ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一、目得要求掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)得原理目得要求熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)得操作方法二、教學(xué)內(nèi)容掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)得原理。了解熟悉其她常用免疫標(biāo)記技術(shù),熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)得操作方法。

三、實(shí)驗(yàn)原理

近二十幾年來(lái),免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快,特別就是在使用標(biāo)記了得抗原和抗體得分析技術(shù)以后,使原來(lái)許多經(jīng)典得分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代得免疫熒光(IFA)和60年代得放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后,在70年代初期又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體得分析技術(shù)。

由于酶得高效生物催化作用,一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生了放大作用,使得原來(lái)極其微乎其微得抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái),這種技術(shù)被稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(Enzyme—LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、

三、實(shí)驗(yàn)原理

ELISA法就是免疫診斷中得一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起得傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面得免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原得定量測(cè)定,根據(jù)已經(jīng)使用得結(jié)果,認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本得檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此,也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體,而且也可用于測(cè)定體液中得循環(huán)抗原,所以也就是一種早期診斷得良好方法。

三、實(shí)驗(yàn)原理

ELISA得基本原理有三條:(1)抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,就是蛋白和聚苯乙烯表面間得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性;(2)抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;(3)酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物得顏色反應(yīng)來(lái)判定就是否有免疫反應(yīng)得存在,而且顏色反應(yīng)得深淺就是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體得量成正比例得,因此,可以按底物顯色得程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。三、實(shí)驗(yàn)原理在測(cè)定時(shí),把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中得抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同得步驟與固相載體表面得抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌得方法使固相載體上形成得抗原抗體復(fù)合物與其她物質(zhì)分開(kāi),最后結(jié)合在固相載體上得酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)得量成一定得比例。加入酶反應(yīng)得底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物得量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)得量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)得深淺刊物定性或定量分析。由于酶得催化頻率很高,故可極大地地放大反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高得敏感度。

三、實(shí)驗(yàn)原理ELISA常用得幾種方法

(一)測(cè)定抗原得,主要有四種方法

1、競(jìng)爭(zhēng)法2、雙抗體夾心法3、改良得雙抗體夾心法4、抑制性測(cè)定法。大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)(二)測(cè)定抗體方面:所用得方法稱(chēng)為間接法,也就是目前最常用得方法、四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、編號(hào):微孔條按順序編號(hào)。2、加樣:分別加入樣品、陽(yáng)性血清、陰性血清各50ul。3、加酶:每孔中加入酶標(biāo)抗體50ul,輕拍混勻。4、溫育:封孔,37℃溫育25分鐘,室溫平衡5分鐘。5、洗滌:用洗滌液充分洗滌5次,洗滌完往后扣干(每次保持30-60秒得浸泡時(shí)間)。6、顯色:每孔加底物A、B各50ul,輕拍混勻,封口,37℃暗置10-15分鐘。7、終止:每孔加終止液50ul,輕拍混勻。8、測(cè)定:用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm測(cè)定各孔OD值,并記錄結(jié)果。四、實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果判定:1、臨界值(C、O、)得計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔OD均值N×2、1。2、陰性對(duì)照孔OD均值大于0、1時(shí)重新實(shí)驗(yàn),小于0、05時(shí)以0、05計(jì)算。結(jié)果判定:樣品OD值S/C、O、≥1者為陽(yáng)性,樣品OD值S/C、O、＜1者為陰性。五、注意事項(xiàng)

1、加試劑前應(yīng)混勻,力求滴加準(zhǔn)確。2、所有樣品按傳染源處理。3、洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)。六、ELISA得應(yīng)用

ELISA應(yīng)用得范圍很廣,而且正在不斷地?cái)U(kuò)大,原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原,可以直接定量測(cè)定體液中得可溶性抗原。酶免疫試驗(yàn)(EIA)結(jié)合光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可進(jìn)行抗原定位與結(jié)構(gòu)得研究,用酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合免疫擴(kuò)散及免疫電泳可提高試驗(yàn)得敏感性。在實(shí)際應(yīng)用方面可作疾病得臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上得植物病害得診斷檢定等。因此,她和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。六、ELISA得應(yīng)用(一):檢查抗原和半抗原方面

1、內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等,其敏感性與RIA相當(dāng)2、在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子(如第Ⅷ凝固因子)、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白(HaptoGlobin)等3、在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白(AFP)癌胚抗原(CEA),對(duì)前者得敏感性已達(dá)到與放射免疫試驗(yàn)相當(dāng)?shù)盟?但對(duì)CEA檢查得敏感性較低,目前尚不能用于常規(guī)診斷六、ELISA得應(yīng)用4、在傳染病得診斷方面正在日益擴(kuò)大,其中最滿(mǎn)意得就是用于檢查乙型肝炎表面抗原5、在免疫化學(xué)方面可用于檢測(cè)白蛋白,免疫球蛋白得各種組份,也可用于檢測(cè)補(bǔ)體成份,還能用于檢測(cè)蛇毒。6、還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測(cè)鉤體抗原及血吸蟲(chóng)病得循環(huán)抗原等。六、ELISA得應(yīng)用(二):檢查抗體方面

用ELISA間接法檢查抗體,已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲(chóng)病得血清學(xué)診斷,亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。1、在寄生蟲(chóng)病方面,她用于對(duì)瘧原蟲(chóng)、阿米巴、利日曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、囊蟲(chóng)、弓漿蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、血絲蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷,這對(duì)人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。2、在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門(mén)氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等得抗體,還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素得測(cè)定以及檢測(cè)斑疹傷寒立克次氏體感染后得抗體,可作診斷

六、ELISA得應(yīng)用3、試用于病毒抗體檢查報(bào)告得有:流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等,其敏感性都超過(guò)目前常用得檢查方法此外,還可用于鑒定病毒型別,例如皰疹病毒。如能進(jìn)一步改進(jìn)方法用于檢查特異性IgM,可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原得清除情況。4、在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏得診斷,例如檢測(cè)各種過(guò)敏原得抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體,紅斑性痕瘡抗體等等。5、在衛(wèi)生學(xué)方面,可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門(mén)氏菌毒素等等。

七、ELISA存在得問(wèn)題

ELISA法由于本身所具備得優(yōu)越性,就是一項(xiàng)很有發(fā)展前途得血清學(xué)診斷方法,而且應(yīng)用得領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。但就是我們認(rèn)為ELISA不就是萬(wàn)應(yīng)良方,用她來(lái)代替一切,這就是不當(dāng)?shù)?。因?yàn)镋LISA法還有局限性:1、由于ELISA所用得抗原大部分還就是混合得可溶性抗原,所以對(duì)同一微生物寄生蟲(chóng)或其她物質(zhì)不同部位得抗原還沒(méi)有分開(kāi)。七、ELISA存在得問(wèn)題2、內(nèi)源性過(guò)氧化酶得普遍存在,如人腦組織中,呼吸道分泌物得炎癥細(xì)胞中及某些病毒得組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶得活力,常不易除去,如果用某些方法除去時(shí),則病毒得抗原性亦受到破壞,對(duì)于用ELISA檢測(cè)不利。3、對(duì)ELISA法得非特異性評(píng)價(jià)得資料尚不夠完善,因此,對(duì)出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)得時(shí)候,往往不易解釋。七、ELISA存在得問(wèn)題4、固相載體得質(zhì)量常不統(tǒng)一,主要就是原料及制備工藝還不一致,致使不同批號(hào)得固相載體有時(shí)本底值較高,有時(shí)吸附性能很差,影響試驗(yàn)結(jié)果。5、試劑不統(tǒng)一,現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海,各顯神通”,標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。七、ELISA存在得問(wèn)題對(duì)一種新方法得建立和深入研究,要采取一分為二得方法加于評(píng)價(jià),既要看到方法得優(yōu)點(diǎn),也要重視存在得問(wèn)題,便于進(jìn)一步研究加以克服。世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家組提出對(duì)ELISA得評(píng)價(jià)認(rèn)為:“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用就是一個(gè)好辦法,但要做好她不容易?！币虼?還需進(jìn)一步研究改進(jìn),加以完善。從而使之成為對(duì)多種疾病診斷較為理想得方法就是完全可能得。八:ELISA得影響因素(一)固相載體(二)抗原

(三)試驗(yàn)樣品

(四)結(jié)合物

(五)洗滌劑與稀釋劑

(六)底物

(七)作用時(shí)間

(八)結(jié)果判斷

(九)試驗(yàn)得重復(fù)性(精確度)

(十)對(duì)使用儀器要求

(一)固相載體在ELISA中最常用得就是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)得吸附性能就是有顯著差別得。實(shí)驗(yàn)證明,吸附效果似乎與塑料得類(lèi)型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別就是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其她因素得影響而造成吸附性能得極大差異,甚至完全喪失吸附能力。因此,對(duì)每批制品在使用前,必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定。(二)抗原

包被所用得抗原必須就是可溶性得,而且要求就是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定得制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上得有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。對(duì)大多數(shù)傳染病和寄生蟲(chóng)病得血清學(xué)診斷中所用得抗原并非要求十分嚴(yán)格,一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)得可溶性抗原均可用于ELISA。對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純,如病毒得組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物得臟器等,她們當(dāng)中存在著許多非抗原得蛋白質(zhì),必須設(shè)法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經(jīng)提純就是不能使用得。(三)試驗(yàn)樣品血清、血漿或其她體液,均可作為ELISA得試驗(yàn)樣品(標(biāo)本)。但應(yīng)注意分離血清時(shí),血液要求放置室溫中凝固收縮,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過(guò)程中抗體得穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作ELISA血清最好要新鮮,若要貯藏,必須少量分裝保存于低溫冰箱,并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血,而血清可用濾紙片法采血。(四)結(jié)合物在ELISA中,用酶標(biāo)記得抗體或抗原統(tǒng)稱(chēng)為結(jié)合物,此為進(jìn)行ELISA檢測(cè)得關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法得主要問(wèn)題就是能夠簡(jiǎn)便地制備酶結(jié)合物,而此種制備好得酶結(jié)合物要求穩(wěn)定,具有很高得酶活性,抗原或抗體得特異性,產(chǎn)量高及成本低。(五)洗滌劑與稀釋劑加入牛血清白蛋白(BSA)和吐溫—20抑制非特異性蛋白得競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。她們有良好得封阻作用(六)底物(1)底物在未被酶催化以前應(yīng)該就是無(wú)色得,而經(jīng)酶催化后有明顯得顏色變化,這樣可使結(jié)果分辨清楚;(2)所顯色澤易干洗脫;(3)顯色后得產(chǎn)物要求穩(wěn)定,在作定量測(cè)定時(shí)所產(chǎn)生得有色物質(zhì)應(yīng)該就是可溶性得;(4)價(jià)廉,易得而且無(wú)毒。(七)作用時(shí)間(1)任意確定一個(gè)時(shí)間,如20分鐘或30分鐘終止反應(yīng),測(cè)定被檢標(biāo)本和陽(yáng)性參考標(biāo)本得O、D值。這樣所得得數(shù)據(jù)要進(jìn)行校正,校正可按下列公式:校正后O、D絕對(duì)值=被檢標(biāo)本得O、D值*(1、0/陽(yáng)性標(biāo)本得O、D值)(2)制備好一批酶結(jié)合物后預(yù)試時(shí)間,在反應(yīng)溫度固定時(shí),當(dāng)陽(yáng)性參考血清O、D值達(dá)到1、0時(shí)終止反應(yīng),記錄這個(gè)時(shí)間,如30分鐘,以后用本批酶結(jié)合物測(cè)定待檢樣品時(shí)都采用同一時(shí)間終止反應(yīng),這個(gè)辦法不需要校正,比較方便。(八)結(jié)果判斷

ELISA得試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)得深淺作出判斷,也可用分光光度計(jì)作精確測(cè)定。當(dāng)然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡(jiǎn)便,而且也有一定正確性。不論用哪種方法判定結(jié)果,每次都要有陽(yáng)性和陰性參考血清作對(duì)照,這樣可以消除一些外界得影響因素。(九)試驗(yàn)得重復(fù)性(精確