第32講發(fā)酵工程【課標(biāo)要求】1.闡明在發(fā)酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的前提。2.闡明無(wú)菌技術(shù)是在操作過(guò)程中,保持無(wú)菌物品與無(wú)菌區(qū)域不被微生物污染的技術(shù)。3.舉例說(shuō)明通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的配方可有目的地培養(yǎng)某種微生物。4.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行微生物分離和純化的常用方法。5.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計(jì)數(shù)法是測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法。發(fā)酵工程是指利用微生物的特定功能，通過(guò)現(xiàn)代工程技術(shù)，規(guī)?；a(chǎn)對(duì)人類有用的產(chǎn)品。它涉及菌種的選育和培養(yǎng)、產(chǎn)物的分離和提純等方面。一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)二、泡菜的制作和原理三、果酒和果醋的制備四、發(fā)酵工程及其應(yīng)用考點(diǎn)一傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)及發(fā)酵工程的應(yīng)用一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)1.發(fā)酵的概念是指人們利用

，在適宜的條件下，將原料通過(guò)

轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。微生物微生物的代謝2.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)固體半固體有氧或無(wú)氧酵母、曲霉和毛霉等多種微生物(毛霉起主要作用)蛋白質(zhì)脂肪小分子的肽氨基酸甘油脂肪酸++蛋白酶脂肪酶①

原理:豆腐發(fā)酵中的毛霉電子顯微鏡下的毛霉腐

乳毛霉是一種絲狀真菌，其生殖方式為孢子生殖，代謝類型是異養(yǎng)需氧型。3.腐乳的制作②制作過(guò)程：讓豆腐上長(zhǎng)出毛霉加鹽、腌制加鹵湯裝瓶密封、腌制豆腐上生長(zhǎng)的白毛是毛霉的白色菌絲①防止雜菌污染,以避免豆腐的腐敗

②調(diào)味③析出豆腐水分，使豆腐變硬抑制微生物的生長(zhǎng)同時(shí)使腐乳有香味溫度保持在15-18℃；豆腐水分控制在70%左右。逐層加鹽，隨層數(shù)的加高而增加鹽量，腌制大約8天左右。鹵湯由酒及各種香辛料配制而成。封瓶時(shí)瓶口通過(guò)酒精燈火焰防止瓶口污染。3.腐乳的制作酒的濃度在12%左右，不能過(guò)高或過(guò)低？前期不密封，是要讓毛霉菌大量繁殖，從而形成外面一層皮；后期密封，主要是以增強(qiáng)口感為主，要控制毛霉的增長(zhǎng)1.原理:2.微生物:3.過(guò)程:C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量酶乳酸菌（常見乳酸桿菌、乳酸鏈球菌）乳酸菌：是一類發(fā)酵產(chǎn)物主要為乳酸的細(xì)菌總稱。

耐酸耐鹽、異養(yǎng)厭氧型。

分布：

應(yīng)用：

電鏡下的乳酸鏈球菌（球狀）

電鏡下的乳酸桿菌（桿狀）配制鹽水蔬菜處理裝壇加鹽水封壇發(fā)酵乳制品的發(fā)酵（如酸奶）、泡菜的腌制空氣、土壤、植物體表、人或動(dòng)物腸道無(wú)氧、常溫制作二、泡菜的制作和原理將新鮮蔬菜洗凈，切成塊狀或條狀，混合均勻，晾干后裝入泡菜壇內(nèi)；裝至半壇時(shí)，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，繼續(xù)裝至八成滿；用清水和食鹽配制質(zhì)量百分比為5%-20%的鹽水，并將鹽水煮沸，冷卻待用；將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中，使鹽水沒過(guò)菜料，蓋好壇蓋；配制鹽水蔬菜處理裝壇加鹽水封壇發(fā)酵向壇蓋邊緣的水槽中注滿水，在發(fā)酵過(guò)程中注意向水槽中補(bǔ)充水；根據(jù)室內(nèi)溫度控制發(fā)酵時(shí)間；過(guò)高：乳酸發(fā)酵受抑制，泡菜風(fēng)味差；（咸而不酸）過(guò)低：雜菌易繁殖，導(dǎo)致泡菜變質(zhì)。殺菌、除氧創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境泡菜發(fā)酵初期，大腸桿菌、酵母菌等較為活躍，產(chǎn)生較多的CO2，防止發(fā)酵液溢出壇外；防止因太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導(dǎo)致菜料變質(zhì)腐爛；留有一定空間，方便拿取泡菜。4.制作過(guò)程泡菜上的一層白膜，是酵母菌發(fā)酵形成的亞硝酸鹽含量的測(cè)定

在泡菜的腌制過(guò)程中會(huì)有亞硝酸鹽的產(chǎn)生。亞硝酸鹽含量較低時(shí)，不會(huì)危害健康。當(dāng)人體食入0.3-0.5克的亞硝酸鹽即可引起中毒，3克導(dǎo)致死亡。

腌制方法、時(shí)間長(zhǎng)短、溫度高低，都會(huì)影響亞硝酸鹽的含量。[擴(kuò)展]測(cè)定亞硝酸鹽含量檢測(cè)——比色法亞硝酸鹽經(jīng)過(guò)一定處理后變紅色，濃度越高，其顏色越深。與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，即可大概知道其濃度。在適宜的pH、溫度和一定的微生物作用下，亞硝酸鹽可以轉(zhuǎn)變成致癌物亞硝胺。泡菜制作過(guò)程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽含量的變化情況分析發(fā)酵時(shí)期乳酸菌乳酸亞硝酸鹽發(fā)酵初期發(fā)酵中期發(fā)酵后期曲線模型少（有氧氣，乳酸菌的活動(dòng)受到抑制）少最多（乳酸抑制其他菌活動(dòng)）減少（乳酸積累，pH下降，抑制其活動(dòng)）積累增多，pH下降繼續(xù)增多，pH繼續(xù)下降增加（硝酸鹽還原菌的作用）下降（硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解）下降至相對(duì)穩(wěn)定（硝酸鹽還原菌被完全抑制）[2013·全國(guó)Ⅰ卷]回答下列有關(guān)泡菜制作的習(xí)題：1）制作泡菜時(shí)，所用鹽水煮沸，目的是

。為了縮短制作時(shí)間，有人還會(huì)在冷卻后的鹽水中加入少量陳泡菜液，加入陳泡菜液的目的是____________________________________________________________________________。2）泡菜制作過(guò)程中，乳酸發(fā)酵過(guò)程即為乳酸菌

的過(guò)程。該過(guò)程發(fā)生在乳酸菌的

中。3）泡菜制作過(guò)程中影響亞硝酸鹽含量的因素有

、

和

等（課本P6）。4）從開始制作到泡菜質(zhì)量最佳這段時(shí)間內(nèi)，泡菜液逐漸變酸，這段時(shí)間內(nèi)泡菜壇中乳酸菌和其他雜菌的消長(zhǎng)規(guī)律是

，原因是：_____________________________________________。消毒殺菌“陳泡菜液”含乳酸菌，為泡菜發(fā)酵提供菌種

（課本P8擴(kuò)展應(yīng)用題2）無(wú)氧呼吸細(xì)胞質(zhì)溫度腌制方法腌制時(shí)間

乳酸菌比雜菌更耐酸乳酸菌數(shù)量增多雜菌數(shù)量減少

10[2023山東卷-T12]以下是以泡菜壇為容器制作泡菜時(shí)的4個(gè)處理：①沸鹽水冷卻后再倒入壇中；②鹽水需要浸沒全部菜料；③蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水；④檢測(cè)泡菜中亞硝酸鹽的含量。下列說(shuō)法正確的是（）A.①主要是為了防止菜料表面的醋酸桿菌被殺死B.②的主要目的是用鹽水殺死菜料表面的雜菌C.③是為了使氣體只能從泡菜壇排出而不能進(jìn)入D.④可檢測(cè)到完整發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量逐漸降低C11考向1泡菜的制作【典例1】(2022·天津模擬)參與泡菜發(fā)酵的微生物主要是乳酸菌，而在發(fā)酵初期，水槽內(nèi)經(jīng)常有氣泡產(chǎn)生，這些氣泡產(chǎn)生的原因及成分分別是()。

C12【訓(xùn)練1】(2022·江蘇聯(lián)考)有關(guān)泡菜中亞硝酸鹽含量的研究表明，亞硝酸鹽的含量高低和亞硝酸鹽含量峰值時(shí)間出現(xiàn)的早晚與食鹽的濃度有關(guān)（見下圖）。下列有關(guān)敘述<zzd>不正確</zzd>的是()。AA.食鹽的濃度越高，亞硝酸鹽生成越快，亞硝酸鹽含量峰值出現(xiàn)得早B.取食泡菜時(shí)，時(shí)間別太長(zhǎng)，防止空氣進(jìn)入C.臭味的產(chǎn)生可能與取食過(guò)程中帶入壇內(nèi)的油脂類物質(zhì)有關(guān)D.所用的食鹽水經(jīng)煮沸后可除去水中的氧氣并殺滅雜菌13三、果酒和果醋的制作1.菌種的比較比較項(xiàng)目菌種生物類群代謝類型菌種來(lái)源果酒制作?_________真核生物?_______________型主要是?_______________上的酵母菌果醋制作?_________?_______生物異養(yǎng)需氧型空氣中的醋酸菌或人工接種酵母菌異養(yǎng)兼性厭氧附著在葡萄皮醋酸菌原核142.制作原理與發(fā)酵條件的比較項(xiàng)目果酒制作果醋制作發(fā)酵原理

葡萄糖乙醇

溫度氧氣前期需要氧氣，后期?_____________需要?_____________時(shí)間18～3028

不需要氧氣充足的氧氣轉(zhuǎn)化效率較低效率高將發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用;用榨汁機(jī)榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋將溫度控制在18-30℃進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，每隔12h左右將瓶蓋擰松一點(diǎn)（注意：不是打開瓶蓋），此后再擰緊瓶蓋。發(fā)酵時(shí)間為10-12d?？赏ㄟ^(guò)從發(fā)酵瓶口取樣來(lái)對(duì)發(fā)酵的情況進(jìn)行檢測(cè)。取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干;除灰去污先清洗，再去梗：避免葡萄破損，減少雜菌污染①有氧條件，利于酵母菌快速繁殖；耗盡O2后，再進(jìn)行酒精發(fā)酵；②防止發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液溢出。無(wú)需多次。防止菌種減少，影響發(fā)酵排出氣體防止雜菌污染器具消毒沖洗葡萄榨汁裝瓶果酒發(fā)酵果醋發(fā)酵當(dāng)葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進(jìn)行葡萄醋的發(fā)酵。發(fā)酵溫度為30-35℃，時(shí)間為7-8d?？諝庵械拇姿峋鷷?huì)進(jìn)入果酒發(fā)酵液中大量繁殖3.制作流程①果酒：發(fā)酵液（會(huì)或不會(huì)）

出現(xiàn)氣泡；

紫色葡萄皮的

進(jìn)入發(fā)酵液,使葡萄酒呈

色。②果醋：一般（會(huì)或不會(huì)）

出現(xiàn)氣泡，

發(fā)酵完成時(shí)，在發(fā)酵液的液面會(huì)出現(xiàn)一層菌膜，是

菌膜。會(huì)花青素深紅不會(huì)醋酸菌③制酒過(guò)程中，還會(huì)存有

等微生物；

乳酸菌、醋酸菌發(fā)酵為醋酸使果酒變質(zhì)

控制乳酸菌數(shù)量

：

控制醋酸菌數(shù)量

：減少O2含量、調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度、pH調(diào)節(jié)發(fā)酵的溫度、pH等；4.注意事項(xiàng)如何評(píng)價(jià)果酒的制作是否成功？聞一聞，嘗一嘗有沒有酒味

用重鉻酸鉀檢測(cè)是否含有酒精如何評(píng)價(jià)果醋的制作是否成功？橙色灰綠色

看一看有無(wú)菌膜的形成聞一聞，嘗一嘗有沒有醋味

檢測(cè)比較醋酸發(fā)酵前后的pH值5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)思考：在實(shí)際生產(chǎn)中，釀酒大缸并非處于無(wú)菌環(huán)境中，但大缸發(fā)酵液很少有雜菌的污染，為什么？在缺氧、呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而生長(zhǎng)受到抑制通用發(fā)酵裝置充氣口排氣口出料口裝置的使用：使用該裝置制作果酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制作果醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接充氣泵，輸入空氣。排出酒精發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的CO2排氣口通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染長(zhǎng)而彎曲用來(lái)取樣,及時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)行的情況發(fā)酵前期充氣口打開，輸入無(wú)菌空氣讓酵母茵增殖，后期關(guān)閉充氣口，進(jìn)行酒精發(fā)酵；在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣6.果酒和果醋改進(jìn)裝置及其分析(P8“練習(xí)與應(yīng)用·拓展應(yīng)用3)19當(dāng)_______________時(shí)，C6H12O6＋2O2

2CH3COOH＋2H2O＋2CO2＋能量；當(dāng)____________時(shí)，C2H5OH＋O2

CH3COOH＋H2O＋能量比較項(xiàng)目果酒制作果醋制作泡菜制作微生物代謝類型原理C6H12O62C3H6O3＋能量溫度__________℃__________℃室溫O2、糖源充足

O2充足、缺少糖源

果酒、果醋和泡菜的制作比較C6H12O62C2H5OH＋2CO2＋能量酶酶酶酶18～3030～35酵母菌醋酸菌乳酸菌異養(yǎng)兼性厭氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)厭氧型比較項(xiàng)目果酒制作果醋制作泡菜制作檢測(cè)指標(biāo)可以嗅味和品嘗、用________________檢驗(yàn)酒精含量，進(jìn)行酵母菌的鏡檢、測(cè)定pH等工作通過(guò)觀察________的形成、嗅味和品嘗初步鑒定，再通過(guò)檢測(cè)和比較醋酸發(fā)酵前后的pH進(jìn)一步鑒定。還可以在顯微鏡下觀察發(fā)酵液中是否有醋酸菌泡菜的色澤和風(fēng)味，還可以通過(guò)在顯微鏡下觀察比較不同時(shí)期泡菜壇中乳酸菌的含量聯(lián)系制作果醋可在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行醋酸發(fā)酵酸性重鉻酸鉀

菌膜

果酒、果醋和泡菜的制作比較1.乳酸菌是在無(wú)氧條件下能將葡萄糖分解為乳酸的一類細(xì)菌的總稱。()√2.制作泡菜用到的乳酸菌是一種原核生物,只能進(jìn)行無(wú)氧呼吸。()√3.制作泡菜與制作果酒一樣,都需要氧氣。()×4.制作泡菜時(shí),鹽水煮沸后可以立即使用。()×5.泡菜制作過(guò)程中,向壇蓋邊沿的水槽中注滿水,以保證壇內(nèi)的無(wú)氧環(huán)境。()√6.在果酒制作過(guò)程中,應(yīng)先去除葡萄的枝梗,再進(jìn)行多次反復(fù)沖洗,這樣才可以洗得徹底。()×7.在果酒發(fā)酵后期,擰松瓶蓋的間隔時(shí)間可延長(zhǎng)。()√8.在制作果醋時(shí),如果條件適宜,醋酸菌可將葡萄汁中的糖分解成醋酸。()√9.果酒發(fā)酵瓶?jī)?nèi)留有一定空間有利于酵母菌的繁殖。()√

√1.（2021·海南·高考真題）關(guān)于果酒、果醋和泡菜這三種傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)物的制作，下列敘述正確的是（）A．發(fā)酵所利用的微生物都屬于原核生物 B．發(fā)酵過(guò)程都在無(wú)氧條件下進(jìn)行C．發(fā)酵過(guò)程都在同一溫度下進(jìn)行 D．發(fā)酵后形成的溶液都呈酸性D2.2022山東日照二?！洱R民要術(shù)》記載了一種稱為“動(dòng)酒酢(“酢”同“醋”)法”的釀醋工藝：“大率酒一斗，用水三斗，合甕盛，置日中曝之。七日后當(dāng)臭，衣(指菌膜)生，勿得怪也，但停置，勿移動(dòng)，撓攪之。數(shù)十日，醋成”。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.該方法的原理是醋酸菌在缺少糖源時(shí)可將乙醇最終轉(zhuǎn)化為乙酸B.加水的目的是對(duì)酒進(jìn)行稀釋，避免酒精濃度過(guò)高殺死醋酸菌C.“衣”位于變酸的酒表面，是由原酒中的酵母菌大量繁殖形成的D.撓攪有利于酒精與醋酸菌充分接觸，還可以增加溶液中的溶解氧C23(2)圖甲代表該發(fā)酵裝置，如果發(fā)酵后期，通氣口的開關(guān)被打開，一段時(shí)間后果酒變酸，這是由于酒精在__________的作用下生成了_______。圖乙中能表示該發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)液pH變化的曲線是_________。3．在生物世界，微生物雖然顯得過(guò)于微小，但在自然界卻作用非凡，在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用更是十分廣泛。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

(1)利用蘋果、梨、葡萄等水果制作果酒時(shí),其發(fā)酵階段所需的菌種是_______；在產(chǎn)生酒精時(shí)要控制的必要條件是___________________。酵母菌

無(wú)氧(密閉、密封)醋酸菌

醋酸

②四、發(fā)酵工程及其應(yīng)用1.發(fā)酵工程的概念(1)基本概念：發(fā)酵工程是指利用

的特定功能，通過(guò)____________，

規(guī)?；a(chǎn)對(duì)人類有用的產(chǎn)品。(2)基本環(huán)節(jié)：發(fā)酵工程一般包括__________,________,培養(yǎng)基的配制、

滅菌，接種，發(fā)酵，產(chǎn)品的___________等方面。微生物現(xiàn)代工程技術(shù)菌種的選育擴(kuò)大培養(yǎng)分離、提純2.發(fā)酵工程基本環(huán)節(jié)接種滅菌選育菌種擴(kuò)大培養(yǎng)配制培養(yǎng)基①?gòu)腳________中篩選②通過(guò)_______________________獲得自然界誘變育種或基因工程育種培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須嚴(yán)格滅菌獲得更多的菌種根據(jù)菌種選擇原料配置培養(yǎng)基。（需經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)才能確定）發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)①了解發(fā)酵進(jìn)程:隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中的_____________________等②及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分③嚴(yán)格控制________________等發(fā)酵條件微生物數(shù)量、產(chǎn)物濃度溫度、pH和溶解氧①發(fā)酵產(chǎn)品是微生物細(xì)胞本身：在發(fā)酵結(jié)束之后，采用_________等方法將菌體分離和干燥。②發(fā)酵產(chǎn)品是代謝物：根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采取適當(dāng)?shù)奶崛?、_________措施來(lái)獲得產(chǎn)品。過(guò)濾、沉淀分離和純化發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵分離、提純產(chǎn)物獲得產(chǎn)品2.發(fā)酵工程基本環(huán)節(jié)裝置編號(hào)主要用途A1-A3A4B1-B5C1、C2C3D1、D2發(fā)酵罐示意圖及功能介紹電動(dòng)機(jī)D1排氣管C3pH計(jì)B3冷卻水排出口C2冷卻夾層發(fā)酵液攪拌葉輪D2生物傳感器裝置B4空氣入口A4放料管A2A3閥門A1培養(yǎng)物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加入口B1觀察孔B2取樣管B5溫度傳感器和控制裝置C1冷卻水進(jìn)入口控制培養(yǎng)物以一定速度進(jìn)入、流出發(fā)酵罐，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)控制溶解氧通過(guò)肉眼觀察、儀器檢測(cè)等監(jiān)控發(fā)酵條件以及發(fā)酵過(guò)程，B2處抽取樣品進(jìn)一步檢測(cè)通過(guò)控制冷水流速調(diào)節(jié)罐溫調(diào)節(jié)罐壓電機(jī)帶動(dòng)葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)行攪拌，使微生物與發(fā)酵液混合均勻，加快氧氣溶解啤酒發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)流程及操作目的大麥種子發(fā)芽，釋放淀粉酶淀粉分解，形成糖漿酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳主發(fā)酵：酵母菌繁殖，大部分糖分解和代謝物生成。后發(fā)酵：在低溫、密閉的環(huán)境下儲(chǔ)存一段時(shí)間，形成澄清、成熟的啤酒?！舅伎肌び懻揚(yáng)25】“精釀”啤酒是小規(guī)模釀造產(chǎn)品，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量低價(jià)格高。它的制作工藝與普通啤酒有所不同，如：一般不添加食品添加劑、不進(jìn)行過(guò)濾和消毒處理等。有人認(rèn)為飲用“精釀”啤酒比飲用“工業(yè)”啤酒更健康，你怎么看待這問(wèn)題？我們?nèi)绾无q證看待大規(guī)模生產(chǎn)與小規(guī)模制作？一方面,這類產(chǎn)品具有多樣化的特點(diǎn),能夠滿足一些人對(duì)獨(dú)特口感的需求,或者滿足一些人的時(shí)尚追求。另一方面,這類產(chǎn)品是手工作坊式生產(chǎn)的,存在啤酒品質(zhì)不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴的問(wèn)題。302.發(fā)酵工程的應(yīng)用產(chǎn)物專一生產(chǎn)條件溫和原料來(lái)源豐富且價(jià)格低廉廢棄物對(duì)環(huán)境污染小且容易處理發(fā)酵工程的特點(diǎn)在食品工業(yè)上的應(yīng)用在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用在農(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用在其他方面的應(yīng)用發(fā)酵工程的應(yīng)用31a.生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品醬油大豆(主要原料)黑曲霉(蛋白酶)小分子肽和氨基酸淋洗、調(diào)制醬油的生產(chǎn)谷物或水果釀酒酵母各種酒類各種酒類的生產(chǎn)（1）在食品工業(yè)上的應(yīng)用b.生產(chǎn)各種各樣的食品添加劑添加劑類型舉例酸度調(diào)節(jié)劑L-蘋果酸、檸檬酸、乳酸增味劑5`-肌苷酸二鈉、谷氨酸鈉著色劑β-胡蘿卜素、紅曲黃色素增稠劑黃原膠、β-環(huán)狀糊精、結(jié)冷膠防腐劑乳酸鏈球菌、溶菌酶添加了檸檬酸的飲料（1）在食品工業(yè)上的應(yīng)用c.生產(chǎn)酶制劑果膠酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、氨基酸肽酶（2）在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用基因工程、蛋白質(zhì)工程與發(fā)酵工程相結(jié)合動(dòng)植物的基因微生物直接改造微生物轉(zhuǎn)入微生物病原體的抗原基因轉(zhuǎn)入發(fā)酵工程藥物藥物疫苗各種抗生素多種氨基酸多種激素多種免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥物（3）在農(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用a.生產(chǎn)微生物肥料b.生產(chǎn)微生物農(nóng)藥c.生產(chǎn)微生物飼料

利用微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、生物活性物質(zhì)等來(lái)增進(jìn)土壤肥力、改良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)植株生長(zhǎng)；抑制土壤中病原微生物的生長(zhǎng)，減少病蟲害的發(fā)生。利用微生物或其代謝物來(lái)防治病蟲害。

以淀粉或纖維素的水解液、制糖工業(yè)廢料等為原料，通過(guò)發(fā)酵獲得的大量微生物菌體，即單細(xì)胞蛋白?！锓乐危?）在其他方面的應(yīng)用1.解決資源短缺和環(huán)境污染問(wèn)題利用纖維廢料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等能源物質(zhì)2.對(duì)極端微生物（生活在高溫、高壓、高鹽和低溫環(huán)境）的利用利用嗜熱菌、嗜鹽菌生產(chǎn)洗滌劑嗜低溫菌有助于提高熱敏性產(chǎn)品的產(chǎn)量(1)在青霉素生產(chǎn)過(guò)程中如果污染了雜菌，某些雜菌會(huì)分泌酶將青霉素分解掉(

)(2)谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)：在中性和弱堿性條件下會(huì)積累谷氨酰胺；在酸性條件下則容易形成谷氨酸和N－乙酰谷氨酰胺(

)(3)以谷物或水果作原料，利用醋酸菌發(fā)酵生產(chǎn)各種酒類(

)(4)單細(xì)胞蛋白是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的大量微生物分泌蛋白(

)(5)發(fā)酵工程一般用半固體培養(yǎng)基(

)√××××判斷1.（2022·山東·高考真題）啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)中，大麥經(jīng)發(fā)芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、發(fā)酵、消毒等工序后，最終過(guò)濾、調(diào)節(jié)、分裝。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A．用赤霉素處理大麥，可使大麥種子無(wú)須發(fā)芽就能產(chǎn)生α-淀粉酶B．焙烤是為了利用高溫殺死大麥種子胚并進(jìn)行滅菌C．糖漿經(jīng)蒸煮、冷卻后需接種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵D．通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可減少啤酒酵母雙乙酰的生成，縮短啤酒的發(fā)酵周期B考向3發(fā)酵工程及應(yīng)用

唯一碳源稀釋涂布平板誘變育種、基因工程育種考向3發(fā)酵工程及應(yīng)用

考向3發(fā)酵工程及應(yīng)用

考向3發(fā)酵工程及應(yīng)用

蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等【訓(xùn)練3】我國(guó)是世界上啤酒的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。啤酒是以大麥為主要原料經(jīng)酵母菌發(fā)酵制成的，其工業(yè)化生產(chǎn)流程如下圖所示。其中發(fā)酵過(guò)程分為主發(fā)酵和后發(fā)酵兩個(gè)階段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代謝物的生成都在主發(fā)酵階段完成。主發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液還不適合飲用，要在低溫、密閉的環(huán)境下儲(chǔ)存一段時(shí)間進(jìn)行后發(fā)酵，這樣才能形成澄清、成熟的啤酒。發(fā)酵條件隨啤酒品種和口味要求的不同而有所差異。43（1）發(fā)酵工程一般包括菌種的選育，__________，培養(yǎng)基的配制，滅菌，接種，發(fā)酵，產(chǎn)品的分離、提純等方面。啤酒酵母的新陳代謝類型是________________。擴(kuò)大培養(yǎng)異養(yǎng)兼性厭氧型（2）在釀酒過(guò)程中常加入________（填某種植物激素）以縮短大麥發(fā)芽的時(shí)間，從而減少有機(jī)物的消耗。焙烤階段應(yīng)注意控制溫度，不能使________失活。赤霉素淀粉酶（3）發(fā)酵階段的底物是________，發(fā)酵液和發(fā)酵設(shè)備都必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的______處理。葡萄糖滅菌（4）請(qǐng)寫出在啤酒發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，可以使啤酒的產(chǎn)量和質(zhì)量得到明顯提高的一種工程手段：________________________________________________________________________________________________________________________________________。

（5）請(qǐng)寫出一種發(fā)酵工程在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的原因：____________________________________________________________________________。生產(chǎn)條件溫和；原料來(lái)源豐富且價(jià)格低廉；產(chǎn)物專一；廢棄物對(duì)環(huán)境污染小、易處理441.提供適宜的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境—配制培養(yǎng)基2.確保無(wú)其他菌種—無(wú)菌技術(shù)考點(diǎn)二微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)一、培養(yǎng)基1.概念：人們按照微生物對(duì)①___________的不同需求,配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)劃分培養(yǎng)基種類特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)化學(xué)成分功能不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂（易溶于沸水，熔化后的溶液溫度需降到40℃時(shí)才開始凝固）工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類鑒定。分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保存等含有天然成分，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)，降低成本由已知成分配制而成的培養(yǎng)基分類、鑒定添加（或缺少）某種化學(xué)成分培養(yǎng)、分離出特定微生物。添加某種指示劑或化學(xué)藥劑鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基2.種類：相當(dāng)于微生物的米飯3.營(yíng)養(yǎng)組成:碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽（基本成分）1）碳源：無(wú)機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-2）氮源：無(wú)機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、NH3等3）無(wú)機(jī)鹽：Ca、K、Mg、Na、Cl等各種有機(jī)物蛋白質(zhì)、核酸（調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持滲透壓）碳源、氮源、磷酸鹽、維生素等有機(jī)碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等碳源、氮源,維生素等有機(jī)氮源：蛋白胨、牛肉膏、尿素、氨基酸等此外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)_____、

以及_____________的需求。例如：PHO2特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)乳酸桿菌霉菌細(xì)菌厭氧微生物培養(yǎng)基特殊處理添加維生素調(diào)至酸性調(diào)至中性或弱堿性提供無(wú)氧條件二、無(wú)菌技術(shù)______________是獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵。防止雜菌污染1.無(wú)菌技術(shù)的含義：在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止____________的方法。包括___________和_____________。區(qū)別在于是否能夠把________________等所有微生物去除。雜菌污染消毒滅菌芽孢和孢子2.目的：無(wú)菌技術(shù)除用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么作用？（旁欄思考P10）除了防止雜菌污染同時(shí)避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。是研究和應(yīng)用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)。類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化生方法，殺死部分微生物強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學(xué)藥劑消毒生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線消毒紫外線照射30min灼燒滅菌接種工具、接種過(guò)程中的試管口、瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿、金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）培養(yǎng)基等,生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),以水蒸氣為介質(zhì)，在壓力為100kPa、溫度為121℃下維持15-30min接種室、接種箱、超凈工作臺(tái)常用的消毒和滅菌方法比較由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。1.相關(guān)概念：2.步驟：①配制培養(yǎng)基②滅菌③接種④分離⑤培養(yǎng)三、微生物的純培養(yǎng)在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體，成為培養(yǎng)物。培養(yǎng)物：純培養(yǎng)物：稀釋涂布平板3.酵母菌的純培養(yǎng)（1）原理：分散的微生物在適宜的_______培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體,這就是菌落。采用_________法和_______________法能將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上,之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。固體平板劃線（2）方法步驟（以平板劃線法為例）（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基—培養(yǎng)酵母菌）配制培養(yǎng)基滅菌倒平板培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌:100kPa、121℃，15-30min培養(yǎng)皿：干熱滅菌:160~170℃

，滅菌2h計(jì)算→稱量→溶化→定容將配好的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到錐形瓶滅菌。不用調(diào)pH,自然pH即可，其余培養(yǎng)基需要先調(diào)pH后再滅菌待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。1.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時(shí)開始倒平板？2.在倒平板的過(guò)程中，為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？3.為什么倒平板時(shí)，將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？4.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？5.在倒平板的過(guò)程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？倒平板具體操作P122.在倒平板的過(guò)程中，為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時(shí)，若低于50℃不及時(shí)操作，瓊脂會(huì)凝固。倒平板時(shí)高于50℃則會(huì)燙手。1.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時(shí)開始倒平板？3.為什么倒平板時(shí)，將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？防止雜菌污染培養(yǎng)基4.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染；避免培養(yǎng)基水分過(guò)快蒸發(fā)。5.在倒平板的過(guò)程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？不能；因?yàn)榭諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。54d.接種和分離純化酵母菌接種：指在無(wú)菌條件下將微生物或含菌材料轉(zhuǎn)移到合適其生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基中的過(guò)程。接種工具：接種針——用于穿刺接種；接種環(huán)——用于斜面接種或平板劃線接種；涂布器——用于涂布平板接種；接種的方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法、穿刺接種法、斜面接種法通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)過(guò)數(shù)次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。3.酵母菌的純培養(yǎng)配制培養(yǎng)基→滅菌→倒平板平板劃線法具體操作1）留意接種環(huán)滅菌的注意事項(xiàng)。2）劃線的注意事項(xiàng)。572.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？第一步灼燒接種環(huán)：第二次及之后劃線前灼燒：劃線操作結(jié)束時(shí)灼燒：殺死接種環(huán)上殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端。殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。避免接種環(huán)上可能存在的雜菌污染培養(yǎng)物。

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？避免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。將聚集的菌體逐步稀釋，以便獲得單個(gè)菌落。平板劃線法注意事項(xiàng)劃線時(shí)用力大小要適當(dāng),防止用力過(guò)大將培養(yǎng)基劃破完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。避免雜菌污染3.為什么倒平板和接種整個(gè)過(guò)程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行？1.未接種的培養(yǎng)基直接培養(yǎng)起什么作用？做空白對(duì)照，若培養(yǎng)后培養(yǎng)基表面無(wú)菌落，則說(shuō)明培養(yǎng)基沒有污染。e.培養(yǎng)酵母菌3.酵母菌的純培養(yǎng)配制培養(yǎng)基→滅菌→倒平板→接種，分離純化酵母菌2.為什么培養(yǎng)時(shí)需要把平板倒置？防止在培養(yǎng)過(guò)程中，因酵母菌呼吸作用產(chǎn)生的水分滴到培養(yǎng)基上，造成污染。1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)，如果有，說(shuō)明了什么？2.在接種酵母菌的培養(yǎng)基上，你是否觀察到了菌落？這些菌落的顏色、形狀、大小是否一致？如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落，你能分析可能是哪些原因引起的嗎？沒有。

如果有，說(shuō)明培養(yǎng)基被雜菌污染。原因：接種的菌種不純、無(wú)菌操作不規(guī)范。e.培養(yǎng)酵母菌3.酵母菌的純培養(yǎng)配制培養(yǎng)基→滅菌→倒平板→接種，分離純化酵母菌①接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次②每次劃線都是從上一次劃線的末端開始劃線③最后一次劃線不能與第一次劃線相連④每次劃線前接種環(huán)進(jìn)行滅菌平板劃線法注意事項(xiàng):思考：若完成圖示操作，接種環(huán)需灼燒滅菌了幾次？6[細(xì)節(jié)]若想得到“鯨落”中某目標(biāo)菌種，可用平板劃線法進(jìn)行純化。若下圖甲是接種培養(yǎng)后的菌落分布圖，對(duì)應(yīng)的平板劃線操作示意圖為________。丙[2018·全國(guó)卷Ⅱ]在生產(chǎn)、生活和科研實(shí)踐中，經(jīng)常通過(guò)消毒和滅菌來(lái)避免雜菌的污染?；卮鹣铝袉?wèn)題： (1)在實(shí)驗(yàn)室中，玻璃和金屬材質(zhì)的實(shí)驗(yàn)器具

(填“可以”或“不可以”)放入干熱滅菌箱中進(jìn)行干熱滅菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時(shí)消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是_________________________________________________________。(3)密閉空間內(nèi)的空氣可采用紫外線照射消毒，其原因是紫外線能_______________________

________________。在照射前，適量噴灑

_____________________，可強(qiáng)化消毒效果。(4)水廠供應(yīng)的自來(lái)水通常是經(jīng)過(guò)

(填“氯氣”“乙醇”或“高錳酸鉀”)消毒的?？梢栽谶_(dá)到消毒目的同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較少紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能破壞DNA的結(jié)構(gòu)氯氣石炭酸和煤酚皂考點(diǎn)三微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)1.自然界中目的菌株篩選的依據(jù)：根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求,到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2.實(shí)驗(yàn)室中：配制選擇培養(yǎng)基一、選擇培養(yǎng)基1.定義：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。纖維素分解菌思路：①在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。②改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。例如，缺乏氮源時(shí)可以分離固氮微生物；石油作為唯一碳源時(shí)，可以分離出能消除石油污染的微生物；用含無(wú)機(jī)碳源的培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物。③改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物；用普通培養(yǎng)基在無(wú)氧條件下分離厭氧型和兼性厭氧型微生物。類型條件分離得到的菌種改變培養(yǎng)條件70～80℃的高溫添加某種化學(xué)物質(zhì)加入青霉素特殊碳、氮源石油是唯一碳源以纖維素為唯一碳源培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺陷不加碳源不加氮源水生棲熱菌酵母菌、霉菌等真菌能消除石油污染的微生物自養(yǎng)型微生物固氮型微生物2.種類：【典例】據(jù)培養(yǎng)基的配方表，回答下列問(wèn)題：KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml培養(yǎng)基一培養(yǎng)基二1.從物理性質(zhì)看，兩種培養(yǎng)基屬于哪類？依據(jù)是什么？培養(yǎng)基的主要用途是什么？固體培養(yǎng)基的主要用途：分離、鑒定、計(jì)數(shù)。2.從用途上來(lái)講，哪個(gè)屬于選擇培養(yǎng)基？將得到何種細(xì)菌？原因是？可獲得能分解尿素的微生物。3.兩種培養(yǎng)基中共有哪些成分？碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽都屬于固體培養(yǎng)基。依據(jù)是添加了凝固劑——瓊脂。培養(yǎng)基二KH2PO41.2gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml以尿素為唯一氮源。4.選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)（以篩選能分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基為例）

（2）培養(yǎng)基配方：碳源、無(wú)機(jī)鹽、水,以尿素作為⑨_____________。脲酶

氮源唯一的氮源1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌？分離：獲得分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物計(jì)數(shù)：測(cè)定分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量稀釋涂布平板法——將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。注意：稀釋度足夠高時(shí)，能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。二、微生物的選擇培養(yǎng)稀釋涂布平板法系列稀釋（梯度稀釋）涂布平板1.梯度稀釋①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中1ⅹ101ⅹ1071ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL1mL1ⅹ105注意：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的紙袋在使用前都要滅菌——稀釋涂布平板法②將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。90mL無(wú)菌水9mL無(wú)菌水1mL二、微生物的選擇培養(yǎng)③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。注意：各濃度分別涂布3個(gè)或3個(gè)以上平板（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）注意：多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。2.涂布平板——稀釋涂布平板法1071061031021041mL1mL1mL1mL9mL無(wú)菌水1mL1051.梯度稀釋移液槍二、微生物的選擇培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱稀釋104倍稀釋105倍稀釋106倍空白對(duì)照細(xì)菌一般選用104、105、106稀釋倍數(shù)的菌液進(jìn)行涂布培養(yǎng)。

待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將已接種的和未接種的平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2d。3.菌落培養(yǎng)——稀釋涂布平板法二、微生物的選擇培養(yǎng)①原理：在稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基上表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，可推測(cè)出樣品中大約有多少活菌。②要求:①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②同一稀釋度至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求平均值。（重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少誤差）。③缺點(diǎn):統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)表示?！驹颍寒?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落?！糠治鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。4.計(jì)數(shù)——稀釋涂布平板法二、微生物的選擇培養(yǎng)甲同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個(gè)平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時(shí)均使用0.1ml菌液，試計(jì)算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。（80+90+100）/30.1×105=9×107個(gè)4.計(jì)數(shù)——稀釋涂布平板法二、微生物的選擇培養(yǎng)方法平板劃線法稀釋涂布平板法純化原理接種工具單菌落的獲得用途接種效果圖相同點(diǎn)通過(guò)連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散將菌液進(jìn)行一系列的等比稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)，以得到單菌落。接種環(huán)涂布器從最后劃線區(qū)挑取稀釋度合適的整個(gè)平板上都可找到單菌落分離純化菌種，獲得單菌落①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計(jì)數(shù)①都能分離純化菌種

②都在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行的平板劃線法vs稀釋涂布平板法（間接計(jì)數(shù)法）稀釋涂布平板法實(shí)驗(yàn)操作三、微生物的數(shù)量測(cè)定血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法細(xì)菌計(jì)數(shù)板間接計(jì)數(shù)法：稀釋涂布平板法數(shù)量測(cè)定方法平板劃線法只能分離純化，不能計(jì)數(shù)1ml原液細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)注意：統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。結(jié)果偏大結(jié)果偏小76項(xiàng)目間接計(jì)數(shù)法（稀釋涂布平板法）直接計(jì)數(shù)法（顯微鏡計(jì)數(shù)法）原理當(dāng)樣品的?_________足夠高時(shí),培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落,來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)?_______,通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù),就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,在顯微鏡下計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量缺點(diǎn)當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)菌體連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落不能區(qū)分細(xì)胞死活結(jié)果比實(shí)際值偏?_____比實(shí)際值偏?_____稀釋度活菌小大間接計(jì)數(shù)法vs直接計(jì)數(shù)法三、微生物的數(shù)量測(cè)定四、實(shí)驗(yàn)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)提出問(wèn)題1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌2.統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌；再通過(guò)稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)?；A(chǔ)知識(shí)土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察(細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源：NH3-

、NH4+再轉(zhuǎn)化為等被植物吸收)尿素NH3尿素分解菌脲酶做出假設(shè)①提供無(wú)機(jī)鹽②調(diào)節(jié)pH制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)照作用，從而驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基是否有選擇分解尿素的細(xì)菌的作用為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？①碳源②提供能量四、實(shí)驗(yàn)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察A取樣地：酸堿度接近中性的潮濕土壤中。B取樣：鏟去表層土（一般3cm左右）。測(cè)土壤細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。測(cè)土壤酵母菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液。

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300、適于計(jì)數(shù)的平板。四、實(shí)驗(yàn)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察1）每個(gè)濃度設(shè)置了

個(gè)平板，1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基（

實(shí)驗(yàn)），4為

培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）；2）另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)還要設(shè)置

個(gè)空白對(duì)照平板：未接種的

。培養(yǎng)基，以驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌。4重復(fù)牛肉膏蛋白胨2選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨四、實(shí)驗(yàn)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。觀察：每隔

統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取

時(shí)的記錄作為結(jié)果。防止

。結(jié)果：一般來(lái)說(shuō)，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致菌落數(shù)目遺漏24h菌落數(shù)目穩(wěn)定四、實(shí)驗(yàn)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察

2）無(wú)菌操作3）做好標(biāo)記

本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標(biāo)記4）制定計(jì)劃對(duì)于耗時(shí)較長(zhǎng)的生物實(shí)驗(yàn)，要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高工作效率，在操作時(shí)更加有條不紊1