ICS65.020.30

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準

DB15/T3439—2024

規(guī)?；驁鼍d羊支原體肺炎診斷及免疫

技術(shù)規(guī)程

Technicalprotocolsfordiagnosisandimmunizationofmycoplasma

ovipneumoniaeonlargescalesheepfarms

2024-05-31發(fā)布2024-07-01實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T3439—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，五原縣動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古盛健生物科

技有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古金草原生態(tài)科技集團有限公司，內(nèi)蒙古杜美牧業(yè)生物科技有限公司。

本文件主要起草人：戴伶俐、白帆、王娜、宋越、張帆、張月梅、趙世華、劉威、楊斌、錢琳娜、

達來寶力格、鳳英、郭天龍、李慧、張英、王強勝、楊文圃、王建光、劉學(xué)文。

I

DB15/T3439—2024

規(guī)?；驁鼍d羊支原體肺炎診斷及免疫技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)?；驁鼍d羊支原體肺炎診斷及免疫技術(shù)。

本文件適用于規(guī)?；驁鼍d羊肺炎支原體感染的臨床診斷、實驗室檢測和免疫。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

GB/T18635動物防疫基本術(shù)語

NY/T2835奶山羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范

NY/T3052舍飼肉羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

GB/T18635界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

綿羊肺炎支原體mycoplasmaovipneumoniae（Mo）

屬于柔膜綱（Mollicutes）支原體科（Mycoplasmataceae）支原體屬（Mycoplasma）成員。Mo直徑

約125nm～500nm，無細胞壁。Mo合成能力差，需要在培養(yǎng)基中加入酵母浸出液和20%的馬血清進行培

養(yǎng)。在固體培養(yǎng)基上形成針尖大小的透明菌落，肉眼不易觀察，低倍鏡下觀察菌落呈“桑葚狀”，中心

無臍，邊緣不整齊。Mo在55℃條件下5min～15min即可被徹底滅活，對常用的鹽類、來蘇水、石碳酸

等消毒劑敏感，對大部分大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素敏感。Mo由于沒有細胞壁，對青霉素、醋酸鉈有

抵抗力。

規(guī)?；驁鰈arge-scalesheepfarm

存欄羊300只以上的羊場。

聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction（PCR）

一種級聯(lián)反復(fù)循環(huán)的DNA合成反應(yīng)過程。一般由三個步驟組成：模板的熱變性，寡核苷酸引物復(fù)性

到單鏈靶序列上以及由熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的復(fù)性引物引導(dǎo)的新生DNA鏈延伸聚合反應(yīng)。

1

DB15/T3439—2024

間接酶聯(lián)免疫吸附試驗indirectenzyme-linkedimmunosorbentassay（間接ELISA）

已知的抗原吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標板)表面，樣品中待檢測抗體于抗

原結(jié)合形成復(fù)合物，再用酶標二抗與復(fù)合物中的抗體結(jié)合，最后加入底物，用分光光度計測定加底物后

的顯色程度，確定待測抗體的方法。

4臨床診斷

流行特點

綿羊肺炎支原體主要侵害綿羊和山羊，各日齡羊均可發(fā)病，以3月齡以下的羔羊為主，身體狀況差，

機體抵抗力下降的羊更易感染。綿羊肺炎支原體在自然條件下可以通過空氣-飛沫（氣溶膠）傳染，引

發(fā)傳染性胸膜肺炎。病畜通過咳嗽、打噴嚏、唾沫等向外界傳播病原。Mo引起的肺炎常呈地方流行性，

一年四季都發(fā)，其中夏末和冬季頻發(fā)。環(huán)境因素也會導(dǎo)致本病流行，陰雨連綿、寒冷潮濕、羊群密集、

擁擠等因素容易引起傳染的發(fā)生。發(fā)病率因地域和養(yǎng)殖模式而有所不同。

臨床癥狀

綿羊肺炎支原體感染的羊臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涕、消瘦、貧血、生長發(fā)育遲緩、食欲

減退等癥狀。有的病羊有腹脹、腹瀉、口腔潰瘍、腰背拱起等癥狀出現(xiàn)。

病理變化

典型病變主要集中于肺臟中，病程緩急、嚴重程度不同呈現(xiàn)出蝦肉樣、大理石樣、肝變樣。嚴重時

肺臟與胸腔粘連，出現(xiàn)胸腔積液。尖葉病變嚴重，心葉和膈葉次之，其他器官的病變不明顯。

5實驗室診斷

樣品采集

5.1.1鼻拭子樣本采集

鼻拭子采集后置裝有0.5mL～1.0mL滅菌生理鹽水的無菌離心管中，蓋嚴，冷藏條件下快速送檢。

5.1.2氣管分泌物樣本采集

氣管分泌物可直接收集，冷藏條件下快速送檢。

5.1.3血清樣本采集

頸靜脈無菌采血3mL～5mL，室溫放置1h后4℃放置過夜，室溫3000rpm離心5min～10min，

分離血清，于-20℃保存。

所有樣本均應(yīng)妥善包裝，防滲漏，防破碎。標簽用記號筆填寫，應(yīng)信息完整，字跡清晰，并附采樣

單。

5.1.4肺組織樣本采集

2

DB15/T3439—2024

無菌條件下取樣，在肺組織病變與正常組織交界處，取3cm3～5cm3大小的組織樣本，冷藏條件下

快速送檢或置無菌40%～50%甘油生理鹽水中，冷藏條件下快速送檢。

病原的分離鑒定

5.2.1儀器

電子天平，光學(xué)顯微鏡，恒溫搖床，生物安全柜等。

5.2.2耗材

微量可調(diào)移液器及配套吸頭，10mL無菌離心管，涂布棒，0.45μm濾器，一次性培養(yǎng)皿，一次性

培養(yǎng)瓶。

5.2.3試劑與配制

支原體液體培養(yǎng)基，支原體固體培養(yǎng)基，馬血清，1%醋酸鉈，8萬單位青霉素。

培養(yǎng)基及試劑配制參見附錄A。

5.2.4肺組織樣本處理

在表層消毒后，在病變和正常組織交界處取米粒至綠豆大小深層肺組織置于玻璃勻漿器中，加入3

mL～4mL滅菌PBS，反復(fù)擠壓組織塊，制成組織懸液。將組織懸液自然沉淀10min，取上部液體通過0.22

μm孔徑的濾膜過濾后，將濾液作為待檢樣本。

5.2.5病原菌分離培養(yǎng)

濾液加入10mL支原體液體培養(yǎng)基中（含醋酸鉈和青霉素），37℃，150rpm培養(yǎng)48h～72h，液

體變?yōu)槌燃t色，取1mL培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入10mL培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)，盲傳三代后，取3mL培養(yǎng)液提取基因

組DNA用于PCR檢測。

5.2.6病原形態(tài)觀察

培養(yǎng)物涂布于含醋酸鉈和青霉素的支原體固體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)3d～7d，待培養(yǎng)板表面

生長出肉眼可見的半透明菌落，用顯微鏡觀察菌落形態(tài)，邊緣不整齊，呈現(xiàn)“桑葚狀”菌落，無臍。（見

附錄C.1）

5.2.7染色鏡檢

取培養(yǎng)物作涂片，用瑞士染色，鏡檢可見具有多形性、小球狀、桿狀等，兩極著色，許多聚集成團，

直徑約為0.2μm（見附錄C.2）。

5.2.8病原生化鑒定

5.2.8.1生化管

葡萄糖、甘露醇、精氨酸、尿素、磷酸酶等生化管為商品化試劑。

5.2.8.2對照菌株

綿羊肺炎支原體Y98標準株。

5.2.8.3操作方法：

3

DB15/T3439—2024

吸取10μL綿羊肺炎支原體液體純培養(yǎng)物，分別深部接種于各種生化管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱

中，12h～24h后觀察結(jié)果。綿羊肺炎支原體分解葡萄糖、不分解甘露醇、精氨酸和尿素，無磷酸酶活

性，綿羊肺炎支原體生化反應(yīng)鑒別見附錄C。

5.2.9病原分離判定

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)物使培養(yǎng)基變橙紅，菌液呈現(xiàn)薄云霧狀，不明顯渾濁，菌體在培養(yǎng)液中呈現(xiàn)流沙

狀。菌落特征明顯，符合生化反應(yīng)，初步判定為綿羊肺炎支原體分離陽性，否則判定為未檢出綿羊肺炎

支原體。

PCR檢測

5.3.1儀器和耗材

PCR儀，電爐，離心機，混勻器，微量可調(diào)移液器，1.5mL離心管，PCR反應(yīng)管，核酸電泳儀，凝

膠成像系統(tǒng)。

5.3.2試劑

滅菌雙蒸水，TaqMix，瓊脂糖，細菌基因組DNA提取試劑盒。

5.3.3樣品處理

5.3.3.1拭子樣品

鼻拭子樣本于采集管中渦旋5min，取400μL懸液，4℃，12000rpm離心20min，棄上清，沉淀

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

5.3.3.2氣管分泌物樣品

氣管分泌物樣品于采集管中渦旋5min，取400μL懸液，4℃，12000rpm離心20min，棄上清，

沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

5.3.3.3菌液樣品

培養(yǎng)產(chǎn)物取3mL于4℃，12000rpm離心20min，棄上清，沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基

因組DNA。

5.3.4引物序列

見附錄D。

5.3.5PCR反應(yīng)體系

總體積20μL，其中2×TaqMix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，綿羊肺炎支原體DNA

模板1.0μL，去離子水7μL。

5.3.6PCR反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性5min后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后，72℃延伸

7min。

5.3.7PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測

4

DB15/T3439—2024

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察，PCR產(chǎn)物大小應(yīng)為350bp(見附錄C.3)。

對照設(shè)置：對照模板為綿羊肺炎支原體Y98標準株基因組DNA。

結(jié)果判定：電泳檢測PCR產(chǎn)物大小為350bp，與陽性對照產(chǎn)物大小相同，無模板對照為無目的條帶，

判定為綿羊肺炎支原體陽性。

間接ELISA檢測血清抗體

5.4.1主要試劑耗材

酶聯(lián)反應(yīng)板，離心管，PBS緩沖液，吐溫-20，脫脂乳，HRP標記兔抗綿羊抗體，HRP標記兔抗山羊抗

體，1M硫酸溶液。除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682的超純水。

5.4.2主要儀器設(shè)備

酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、微孔板振蕩器、微量移液器。

5.4.3血清及抗原制備流程

5.4.3.1陽性血清對照

分離鑒定并經(jīng)測序確定為綿羊肺炎支原體的菌液制備全菌滅活抗原，并用其免疫3月齡羔羊制備標

準陽性血清，經(jīng)間接血凝實驗驗證為陽性。

5.4.3.2陰性血清對照

無母源抗體，經(jīng)間接血凝實驗結(jié)果為陰性。

5.4.3.3抗原制備

綿羊肺炎支原體菌液100mL，4℃12000rpm離心30min，棄上清，取沉淀。將菌體沉淀用0.1M

pH7.4的PBS緩沖液洗滌3次，用5mLPBS重懸。菌體重懸液超聲裂解，4℃12000rpm離心30min，收

集上清，即為綿羊肺炎支原體全菌抗原。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，將抗原凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5.4.4檢測流程

5.4.4.1抗原包被

將上述抗原用0.05mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)，即包被液，稀釋為4μg/mL，按100μL/

孔加入至酶聯(lián)反應(yīng)板，置4℃冰箱過夜，次日棄包被液，用PBST洗滌酶聯(lián)反應(yīng)板3次。

5.4.4.2封閉

封閉液：為含5%脫脂乳的PBST溶液。

用移液器向酶聯(lián)反應(yīng)板加入新鮮配制的封閉液，300μL/孔，37℃恒溫箱孵育1h；取出后加PBST，

300μL/孔，洗板3次。

5.4.4.3ELISA檢測程序

加樣：用封閉液按體積比1:100稀釋待檢血清、陽性、陰性對照血清，每個樣本做2個平行復(fù)孔，稀

釋后血清100μL/孔，37℃恒溫箱孵育1h，用PBST洗板3次。

加酶結(jié)合物：取稀釋好的酶結(jié)合物，酶聯(lián)反應(yīng)板100μL/孔加注，37℃恒溫箱孵育50min，洗滌同

前。

5

DB15/T3439—2024

加底物顯色：將底物液A和底物液B等體積混合制成的TMB底物顯色液按100μL/孔加注，室溫避光作

用20min，用1M硫酸終止液100μL/孔，終止顯色反應(yīng)。

數(shù)據(jù)讀?。河妹笜藘x在波長450nm處測定每孔的吸收值，每個樣品每次平行2孔，取其平均值。

5.4.4.4血清抗體檢測結(jié)果判定

待檢樣本S，陽性對照P，陰性對照N。陽性對照P值應(yīng)大于0.8，陰性對照值應(yīng)小于0.2，待檢驗本S/

陰性對照N比值>2.1即判定為陽性，待檢驗本S/陰性對照N比值≤2.1，即判定為陰性。

綜合判定

臨床診斷符合綿羊肺炎支原體癥狀，病原鑒定為陽性或PCR鑒定為陽性，即可判定為綿羊肺炎支原

體感染陽性。未免疫綿羊肺炎支原體疫苗的羊只血清抗體檢測為陽性，則可判定為已感染綿羊肺炎支原

體。

6防控措施

綜合管理措施

6.1.1飼養(yǎng)管理

按照NY/T2835和NY/T3052的要求，加強飼養(yǎng)管理、保障動物福利、減少應(yīng)激。

6.1.2消毒措施

嚴格做好羊舍內(nèi)外環(huán)境、用具、物品的消毒，以及人員消毒。

疫苗免疫

6.2.1疫苗選擇

疫苗選擇：

a)選擇針對性疫苗，經(jīng)中國獸藥網(wǎng)注冊公布的疫苗；

b)每次免疫時，最好選用同一企業(yè)生產(chǎn)的疫苗。

6.2.2推薦免疫程序

參見附錄E，針對不同生長階段羊，采取適宜的免疫接種程序。

治療原則

選擇對綿羊肺炎支原體敏感的大環(huán)內(nèi)酯類、強力霉素、氟苯尼考等抗生素，在做好全進全出、加強

飼養(yǎng)管理與衛(wèi)生消毒工作及提高生物安全標準的基礎(chǔ)上，根據(jù)羊群具體情況制定用藥方案。

6

DB15/T3439—2024

A

A

附錄A

（資料性）

主要培養(yǎng)基及試劑的配制

A.1支原體液體培養(yǎng)基：將PPLO肉湯粉10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸鈉0.5g，溶于440mL

超純水中，116℃滅菌20min后，添加馬血清50mL，10×MEM5mL,8萬單位/mL青霉素溶液5mL，

1%酚紅溶液500μL，定容至500mL，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.2支原體固體培養(yǎng)基：將PPLO肉湯粉10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸鈉0.5g，瓊脂粉7.5g，

溶于440mL超純水中116℃20min～25min后，添加馬血清50mL，無菌10×DMEM5mL,8萬國際

單位/mL青霉素溶液5mL,定容至500mL，倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3TAE電泳緩沖液：Tris4.84g/L,冰乙酸1.142mL/L，EDTA(pH8.0)，0.001mmol/L,定

容至1000mL。

A.4PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO4

1.4mmol/L。用HCl調(diào)pH值至7.4，定容至1000mL，121℃，30min高壓滅菌。

A.58萬國際單位/mL青霉素溶液：取400萬國際單位的青霉素粉劑，溶于50mL雙蒸水中,至完

全溶解后，0.22μm細菌濾器過濾除菌，濾液置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.61%酚紅溶液：稱取1g酚紅加入1MNaOH溶液2mL，不斷攪拌，將已經(jīng)溶解的酚紅溶液倒

入容器中；未溶解的酚紅繼續(xù)加1MNaOH溶液2mL，重復(fù)上述步驟（NaOH溶液總量不可超過6mL）；

加雙蒸水至100mL，121℃滅菌15min后，至4℃保存。

A.7瓊脂糖1%瓊脂糖凝膠：瓊脂糖粉1g，加入TAE溶液100mL，加熱充分溶解，趁熱倒入核酸

電泳槽膠槽中。

7

DB15/T3439—2024

B

B

附錄B

（資料性）

綿羊肺炎支原體的分離鑒定

B.1綿羊肺炎支原體菌落形態(tài)（10×40）見圖B.1。

圖B.1綿羊肺炎支原體菌落形態(tài)（10×40）

B.2綿羊肺炎支原體瑞士染色（10×100）見圖B.2。

圖B.2綿羊肺炎支原體瑞士染色（10×100）

8

DB15/T3439—2024

B.3綿羊肺炎支原體特異性引物PCR電泳圖。

標引序號說明：

M——DNA分子量標準；

1——鼻拭子樣本；

2——氣管分離培養(yǎng)MO；

3——肺組織分離培養(yǎng)MO；

4——Y98陽性對照；

5——氣管分泌物樣本；

6——空白對照。

圖B.3綿羊肺炎支原體特異性引物PCR電泳圖

9

DB15/T3439—2024

C

C

附錄C

（資料性）

生化反應(yīng)鑒別檢測

綿羊肺炎支原體生化反應(yīng)鑒別檢測的判斷依據(jù)見表C.1。

表C.1綿羊肺炎支原體生化反應(yīng)鑒別檢測的判斷依據(jù)

種名分解葡萄糖分解甘露糖水解精氨酸分解尿素磷酸酶活性

綿羊肺炎支原體+----

精氨酸支原體--+--

絲狀支原體絲狀亞種++---

10

DB15/T3439—2024

D

D

附錄D

（資料性）

PCR引物序列

綿羊肺炎支原體PCR鑒定的擴增引物見表D.1。

表D.1用于綿羊肺炎支原體PCR鑒定的引物

引物序列

MO-F5'-ACGGAATATGTTAGCTT-3'

MO-R5'-TTCATCCTGCACTCTGT-3'

11

DB15/T3439—2024

E

E

附錄E

（資料性）

推薦免疫程序

推薦免疫程序見表E.1。

表E.1推薦免疫程序

不同生長階段推薦免疫程序注意事項

按照疫苗說明書免疫接種方式和免疫劑量進行免疫，羔

免疫羊群應(yīng)臨床表現(xiàn)健

1～2周齡