IICSCS01.040.65

CCSB04TB

團體標準

T/NAIA×××-××××

枸杞中3種酚酸和3種黃酮化合物的測定

高效液相色譜法

DeterminationofthreephenolicacidsandthreeflavonoidcompoundsinLycium

barbarum．

—Highperformanceliquidchromatography

枸杞中3種酚酸和3種黃酮化合物的測定

高效液相色譜法

1.范圍

本文件規(guī)定了本文件適用于枸杞子及枸杞原漿中1-咖啡酰奎寧酸、綠原酸、4-香豆酸、蘆丁、

山奈酚、水仙苷的高效液相色譜測定方法。

本文件適用于枸杞子及枸杞原漿中上述3種酚酸和3種黃酮化合物單個或多個成分含量的測定,

其他枸杞制品中這3種酚酸和3種黃酮化合物的測定也可以參考本方法。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3.術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4.原理

試樣中的酚酸類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)經(jīng)60%乙醇溶液提取，用高效液相色譜法測定，外標法定量。

5.試劑與材料

除另有說明外，在分析中僅使用確認為分析純的試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級水

5.1試劑

5.1.1無水乙醇（CH3CH2OH，CASNO.64-17-5）。

5.1.2甲醇（CH3OH.，CASNO.67-56-1）：色譜純。

5.1.3乙腈（C2H3N,，CASNO.75-05-8）：色譜純。

5.1.4冰醋酸（CH3COOH，CASNO.64-19-7）：色譜純。

5.2溶液配制

5.2.160%乙醇溶液：將300mL無水乙醇（5.1.1）加入到500mL容量瓶中，用水定容，混勻。

5.2.20.5%醋酸溶液：將0.5mL冰醋酸（5.1.4）加入到100mL容量瓶中，用水定容，混勻脫氣。

5.3標準品

標準品為經(jīng)國家市場監(jiān)督管理總局批準的標準物質(zhì)或標準樣品，見附錄A表A.1。

5.4標準溶液配制

5.4.1綠原酸、4-香豆酸、蘆丁、山奈酚、水仙苷標準儲備溶液①：精密稱取綠原酸、4-香豆酸、

蘆丁、山奈酚、水仙苷標準品約10mg，分別置于10mL容量瓶中，用60%乙醇溶液溶解（5.2.1）

并定容刻度，混勻。

5.4.2綠原酸、4-香豆酸、蘆丁、山奈酚、水仙苷標準儲備溶液②：精密量取綠原酸、4-香豆酸、

蘆丁、山奈酚、水仙苷標準儲備液①（5.4.1）1mL、1mL、4mL、0.5mL、1mL，分別置25mL的

容量瓶中，用60%乙醇溶液（5.2.1）定容至刻度，混勻。

5.4.31-咖啡?？鼘幩針藴蕛淙芤孩伲壕芊Q取1-咖啡?？鼘幩針藴势芳s10mg置于25mL容量

瓶中，用60%乙醇溶液（5.2.1）溶解并定容刻度，混勻。

5.4.41-咖啡?？鼘幩針藴蕛淙芤孩冢壕芰咳?-咖啡?？鼘幩針藴蕛淙芤孩伲?.4.3）1.25mL

置25mL的容量瓶中，用60%乙醇溶液（5.2.1）定容至刻度，混勻。

5.5微孔濾膜

0.45μm，有機相。

6.儀器

6.1高效液相色譜儀，配有DAD檢測器。

6.2分析天平，感量0.000001g、感量0.00001g。

6.3超純水機。

6.4高速粉碎機，460w，24000rpm。

6.5超聲波清洗儀。

7.試樣制備與保存

取-18℃冷凍的干燥枸杞子，去除果蒂、葉子等雜質(zhì)，干法粉碎，混勻備用。

枸杞原漿、枸杞全漿搖勻備用。

8.分析步驟

8.1提取

取枸杞子粉末約1.0g，枸杞原漿、枸杞全漿約7.0g，精密稱定（精確至0.0001g），置25mL

容量瓶中，加60%乙醇溶液（5.2.1）20mL，超聲20min，放置至室溫，用60%乙醇溶液（5.2.1）

定容至刻度，混勻，用0.45μm的濾膜（5.5）過濾，取續(xù)濾液上機測定。

8.2液相色譜參考條件

色譜柱：C18柱，長150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm(pH=1~11)或相當者。

流動相A：乙腈；流動相B：0.5%醋酸溶液（5.2.2）；梯度洗脫條件見表1。

檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）。

檢測波長：320nm。

進樣體積：10μL。

柱溫：25℃。

表1梯度洗脫程序表

時間（min）流速（mL/min）流動相A（%）流動相B（%）

01.0694

301.02080

401.08515

421.0694

471.0694

8.3混合標準曲線的制備

按表2線性溶液配制表精密量取1-咖啡?？鼘幩帷⒕G原酸、4-香豆酸、蘆丁、山奈酚、水仙苷

各標準儲備溶液②（5.4）分別至10mL的容量瓶中，用60%乙醇溶液（5.2.1）稀釋至刻度，搖勻，

即得系列線性測定混合標準使用溶液。取上述系列溶液按（8.2）項的色譜條件進行測定，記錄峰面

積，以對照品溶液濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線或求線性回歸方程，

混合標準溶液的液相色譜圖見附錄B中的圖B.1。

表2線性溶液配制表

量取體積(mL)

組分線性1線性2線性3線性4線性5線性6

1-咖啡?？鼘幩?.130.250.500.751.002.00

綠原酸0.060.130.200.250.501.00

4-香豆酸0.060.130.250.500.751.00

蘆丁0.130.190.250.501.002.00

山奈酚0.060.130.250.400.501.00

水仙苷0.060.100.150.250.501.00

8.4測定步驟

取平行兩份的試樣溶液測定，試樣中各酚酸及黃酮類化合物的響應值應在標準曲線范圍內(nèi)。以

外標法計算含量，試樣溶液色譜圖參見附錄B中的圖B.2。

9.結(jié)果計算

試樣中1-咖啡酰奎寧酸、綠原酸、4-香豆酸、蘆丁、山奈酚、水仙苷的含量按干燥品的百分含

量計，按式（1）計算：

?×V

ω=……………（1）

m×1000

式（1）中：

ω——試樣中各酚酸及黃酮類組分的含量，單位為毫克每克（mg/g）

ρ——由標準曲線計算所得試樣中各酚酸及黃酮組分的質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）

m—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

V——試樣中加入并定容的提取溶液的體積，單位為毫升（mL）

測定結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10.精密度

在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過算術平均值的10%。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

標準品信息

標準品中英文名稱、分子式、CAS號和純度見表A.1。

表A.1標準品信息

序號中文名稱英文名稱分子式CAS號純度

11-咖啡?？鼘幩酑yclohexanecarboxylicacidC16H18O91241-87-898.9%

2綠原酸ChlorogenicacidC16H18O9327-97-996.3%

34-香豆酸p-CoumaricacidC9H8O3501-98-499.7%

4蘆丁RutinC27H30O16153-18-491.9%

5山奈酚Kaempfero1C15H10O6520-18-394.0%

6水仙苷NarcissosideC28H32O16604-80-893.1%