時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)①免疫熒光②放射免疫④化學(xué)發(fā)光⑥電化學(xué)發(fā)光

⑤時(shí)間分辨熒光③酶聯(lián)免疫標(biāo)記免疫技術(shù)得理論檢測(cè)靈敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶聯(lián)免疫 10-9-10-10mol化學(xué)發(fā)光 10-15mol時(shí)間分辨熒光10-18mol電化學(xué)發(fā)光 10-18mol一、時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)

(Time-resolvedfluorescenceimmunoassay)

背景介紹基本原理技術(shù)特點(diǎn)反應(yīng)模式背景介紹1979年,芬蘭Wallac公司研發(fā)部得Soini和Hemmila首次提出了建立稀土離子標(biāo)記物得“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論1983年,Soini和Kojola首先開(kāi)發(fā)出以鑭系元素為示蹤物得時(shí)間分辨熒光測(cè)量?jī)x,建立了新得非放射性微量分析檢測(cè)技術(shù)。同一年,Pettersson等人運(yùn)用此儀器首次對(duì)人絨膜促性腺激素

(hCG)進(jìn)行了時(shí)間分辨熒光免疫分析1984年,Hemmila確定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)這種時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)方案,從而使DELFIA成為Wallac得專利技術(shù)1988年,加拿大CyberFluor公司得Diamandis創(chuàng)立了一種不同于DELFIA得時(shí)間分辨熒光免疫分析,即FIAgen2003年,時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)基本原理三價(jià)稀土離子包括有銪(Eu),釤(Sm),鋱

(Tb),鏑

(Dy)等,她們得熒光光譜具有特異性強(qiáng)﹑Stokes位移大﹑壽命長(zhǎng)得特點(diǎn)DELFIA采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)為雙功能螯合試劑,其一端螯合Eu3+,另一端可與蛋白質(zhì)得-NH2連接。在中性或接近中性pH條件下,DTTA與Eu3+具有足夠得螯合穩(wěn)定性,而在增強(qiáng)液(呈酸性)作用下,DTTA-Eu又能將螯合得Eu3+迅速、徹底地釋放出來(lái)并與增強(qiáng)液中得配體螯合﹑進(jìn)入膠束得疏水內(nèi)核,使Eu3+熒光得以成千萬(wàn)倍地放大FIAgen采用得就是以Eu3+螯合物配基BCPDA為標(biāo)記物,通過(guò)檢測(cè)其與過(guò)量Eu3+形成得螯合物熒光進(jìn)行定量。由于BCPDA得可檢測(cè)性不夠理想,FIAgen需要利用生物素-親合素信號(hào)放大來(lái)彌補(bǔ)BCPDA檢測(cè)靈敏度得不足DELFIA標(biāo)記技術(shù)堿性時(shí)間:(μs)04008001000340nm激發(fā)光第二個(gè)循環(huán)熒光短壽命熒光613nm長(zhǎng)壽命熒光延遲時(shí)間測(cè)值時(shí)間通過(guò)時(shí)間延遲,將特異性熒光與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái),使理論本底達(dá)到0300400500600熒光強(qiáng)度激發(fā)光發(fā)射光波長(zhǎng)(nm)10大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢問(wèn)和交流TbDyEuSm500發(fā)射光強(qiáng)度2004000延遲時(shí)間(μs)600發(fā)射光波長(zhǎng)(nm)500發(fā)射光強(qiáng)度0延遲時(shí)間(μs)TRFIA技術(shù)特點(diǎn)極長(zhǎng)得熒光衰退時(shí)間銪:730000nsStokes位移大銪:激發(fā)光340nm,發(fā)射光613nm狹窄得發(fā)射峰解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬(wàn)倍固相包被抗體銪標(biāo)記抗體孵育Eu待測(cè)抗原++EuEu+增強(qiáng)液+Eu雙抗體夾心法示意圖雙抗原夾心法示意圖Eu++孵育+Eu孵育增強(qiáng)液+Eu固相包被抗原待測(cè)抗體銪標(biāo)記抗原中和法示意圖(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增強(qiáng)液++Eu待測(cè)抗體銪標(biāo)記抗體中和抗原小分子抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制示意圖固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待測(cè)抗原銪標(biāo)抗原Eu增強(qiáng)液++Eu一抗時(shí)間分辨技術(shù)重點(diǎn)和難點(diǎn)固定相(96孔板)標(biāo)準(zhǔn)品銪標(biāo)記物二、時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)

測(cè)試儀目前得TRFIA測(cè)試儀:國(guó)外儀器(Wa