II

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III

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引言

近年來，我國高度重視動物傳染病的預(yù)防和控制工作，在國務(wù)院頒布的《國家中長期動物疫病防治

規(guī)劃（2012～2020年）》中明確要求進(jìn)一步做好種禽場疫病凈化、加強疫病檢測診斷能力建設(shè)。家禽及

蛋制品產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)呛笔〉氖笾攸c產(chǎn)業(yè)鏈之一，為了加快湖北省重點農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)，保證家禽養(yǎng)殖健

康與食品安全，依據(jù)《湖北省重點農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈實施方案》，對影響家禽及蛋制品產(chǎn)業(yè)鏈的禽白血病、禽

致病性大腸桿菌、沙門氏菌等家禽重要疫病開展快速檢測方法研究。為加快我省家禽疫病凈化進(jìn)程，提

升疫病的監(jiān)測、檢測效率，促進(jìn)我省家禽業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，起草組圍繞家禽疫病防控的需要，研制了《家

禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程》系列標(biāo)準(zhǔn)，擬由4個部分構(gòu)成。

——第一部分：家禽主要腫瘤病病原鑒別。目的在于開展家禽J亞群白血病病毒、馬立克氏病病毒、

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的快速檢測，指導(dǎo)家禽腫瘤病的快速鑒別診斷。

——第二部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測。目的在于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致

病群大腸桿菌，指導(dǎo)家禽致病群大腸桿菌的快速檢測。

——第三部分：雞沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌三重?zé)晒釶CR檢測方法。目的在于檢測

雞肉及相關(guān)產(chǎn)品、雞泄殖腔拭子和糞便中的沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌，指導(dǎo)雞

肉及相關(guān)產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測。

——第四部分：禽白血病抗原ELISA檢測方法。目的在于檢測種雞群蛋清、血漿、精液、胎糞、

肛拭子中禽白血病抗原ELISA檢測，指導(dǎo)種雞場禽白血病的凈化檢測。

IV

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家禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程

第2部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測

1范圍

本文件規(guī)定了禽致病群大腸桿菌雙重探針檢測方法所需檢測儀器、試劑、樣品、檢測步驟及結(jié)果判

定。

本文件適用于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致病群大腸桿菌。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

NY/T555動物產(chǎn)品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

大腸桿菌致病群escherichiacoliphylogeneticgroup

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分類，將大腸桿菌分為B2、D、B1和A群，其中B2群和D群大腸桿菌稱為致病群大腸桿

菌。

3.2

熒光PCRrealtimePCR

一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

BHQ1：黑洞淬滅劑-l（BlackHoleQuencher-1）

Ct值：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）

FAM：熒光素酰胺（FluoresceinAmidite）

HEX：六氯熒光素（Hexachloro-Fluorescein）

5原理

1

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本文件采用Taqman雙重探針法對家禽大腸桿菌中的致病群進(jìn)行篩選。該方法的原理是：種系發(fā)生分

群是大腸桿菌分子流行病學(xué)的重要特征，依據(jù)chuA基因、yiaA基因和DNA片段TspE4.C2的有無，大腸桿

菌可被分為B2、D、B1和A四個種群（表1）。流行病學(xué)資料顯示，B2群和D群為主要的致病群。針對禽源

大腸桿菌毒力島基因chuA和yiaA，設(shè)計特異的引物和熒光探針，建立了一種禽大腸桿菌致病群篩選的

Taqman雙重探針檢測方法，根據(jù)對應(yīng)的熒光曲線反應(yīng)和Ct值來判斷禽大腸桿菌的致病群。

表1大腸桿菌種群的判定

種群chuAyiaATspE4.C2

B2＋＋/

D＋－/

B1－/＋

A－/－

注：“＋”表示該基因檢測為陽性，“－”表示該基因檢測為陽性，“/”表示不檢測該基因。

6試驗條件

實驗操作應(yīng)在室溫（18℃～25℃）下進(jìn)行。樣品前處理及菌株分離鑒定應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行。

7儀器設(shè)備

7.1熒光定量PCR儀。

7.2二級生物安全柜。

7.3渦旋震蕩器。

7.4微量移液器（規(guī)格為1mL、100μL、50μL和2.5μL）。

7.5恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

7.6臺式冷凍小型離心機（轉(zhuǎn)速≥12000r/min）。

8試劑或材料

8.1試劑配制

本方法試驗用水應(yīng)按照GB/T6682中規(guī)定的二級水，所有實驗用試劑均為分析純。試劑配制按照GB/T

27403規(guī)定實施。

8.2試劑或材料

8.2.1Cary-Blair運送培養(yǎng)基。

8.2.2熒光定量PCR探針預(yù)混物。

8.2.3商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

8.2.4chuA基因引物與探針：上游引物5’-CTGGGTGGAGTGATCTCCTA-3’，下游引物：

5’-TGCCGCCAGTACCAAAG-3’，探針：5’-FAM-TTGCAGGAAGGACAAAGCAGTGGT-BHQ1-3’。

8.2.5yjaA基因引物與探針：上游引物5’-GAAAGCAAACGTGAAGTGTCAG-3’，下游引物：

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5’-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3’，探針：5’-HEX-CCAGCGCCTGTTAATCGCCAATTT-BHQ1-3’。

8.2.6陽性對照1：chuA基因的陽性克隆分子DNA或陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。

8.2.7陽性對照2：yjaA基因的陽性克隆分子DNA或陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。

8.2.8陰性對照：無菌蒸餾水或去離子水。

8.2.9無DNase/RNase的qPCR管、EP管（1.5mL）、微量移液器對應(yīng)的槍頭。

9試驗步驟

9.1樣品的采集與前處理

9.1.1泄殖腔拭子樣品

用無菌的棉拭子插入雞泄殖腔內(nèi)2cm至3cm處并輕輕旋轉(zhuǎn)，將有可見糞便的棉拭子放入含有1mL～

2mL運送培養(yǎng)基中，冷藏箱保存，樣品保存時間不超過24h。

9.1.2糞便樣品

先采集雞新鮮糞便1g～2g于一次性無菌采便管內(nèi)，然后轉(zhuǎn)移至含有1mL～2mL運送培養(yǎng)基中，冷

藏箱保存，樣品保存時間不超過24h。

9.2大腸桿菌的分離鑒定

大腸桿菌的分離鑒定按照NY/T555的規(guī)定執(zhí)行。

9.3樣品DNA的制備

9.3.1對于鑒定后的菌株，接種于營養(yǎng)肉湯中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。12000r/min離心2min，

去盡上清，沉淀用于核酸提取。

9.3.2在沉淀中，加入100μLDNA提取液充分混勻，沸水浴10min，在4℃下12000g離心5min，上

清可直接用于熒光PCR反應(yīng)。

9.3.3也可以使用商品化的DNA提取試劑盒提取DNA模板，具體步驟參照說明書。

9.4熒光PCR檢測

9.4.1反應(yīng)體系

以制備的DNA為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)。反應(yīng)體系體積為25μL，上、下游引物（10mmol/L）

各0.6μL，探針（10mmol/L）各0.8μL，熒光定量PCR探針預(yù)混物12.5μL，模板DNA1μL。用滅菌

的去離子水補足體積至25μL。

9.4.2反應(yīng)條件

熒光PCR反應(yīng)在多通道熒光定量PCR儀上進(jìn)行，選擇熒光信號FAM和HEX（分別檢測chuA-FAM，

yjaA-HEX）。

反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min；然后95℃變性10sec，58.1℃退火并延伸30sec，擴增40個循環(huán)；

延伸結(jié)束時開始進(jìn)行雙重?zé)晒庑盘枡z測。閾值設(shè)置為閾值線超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點。

9.4.3對照

3

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檢測過程中分別設(shè)陽性對照1、陽性對照2與陰性對照。

10結(jié)果判定

10.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性對照（無菌水）無Ct值或Ct值＞35，無擴增曲線；陽性對照品FAM和HEX通道檢測結(jié)果的Ct值均

≤30，擴增曲線明顯呈對數(shù)增長；如果陰性對照或者陽性對照有一項不符合標(biāo)準(zhǔn)則本次檢測無效。

10.2結(jié)果分析

檢測結(jié)果的判定應(yīng)按照表2、表3規(guī)定。

表2chuA、yjaA基因檢測結(jié)果的分析

通道Ct值結(jié)果分析

FAM≤35報告為chuA基因熒光PCR檢測陽性

無Ct值或＞40檢測樣品低于檢測限或沒有，報告為chuA基因熒光PCR檢測陰性

35～40Ct值在35～40之間為灰值區(qū)域，對樣品重新提取基因組，再檢測一次，重做后

Ct值＜37且有擴增曲線的報告為chuA基因熒光PCR檢測陽性，其余則報告為chuA

基因熒光PCR檢測陰性

HEX≤35報