和表達(dá)至關(guān)重要。L-組氨酸在細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力方面發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)菌面臨氧化應(yīng)激、滲透壓變化等不利環(huán)境時(shí)，L-組氨酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓、清除自由基等方式，幫助細(xì)菌維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，增強(qiáng)細(xì)菌的抗逆性。在某些細(xì)菌中，L-組氨酸還參與群體感應(yīng)系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)分子的合成和釋放，影響細(xì)菌的群體行為，如生物被膜形成、毒力因子表達(dá)等。1.4.5IGPD及組氨酸影響生物被膜形成IGPD和組氨酸在生物被膜形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，IGPD作為組氨酸合成的關(guān)鍵酶，其活性變化直接影響組氨酸的合成量，進(jìn)而對(duì)生物被膜形成產(chǎn)生影響。當(dāng)IGPD活性受到抑制時(shí)，組氨酸合成受阻，細(xì)菌生物被膜的形成能力顯著下降。在木糖葡萄球菌中，通過(guò)基因敲除或抑制劑處理降低IGPD活性后，生物被膜的厚度、細(xì)菌聚集程度以及胞外聚合物的分泌量都明顯減少。這是因?yàn)榻M氨酸參與細(xì)菌生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。組氨酸可以作為信號(hào)分子，激活或抑制某些與生物被膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌中，組氨酸能夠調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響生物被膜的形成和成熟。組氨酸還可能參與細(xì)菌表面黏附素的合成和修飾，影響細(xì)菌與表面的黏附能力，從而間接影響生物被膜的形成。在金黃色葡萄球菌中，組氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致表面蛋白的表達(dá)和修飾異常，降低細(xì)菌對(duì)生物材料表面的黏附能力，不利于生物被膜的初始形成。1.5研究目的與意義本研究旨在以IGPD為靶標(biāo)，深入探討頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制。通過(guò)運(yùn)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，明確頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成各個(gè)階段的影響，解析其作用于IGPD進(jìn)而調(diào)控生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)和信號(hào)通路的具體機(jī)制。從學(xué)術(shù)理論層面來(lái)看，本研究將進(jìn)一步完善對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，豐富頭孢菌素類抗生素作用機(jī)制的理論體系。為后續(xù)深入研究細(xì)菌生物被膜的形成與調(diào)控提供新的視角和思路，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)發(fā)展，具有重要的理論價(jià)值。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果將為臨床治療木糖葡萄球菌生物被膜相關(guān)感染提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。有助于開(kāi)發(fā)新型的抗生物被膜感染藥物和治療策略，提高臨床治療效果，降低感染的發(fā)生率和復(fù)發(fā)率，減輕患者的痛苦和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。在獸醫(yī)領(lǐng)域，對(duì)于控制動(dòng)物感染、保障動(dòng)物健康和提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益也具有重要的指導(dǎo)意義。二、材料和方法2.1材料2.1.1菌株選用木糖葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49148，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（AmericanTypeCultureCollection，ATCC）。該菌株經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量控制，具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，是研究木糖葡萄球菌相關(guān)特性的常用標(biāo)準(zhǔn)菌株。在本研究中，主要利用該菌株來(lái)探究頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的研究，能夠更準(zhǔn)確地揭示頭孢喹肟的作用機(jī)制，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。2.1.2藥品實(shí)驗(yàn)用頭孢喹肟（Cefquinome）為純度≥98%的分析純?cè)噭?gòu)自Sigma-Aldrich公司。使用時(shí)，將頭孢喹肟用無(wú)菌超純水配制成100mg/mL的儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后，分裝于無(wú)菌離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求，用相應(yīng)的培養(yǎng)基將儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。結(jié)晶紫購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于生物被膜的染色檢測(cè)。將結(jié)晶紫配制成1%的水溶液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。在生物被膜形成實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用結(jié)晶紫對(duì)生物被膜進(jìn)行染色，通過(guò)測(cè)定染色后生物被膜的吸光度值，來(lái)定量分析生物被膜的形成量。2.1.3培養(yǎng)基及試劑實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基包括腦心浸液肉湯（BrainHeartInfusionBroth，BHI）和胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticSoyBroth，TSB），均購(gòu)自BD公司。BHI培養(yǎng)基成分包括：腦浸出粉12.5g/L、牛心浸出粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖2.0g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，pH值為7.4±0.2。配制時(shí)，將各成分加入適量蒸餾水中，加熱攪拌使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH值后，分裝于三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。BHI培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠滿足木糖葡萄球菌的生長(zhǎng)需求，常用于細(xì)菌的培養(yǎng)和傳代。TSB培養(yǎng)基成分包括：胰蛋白胨17.0g/L、大豆蛋白胨3.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化鈉5.0g/L、磷酸氫二鉀2.5g/L，pH值為7.3±0.2。配制方法與BHI培養(yǎng)基類似，121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。TSB培養(yǎng)基也廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的培養(yǎng)，在本研究中主要用于生物被膜形成實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中還用到其他試劑，如30%過(guò)氧化氫溶液，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，用于檢測(cè)細(xì)菌的過(guò)氧化氫酶活性。在過(guò)氧化氫酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，滴加30%過(guò)氧化氫溶液，觀察是否產(chǎn)生氣泡，若產(chǎn)生氣泡則表明細(xì)菌具有過(guò)氧化氫酶活性。革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，用于細(xì)菌的革蘭氏染色，以確定細(xì)菌的革蘭氏屬性。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，將培養(yǎng)的木糖葡萄球菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色情況，判斷其為革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌。2.1.4儀器設(shè)備本實(shí)驗(yàn)使用的儀器設(shè)備包括：恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：DNP-9082，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），用于細(xì)菌的培養(yǎng)，溫度可設(shè)置范圍為5-65℃，精度為±0.5℃。使用時(shí)，將接種好細(xì)菌的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的溫度和培養(yǎng)時(shí)間。酶標(biāo)儀（型號(hào)：InfiniteM200Pro，Tecan公司），用于檢測(cè)生物被膜的吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為200-1000nm。在生物被膜結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)中，將染色后的96孔板放入酶標(biāo)儀中，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值，從而定量分析生物被膜的形成量。掃描電子顯微鏡（型號(hào)：SU8010，日本日立公司），用于觀察生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)，分辨率可達(dá)1.0nm（加速電壓15kV）。在觀察生物被膜結(jié)構(gòu)時(shí)，將生物被膜樣品進(jìn)行固定、脫水、干燥等處理后，噴金鍍膜，然后在掃描電子顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)、細(xì)菌分布和胞外聚合物的情況。PCR儀（型號(hào)：T100，Bio-Rad公司），用于基因擴(kuò)增，可設(shè)置不同的溫度和時(shí)間程序，實(shí)現(xiàn)DNA的變性、退火和延伸。在進(jìn)行基因相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系和程序，將模板DNA、引物、dNTP、Taq酶等試劑加入PCR管中，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。2.1.5PCR引物根據(jù)GenBank中木糖葡萄球菌IGPD基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物。上游引物序列為：5'-ATGCTGCTGAAGAAGCTG-3'，下游引物序列為：5'-TTACCGCTTCTTGCTTCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在實(shí)驗(yàn)中，這些引物用于擴(kuò)增IGPD基因，通過(guò)PCR技術(shù)，以木糖葡萄球菌基因組DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)IGPD基因的大量擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物可用于后續(xù)的基因測(cè)序、基因表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)，以研究頭孢喹肟對(duì)IGPD基因的影響，進(jìn)而探究其干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制。2.2方法2.2.1頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的抑菌作用采用微量肉湯稀釋法測(cè)定頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的最低抑菌濃度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。首先，將木糖葡萄球菌ATCC49148接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后，用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。將頭孢喹肟?jī)?chǔ)備液用BHI培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，使其濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。在無(wú)菌96孔板中，每孔加入100μL不同濃度的頭孢喹肟稀釋液，再加入100μL調(diào)整好濃度的木糖葡萄球菌菌液，使每孔最終菌液濃度為5×105CFU/mL。設(shè)置不加藥物的陽(yáng)性對(duì)照組（加入100μLBHI培養(yǎng)基和100μL菌液）和不加菌液的陰性對(duì)照組（加入200μLBHI培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18-24小時(shí)。孵育結(jié)束后，觀察各孔的生長(zhǎng)情況。以肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為MIC值。同時(shí)，采用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)MIC值進(jìn)行驗(yàn)證。從無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度孔中取10μL菌液，涂布于BHI瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。若菌落數(shù)小于10CFU，則該藥物濃度即為MIC值。2.2.2木糖葡萄球菌生物被膜培養(yǎng)及形成能力測(cè)定木糖葡萄球菌生物被膜的培養(yǎng)采用96孔板靜態(tài)培養(yǎng)法。將木糖葡萄球菌ATCC49148接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。在無(wú)菌96孔板中，每孔加入200μL調(diào)整好濃度的菌液，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。分別在培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，以去除未黏附的浮游細(xì)菌。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定木糖葡萄球菌生物被膜的形成能力。在沖洗后的96孔板中，每孔加入200μL1%的結(jié)晶紫溶液，室溫染色15-20分鐘。染色結(jié)束后，棄去結(jié)晶紫溶液，用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗3次，直至沖洗液無(wú)色。然后，每孔加入200μL95%乙醇溶液，室溫振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶紫溶解。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD570）。OD570值越大，表明生物被膜的形成能力越強(qiáng)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，取平均值作為該時(shí)間點(diǎn)的生物被膜形成能力指標(biāo)。2.2.3頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用在木糖葡萄球菌生物被膜培養(yǎng)過(guò)程中加入頭孢喹肟，觀察其對(duì)生物被膜的干預(yù)作用。將木糖葡萄球菌ATCC49148接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。在無(wú)菌96孔板中，每孔加入100μL不同濃度的頭孢喹肟稀釋液（濃度分別為1/2MIC、MIC、2MIC），再加入100μL調(diào)整好濃度的菌液，使每孔最終菌液濃度為5×105CFU/mL。設(shè)置不加藥物的對(duì)照組（加入100μLBHI培養(yǎng)基和100μL菌液）。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未黏附的浮游細(xì)菌。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜的形成量，方法同2.2.2。同時(shí)，采用掃描電子顯微鏡觀察生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)。將生物被膜樣品用2.5%戊二醛溶液固定2-4小時(shí)，用PBS緩沖液沖洗3次，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每次15-20分鐘。脫水后的樣品用叔丁醇置換乙醇，然后進(jìn)行冷凍干燥。干燥后的樣品用離子濺射儀噴金鍍膜，在掃描電子顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)、細(xì)菌分布和胞外聚合物的情況。2.2.41/2MIC頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白質(zhì)組學(xué)研究采用iTRAQ（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）技術(shù)結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquidchromatography-massspectrometry，LC-MS/MS）對(duì)1/2MIC頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成過(guò)程中的蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行分析。將木糖葡萄球菌ATCC49148接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。在無(wú)菌三角瓶中，分別加入含有1/2MIC頭孢喹肟的BHI培養(yǎng)基和不含藥物的BHI培養(yǎng)基，再加入調(diào)整好濃度的菌液，使菌液最終濃度為5×105CFU/mL。將三角瓶置于37℃恒溫?fù)u床中，150rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，收集生物被膜樣品。將收集的生物被膜樣品用PBS緩沖液沖洗3次，加入適量的裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上超聲裂解15-20分鐘。裂解后的樣品在4℃下12000rpm離心15-20分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將定量后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶解，酶解后的肽段用iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的肽段通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（Strongcationexchangechromatography，SCX）進(jìn)行預(yù)分離，收集不同洗脫峰的肽段。將預(yù)分離后的肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析，采用Mascot軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索和分析，鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，以揭示頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的潛在分子機(jī)制。2.2.5木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建采用同源重組的方法構(gòu)建木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株。首先，根據(jù)木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因序列，設(shè)計(jì)上下游同源臂引物。上游同源臂引物序列為：5'-（同源臂上游序列）-3'，下游同源臂引物序列為：5'-（同源臂下游序列）-3'。以木糖葡萄球菌ATCC700404基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂片段。將上下游同源臂片段與自殺質(zhì)粒pKOR1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKOR1-hisB。將重組質(zhì)粒pKOR1-hisB通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入木糖葡萄球菌ATCC700404感受態(tài)細(xì)胞中。在含有氯霉素的BHI平板上篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定重組菌株。將重組菌株在含有蔗糖的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行第二次同源重組，篩選出hisB基因缺失株。通過(guò)PCR和測(cè)序?qū)isB基因缺失株進(jìn)行鑒定。為了驗(yàn)證hisB基因缺失株的表型變化是由于hisB基因缺失引起的，構(gòu)建hisB基因回補(bǔ)株。以木糖葡萄球菌ATCC700404基因組DNA為模板，擴(kuò)增hisB基因及其啟動(dòng)子序列。將擴(kuò)增得到的片段與穿梭質(zhì)粒pCN34連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCN34-hisB。將重組質(zhì)粒pCN34-hisB通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入hisB基因缺失株感受態(tài)細(xì)胞中。在含有紅霉素的BHI平板上篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定回補(bǔ)株。2.2.6頭孢喹肟對(duì)hisB基因缺失株和野生株IGPD及組氨酸的影響將木糖葡萄球菌hisB基因缺失株、野生株ATCC700404分別接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL，分別加入含有1/2MIC頭孢喹肟的BHI培養(yǎng)基和不含藥物的BHI培養(yǎng)基，使菌液最終濃度為5×105CFU/mL。將三角瓶置于37℃恒溫?fù)u床中，150rpm振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，收集菌體。采用酶活測(cè)定試劑盒測(cè)定菌體中IGPD的活性。將收集的菌體用PBS緩沖液沖洗3次，加入適量的裂解液，在冰上超聲裂解15-20分鐘。裂解后的樣品在4℃下12000rpm離心15-20分鐘，取上清液作為酶液。按照酶活測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，測(cè)定酶液中IGPD的活性。同時(shí)，采用高效液相色譜（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）測(cè)定菌體中組氨酸的含量。將收集的菌體用PBS緩沖液沖洗3次，加入適量的鹽酸溶液，在100℃水浴中水解1-2小時(shí)。水解后的樣品用氫氧化鈉溶液中和，然后通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾。將過(guò)濾后的樣品進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定組氨酸的含量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.2.7IGPD的同源建模及與頭孢喹肟結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)利用SWISS-MODEL等生物信息學(xué)軟件對(duì)木糖葡萄球菌IGPD進(jìn)行同源建模。首先，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（ProteinDataBank，PDB）中搜索與木糖葡萄球菌IGPD序列相似度較高的已知結(jié)構(gòu)蛋白。選擇相似度最高的蛋白作為模板，通過(guò)序列比對(duì)將木糖葡萄球菌IGPD序列與模板蛋白序列進(jìn)行匹配。根據(jù)匹配結(jié)果，利用SWISS-MODEL軟件構(gòu)建木糖葡萄球菌IGPD的三維結(jié)構(gòu)模型。對(duì)構(gòu)建的模型進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)估，確保模型的準(zhǔn)確性和可靠性。采用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)IGPD與頭孢喹肟的結(jié)合位點(diǎn)。將優(yōu)化后的IGPD三維結(jié)構(gòu)模型和頭孢喹肟分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子對(duì)接軟件（如AutoDockVina）中。設(shè)置對(duì)接參數(shù)，包括對(duì)接位點(diǎn)、搜索空間、能量計(jì)算等。進(jìn)行分子對(duì)接模擬，計(jì)算IGPD與頭孢喹肟之間的結(jié)合自由能和結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)對(duì)接結(jié)果，分析IGPD與頭孢喹肟的相互作用模式，預(yù)測(cè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。2.2.8IGPD與頭孢喹肟相互作用的驗(yàn)證采用表面等離子共振（Surfaceplasmonresonance，SPR）技術(shù)，利用BIAcore儀器驗(yàn)證IGPD與頭孢喹肟的相互作用。將IGPD蛋白固定在CM5芯片表面，通過(guò)胺偶聯(lián)法進(jìn)行固定。將不同濃度的頭孢喹肟溶液（濃度分別為10μM、20μM、40μM、80μM、160μM）以一定流速注入芯片表面，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)頭孢喹肟與IGPD的結(jié)合過(guò)程。通過(guò)分析傳感器圖，計(jì)算頭孢喹肟與IGPD的結(jié)合親和力（KD值）和解離常數(shù)（koff值）。同時(shí)，進(jìn)行特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將無(wú)關(guān)蛋白固定在芯片表面，注入頭孢喹肟溶液，觀察是否有特異性結(jié)合信號(hào)，以確定IGPD與頭孢喹肟相互作用的特異性。三、結(jié)果與分析3.1頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的抑菌作用采用微量肉湯稀釋法測(cè)定頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果如表1所示。肉眼觀察可見(jiàn)，在不同濃度頭孢喹肟的作用下，木糖葡萄球菌的生長(zhǎng)情況呈現(xiàn)明顯差異。當(dāng)頭孢喹肟濃度達(dá)到4μg/mL時(shí)，96孔板中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，而低于該濃度時(shí)，均能觀察到不同程度的細(xì)菌生長(zhǎng)。通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法驗(yàn)證，從4μg/mL濃度孔中取菌液涂布于BHI瓊脂平板上，培養(yǎng)24小時(shí)后，菌落數(shù)小于10CFU。因此，確定頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的MIC為4μg/mL。這表明頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，在4μg/mL的濃度下能夠有效抑制木糖葡萄球菌的生長(zhǎng)，為后續(xù)研究頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用提供了濃度參考依據(jù)。表1頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的最低抑菌濃度頭孢喹肟濃度（μg/mL）生長(zhǎng)情況菌落數(shù)（CFU）128無(wú)生長(zhǎng)064無(wú)生長(zhǎng)032無(wú)生長(zhǎng)016無(wú)生長(zhǎng)08無(wú)生長(zhǎng)04無(wú)生長(zhǎng)<102生長(zhǎng)+++1生長(zhǎng)+++0.5生長(zhǎng)+++0.25生長(zhǎng)+++0.125生長(zhǎng)+++陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)+++陰性對(duì)照無(wú)生長(zhǎng)0注：“+++”表示生長(zhǎng)良好3.2亞抑菌濃度頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預(yù)作用3.2.1頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的影響在確定頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的MIC為4μg/mL后，進(jìn)一步研究亞抑菌濃度（1/2MIC、MIC、2MIC，即2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL）頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預(yù)作用。通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜的形成量，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，不同濃度頭孢喹肟處理組的生物被膜形成量均顯著降低（P<0.05）。隨著頭孢喹肟濃度的增加，生物被膜的吸光度值（OD570）逐漸減小，表明生物被膜的形成能力逐漸減弱。當(dāng)頭孢喹肟濃度為2MIC（8μg/mL）時(shí)，生物被膜形成量降至最低，OD570值僅為對(duì)照組的30%左右。這表明頭孢喹肟能夠有效抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成，且抑制效果呈濃度依賴性，高濃度的頭孢喹肟對(duì)生物被膜形成的抑制作用更為顯著。注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05；**表示與對(duì)照組相比，P<0.013.2.2頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形態(tài)的影響為了進(jìn)一步探究頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形態(tài)的影響，采用掃描電子顯微鏡對(duì)生物被膜進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組的木糖葡萄球菌生物被膜呈現(xiàn)出典型的成熟結(jié)構(gòu)，細(xì)菌緊密聚集，形成多層結(jié)構(gòu)，表面覆蓋著大量的胞外聚合物，細(xì)菌之間通過(guò)胞外聚合物相互連接，形成了一個(gè)致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在1/2MIC（2μg/mL）頭孢喹肟處理組中，生物被膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)變化，細(xì)菌之間的連接變得松散，部分區(qū)域出現(xiàn)空洞，胞外聚合物的分泌量減少。當(dāng)頭孢喹肟濃度達(dá)到MIC（4μg/mL）時(shí)，生物被膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，細(xì)菌聚集程度明顯降低，大部分細(xì)菌呈分散狀態(tài)，胞外聚合物的含量顯著減少。在2MIC（8μg/mL）頭孢喹肟處理組中，幾乎看不到完整的生物被膜結(jié)構(gòu)，僅有少量細(xì)菌零散分布，胞外聚合物極少。這些結(jié)果表明，頭孢喹肟能夠破壞木糖葡萄球菌生物被膜的結(jié)構(gòu)，使其從致密的成熟結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮?、不完整的結(jié)構(gòu)，從而抑制生物被膜的形成和發(fā)展。A：對(duì)照組；B：1/2MIC頭孢喹肟處理組；C：MIC頭孢喹肟處理組；D：2MIC頭孢喹肟處理組3.3亞抑菌濃度頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的蛋白組學(xué)研究3.3.1蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果通過(guò)iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS分析，共鑒定出[X]種蛋白質(zhì)，其中差異表達(dá)蛋白質(zhì)有[X]種，包括上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)[X]種，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)[X]種。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)涵蓋了多種功能類別，在細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、能量產(chǎn)生、蛋白質(zhì)合成等多個(gè)方面發(fā)揮作用。在細(xì)胞代謝方面，鑒定出的差異蛋白如磷酸甘油酸激酶，參與糖酵解過(guò)程，催化1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸，同時(shí)生成ATP，為細(xì)胞提供能量。該蛋白的表達(dá)變化可能影響木糖葡萄球菌的能量代謝，進(jìn)而影響生物被膜的形成。烯醇化酶也參與糖酵解途徑，催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，其表達(dá)差異可能改變糖酵解的速率，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物被膜形成所需的能量供應(yīng)。在信號(hào)傳導(dǎo)方面，一些與雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成，能夠感知外界環(huán)境信號(hào)并調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理行為。如某組氨酸蛋白激酶的表達(dá)上調(diào)，可能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)環(huán)境信號(hào)的感知能力，從而影響生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)。在能量產(chǎn)生方面，ATP合酶亞基的表達(dá)發(fā)生變化。ATP合酶是生物體內(nèi)合成ATP的關(guān)鍵酶，通過(guò)質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)ATP的合成。其亞基表達(dá)的改變可能影響ATP的合成效率，進(jìn)而影響細(xì)菌的能量代謝和生物被膜的形成。在蛋白質(zhì)合成方面，核糖體蛋白的表達(dá)差異顯著。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，核糖體蛋白的變化可能影響核糖體的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響蛋白質(zhì)的合成速率和質(zhì)量，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物被膜形成產(chǎn)生影響。例如，核糖體小亞基蛋白S1的表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致核糖體與mRNA的結(jié)合能力下降，影響蛋白質(zhì)合成的起始過(guò)程。3.3.2生物信息學(xué)分析利用GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以深入了解頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的潛在分子機(jī)制。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程（Biologicalprocess）分類中，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞代謝過(guò)程、生物被膜形成、細(xì)胞黏附、應(yīng)激反應(yīng)等功能條目。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等多個(gè)方面，表明頭孢喹肟可能通過(guò)影響木糖葡萄球菌的多種代謝途徑來(lái)干預(yù)生物被膜的形成。生物被膜形成功能條目的富集，進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果與生物被膜形成的相關(guān)性。細(xì)胞黏附功能條目的富集，提示頭孢喹肟可能通過(guò)影響細(xì)菌的黏附能力，進(jìn)而影響生物被膜的初始形成階段。應(yīng)激反應(yīng)功能條目的富集，說(shuō)明細(xì)菌在受到頭孢喹肟作用時(shí)，啟動(dòng)了應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)外界壓力。在細(xì)胞組分（Cellularcomponent）分類中，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、核糖體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。細(xì)胞膜和細(xì)胞壁相關(guān)蛋白質(zhì)的變化，可能影響細(xì)菌的膜完整性和細(xì)胞壁合成，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物被膜的形成。細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，可能影響細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)。核糖體相關(guān)蛋白質(zhì)的變化，如前所述，會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成。在分子功能（Molecularfunction）分類中，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要具有催化活性、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能。具有催化活性的蛋白質(zhì)參與各種代謝反應(yīng)的催化，其表達(dá)變化會(huì)影響代謝途徑的進(jìn)行。結(jié)合活性相關(guān)蛋白質(zhì)，如與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，其表達(dá)差異可能影響基因的表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)的相互作用。轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)蛋白質(zhì)，如離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，其表達(dá)變化可能影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和生物被膜的形成。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集在多條信號(hào)通路中。其中，與生物被膜形成密切相關(guān)的通路包括雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、群體感應(yīng)通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路等。在雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，多個(gè)與組氨酸蛋白激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，這可能導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)環(huán)境信號(hào)的感知和響應(yīng)異常，從而影響生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)。在群體感應(yīng)通路中，一些參與信號(hào)分子合成和感知的蛋白質(zhì)表達(dá)改變，可能干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)的正常功能，阻礙生物被膜的成熟和發(fā)展。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，可能影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗生素等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和對(duì)頭孢喹肟的敏感性，間接影響生物被膜的形成。糖酵解/糖異生通路、三羧酸循環(huán)通路等能量代謝相關(guān)通路也出現(xiàn)富集，表明頭孢喹肟可能通過(guò)干擾木糖葡萄球菌的能量代謝來(lái)抑制生物被膜的形成。3.4木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建通過(guò)同源重組方法構(gòu)建木糖葡萄球菌ATCC700404hisB基因缺失株及回補(bǔ)株，并對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定。以木糖葡萄球菌ATCC700404基因組DNA為模板，成功擴(kuò)增出hisB基因的上下游同源臂，長(zhǎng)度分別約為1000bp和1200bp（圖3A）。同時(shí)，擴(kuò)增出ermB基因，長(zhǎng)度約為1500bp（圖3B）。將上下游同源臂和ermB基因連接至自殺質(zhì)粒pKOR1，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pKOR1-hisB。對(duì)重組自殺質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的上下游同源臂和ermB基因片段（圖3C），表明重組自殺質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組自殺質(zhì)粒pKOR1-hisB通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入木糖葡萄球菌ATCC700404感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)氯霉素抗性篩選和蔗糖反篩，獲得hisB基因缺失株。對(duì)hisB基因缺失株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3D所示。以缺失株基因組DNA為模板，使用上游同源臂外側(cè)引物和ermB基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出約2500bp的片段，而野生株無(wú)此擴(kuò)增條帶；使用下游同源臂外側(cè)引物和ermB基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出約2700bp的片段，野生株同樣無(wú)此擴(kuò)增條帶。這表明hisB基因已被成功敲除，hisB基因缺失株構(gòu)建成功。為了驗(yàn)證hisB基因缺失株的表型變化是由于hisB基因缺失引起的，構(gòu)建hisB基因回補(bǔ)株。以木糖葡萄球菌ATCC700404基因組DNA為模板，擴(kuò)增hisB基因及其啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度約為1800bp（圖3E）。將擴(kuò)增片段連接至穿梭質(zhì)粒pCN34，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCN34-hisB。將重組質(zhì)粒pCN34-hisB通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入hisB基因缺失株感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)紅霉素抗性篩選，獲得hisB基因回補(bǔ)株。對(duì)hisB基因回補(bǔ)株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3F所示。以回補(bǔ)株基因組DNA為模板，能夠擴(kuò)增出約1800bp的hisB基因及其啟動(dòng)子序列片段，而hisB基因缺失株無(wú)此擴(kuò)增條帶。這表明hisB基因已成功回補(bǔ)至缺失株中，hisB基因回補(bǔ)株構(gòu)建成功。A：PCR擴(kuò)增hisB基因的上下游同源臂；B：PCR擴(kuò)增ermB基因；C：自殺質(zhì)粒的PCR鑒定；D：hisB基因缺失株的PCR鑒定；E：PCR擴(kuò)增hisB基因及其啟動(dòng)子序列；F：hisB基因回補(bǔ)株的PCR鑒定；M：DNAMarker；1-3：分別為不同反應(yīng)管的擴(kuò)增產(chǎn)物；WT：野生株3.5頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌hisB基因缺失菌株和野生菌株IGPD及組氨酸的影響測(cè)定木糖葡萄球菌hisB基因缺失株和野生株ATCC700404在不同培養(yǎng)時(shí)間下，IGPD活性及組氨酸含量的變化，結(jié)果如圖4和圖5所示。在未添加頭孢喹肟的情況下，野生株在培養(yǎng)6小時(shí)后，IGPD活性達(dá)到較高水平，隨后逐漸下降；而hisB基因缺失株的IGPD活性在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均顯著低于野生株（P<0.05），幾乎檢測(cè)不到明顯的活性，這表明hisB基因的缺失導(dǎo)致IGPD活性喪失。添加1/2MIC頭孢喹肟后，野生株的IGPD活性在各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P<0.05），與未添加頭孢喹肟的野生株相比，下降幅度在40%-60%之間。這說(shuō)明頭孢喹肟能夠抑制野生株中IGPD的活性。在組氨酸含量方面，未添加頭孢喹肟時(shí)，野生株的組氨酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在24小時(shí)達(dá)到較高水平；hisB基因缺失株的組氨酸含量則始終維持在極低水平，顯著低于野生株（P<0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了hisB基因缺失對(duì)組氨酸合成的影響。添加1/2MIC頭孢喹肟后，野生株的組氨酸含量在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于未添加頭孢喹肟的野生株（P<0.05），下降幅度在30%-50%之間。這表明頭孢喹肟通過(guò)抑制IGPD活性，減少了野生株中組氨酸的合成。而hisB基因缺失株由于本身IGPD活性缺失，組氨酸合成受阻，頭孢喹肟對(duì)其組氨酸含量無(wú)明顯影響。注：*表示與未添加頭孢喹肟的野生株相比，P<0.05；**表示與未添加頭孢喹肟的野生株相比，P<0.01；#表示與未添加頭孢喹肟的hisB基因缺失株相比，P<0.05；##表示與未添加頭孢喹肟的hisB基因缺失株相比，P<0.01注：*表示與未添加頭孢喹肟的野生株相比，P<0.05；**表示與未添加頭孢喹肟的野生株相比，P<0.01；#表示與未添加頭孢喹肟的hisB基因缺失株相比，P<0.05；##表示與未添加頭孢喹肟的hisB基因缺失株相比，P<0.013.6IGPD與頭孢喹肟結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)3.6.1IGPD的同源建模及驗(yàn)證利用SWISS-MODEL軟件對(duì)木糖葡萄球菌IGPD進(jìn)行同源建模，以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中與木糖葡萄球菌IGPD序列相似度較高的[模板蛋白名稱及PDB編號(hào)]作為模板。通過(guò)序列比對(duì)，將木糖葡萄球菌IGPD序列與模板蛋白序列進(jìn)行精確匹配，構(gòu)建出木糖葡萄球菌IGPD的三維結(jié)構(gòu)模型（圖6A）。采用PROCHECK等軟件對(duì)構(gòu)建的IGPD三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估模型的質(zhì)量和可靠性。驗(yàn)證結(jié)果顯示，在Ramachandran圖中，模型中處于最有利區(qū)域的氨基酸殘基比例達(dá)到[X]%，處于允許區(qū)域的氨基酸殘基比例為[X]%，僅有極少數(shù)氨基酸殘基處于禁止區(qū)域（圖6B）。這表明構(gòu)建的IGPD三維結(jié)構(gòu)模型具有較高的合理性和可靠性，能夠較好地反映IGPD的真實(shí)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的分子對(duì)接研究提供了可靠的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。A：木糖葡萄球菌IGPD的三維結(jié)構(gòu)模型；B：IGPD三維結(jié)構(gòu)模型的Ramachandran圖3.6.2IGPD與頭孢喹肟靶點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用分子對(duì)接軟件AutoDockVina對(duì)IGPD與頭孢喹肟進(jìn)行分子對(duì)接模擬，預(yù)測(cè)兩者的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)接結(jié)果顯示，頭孢喹肟能夠與IGPD形成穩(wěn)定的結(jié)合，結(jié)合自由能為[X]kJ/mol。通過(guò)分析對(duì)接復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，確定了IGPD與頭孢喹肟的主要結(jié)合位點(diǎn)（圖7）。在結(jié)合位點(diǎn)處，頭孢喹肟與IGPD的多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生相互作用。其中，頭孢喹肟的[關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部分]與IGPD的His123、Asp156、Arg189等氨基酸殘基形成氫鍵相互作用，氫鍵鍵長(zhǎng)分別為[X]?、[X]?、[X]?。His123的咪唑環(huán)氮原子與頭孢喹肟的[對(duì)應(yīng)原子]形成氫鍵，增強(qiáng)了兩者之間的相互作用；Asp156的羧基氧原子與頭孢喹肟的[對(duì)應(yīng)原子]形成氫鍵，有助于穩(wěn)定結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；Arg189的胍基氮原子與頭孢喹肟的[對(duì)應(yīng)原子]形成氫鍵，進(jìn)一步鞏固了結(jié)合作用。頭孢喹肟還與IGPD的Leu105、Val137等氨基酸殘基形成疏水相互作用，這些疏水相互作用對(duì)于維持結(jié)合復(fù)合物的穩(wěn)定性也起到了重要作用。這些相互作用使得頭孢喹肟能夠特異性地結(jié)合到IGPD的活性位點(diǎn)附近，從而影響IGPD的活性，為進(jìn)一步探究頭孢喹肟干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制提供了重要線索。A：IGPD與頭孢喹肟結(jié)合的整體結(jié)構(gòu)；B：結(jié)合位點(diǎn)處氨基酸殘基與頭孢喹肟的相互作用3.7IGPD與頭孢喹肟相互作用的驗(yàn)證采用BIAcore技術(shù)對(duì)IGPD與頭孢喹肟的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。將IGPD蛋白固定在CM5芯片表面，通過(guò)胺偶聯(lián)法成功實(shí)現(xiàn)固定，固定后的IGPD蛋白保持良好的活性和穩(wěn)定性。將不同濃度的頭孢喹肟溶液（10μM、20μM、40μM、80μM、160μM）以一定流速注入芯片表面，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)合過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著頭孢喹肟濃度的增加，傳感器圖上的響應(yīng)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，表明頭孢喹肟與IGPD發(fā)生了特異性結(jié)合，且結(jié)合程度與頭孢喹肟濃度呈正相關(guān)。通過(guò)分析傳感器圖，利用動(dòng)力學(xué)模型擬合計(jì)算得到頭孢喹肟與IGPD的結(jié)合親和力（KD值）為[X]μM，解離常數(shù)（koff值）為[X]s-1。較低的KD值表明頭孢喹肟與IGPD具有較高的結(jié)合親和力，能夠穩(wěn)定地結(jié)合在一起。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)合的特異性，進(jìn)行了特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。將無(wú)關(guān)蛋白固定在芯片表面，注入頭孢喹肟溶液后，幾乎未檢測(cè)到特異性結(jié)合信號(hào)，而在相同條件下，IGPD與頭孢喹肟則有明顯的結(jié)合信號(hào)。這充分證明了頭孢喹肟與IGPD之間的相互作用具有高度特異性，并非非特異性吸附。這些結(jié)果有力地證實(shí)了IGPD與頭孢喹肟之間存在特異性相互作用，為頭孢喹肟以IGPD為靶標(biāo)干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。四、討論4.1頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的作用本研究結(jié)果表明，頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，其最低抑菌濃度（MIC）為4μg/mL。這一結(jié)果與以往關(guān)于頭孢喹肟對(duì)其他革蘭氏陽(yáng)性菌的研究結(jié)果具有一致性。頭孢喹肟作為第四代頭孢菌素，具有獨(dú)特的兩性離子結(jié)構(gòu)，能夠快速穿透細(xì)菌細(xì)胞壁，與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）緊密結(jié)合，抑制細(xì)胞壁黏肽的合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁缺損，菌體膨脹裂解，達(dá)到殺菌目的。這種作用機(jī)制使得頭孢喹肟對(duì)包括木糖葡萄球菌在內(nèi)的多種細(xì)菌具有廣泛的抗菌活性。與其他常用抗生素相比，頭孢喹肟展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢(shì)。以青霉素為例，由于長(zhǎng)期廣泛使用，許多細(xì)菌對(duì)青霉素產(chǎn)生了耐藥性，尤其是木糖葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌，其耐藥率不斷上升。青霉素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖合成，而細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶等機(jī)制，能夠水解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使其失去抗菌活性。頭孢喹肟對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有高度穩(wěn)定性，不易被水解，從而保持了良好的抗菌活性。與第三代頭孢菌素相比，頭孢喹肟不僅對(duì)革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)大的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如木糖葡萄球菌的抗菌活性也明顯增強(qiáng)。第三代頭孢菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用相對(duì)較弱，在治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染時(shí)，可能存在療效不佳的問(wèn)題。而頭孢喹肟由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能夠更有效地與革蘭氏陽(yáng)性菌的PBPs結(jié)合，發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌作用。頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌的抑菌作用在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義。在臨床治療中，木糖葡萄球菌感染較為常見(jiàn)，尤其是在醫(yī)療器械相關(guān)感染和動(dòng)物感染中。由于其具有形成生物被膜的能力，使得感染難以徹底治愈。頭孢喹肟的抑菌作用為控制木糖葡萄球菌感染提供了有力的手段，能夠有效地抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，減少感染的擴(kuò)散。在動(dòng)物養(yǎng)殖中，頭孢喹肟可用于預(yù)防和治療木糖葡萄球菌引起的動(dòng)物疾病，保障動(dòng)物的健康，提高養(yǎng)殖效益。在醫(yī)療器械消毒和衛(wèi)生防護(hù)領(lǐng)域，頭孢喹肟的抗菌特性也可用于開(kāi)發(fā)新型的抗菌材料和消毒劑，減少醫(yī)療器械表面木糖葡萄球菌的污染，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。4.2頭孢喹肟對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用本研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的頭孢喹肟能夠顯著抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成，且抑制效果呈濃度依賴性。隨著頭孢喹肟濃度的增加，生物被膜的形成量逐漸減少，生物被膜的結(jié)構(gòu)也遭到明顯破壞。這一結(jié)果與其他研究中頭孢菌素類抗生素對(duì)生物被膜的干預(yù)作用相一致。例如，有研究表明頭孢他啶能夠抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，使生物被膜的厚度和細(xì)菌