ICS65.120

CCSB46

21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3698—2023

飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測

MethodfordeterminationofClostridiumbutyricuminfeeds

2023-02-28發(fā)布2023-03-28實施

遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB21/T3698—2023

目次

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3術(shù)語和定義..........................................................................1

4縮略語..............................................................................1

5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑................................................................1

6設(shè)備和實驗器材......................................................................1

7檢驗程序............................................................................2

8采樣................................................................................3

9試樣的制備..........................................................................3

10操作步驟...........................................................................3

11確證試驗...........................................................................4

12結(jié)果計算與報告.....................................................................5

附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑..........................................................7

附錄B（資料性）細(xì)菌DNA提取..........................................................9

I

DB21/T3698—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：大連三儀動物藥品有限公司、遼寧國托檢測有限公司、江蘇三儀生物工程有限公

司、大連工業(yè)大學(xué)、彰武縣畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。

本文件主要起草人：江國托、劉艷、單春喬、李娟、劉秋晨、于洪敏、王巖、趙紅秋、翟宏旭、田

晶、陳玲、王效禹、宋蕙男、吳怡琦、劉星、冷寒冰。

本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋。

我們將及時答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實際情況依法進(jìn)行評估及復(fù)審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話

文件起草單位通訊地址：大連三儀動物藥品有限公司，遼寧省大連市甘井子區(qū)營城子鎮(zhèn)營旭路9號，

聯(lián)系電話

II

DB21/T3698—2023

飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測

1范圍

本文件規(guī)定了飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測方法。

本文件適用于各種飼料添加劑各組分中丁酸梭菌的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T4789.2食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T20195動物飼料試樣的制備

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

FTGFluidThioglycollate，液體硫乙醇酸鹽

5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑

5.10.85%滅菌生理鹽水。

5.2丁酸梭菌培養(yǎng)基：見附錄A中的A.1。

5.3革蘭氏染色液：見附錄A中的A.2。

5.4細(xì)菌生化鑒定試劑盒。

5.5細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

5.6標(biāo)準(zhǔn)菌株：丁酸梭菌CICC10390。

5.7實驗室用水:按照GB/T6682進(jìn)行。

6設(shè)備和實驗器材

1

DB21/T3698—2023

6.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。

6.2漩渦震蕩器：0～2800rpm。

6.3顯微鏡：1000倍。

6.4高壓滅菌鍋：105～134℃。

6.5無菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm。

6.6無菌錐形瓶250mL。

6.7無菌玻璃或塑料涂布棒。

6.8無菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。

6.9微生物鑒定儀。

6.10電子天平：感量為0.1g、0.01g、0.0001g。

6.114℃冰箱。

6.12pH計：精確度0.1。

6.13量筒：250mL。

6.14普通PCR儀。

6.15電泳儀。

6.16凝膠成像儀。

6.17移液器：量程10μL、100μL、1000μL、10000μL。

7檢驗程序

丁酸梭菌檢驗程序見圖1。

2

DB21/T3698—2023

圖1丁酸梭菌檢驗程序

8采樣

實驗室樣品真實，具有代表性。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、試管、廣口瓶、剪子等，應(yīng)是無

菌器皿。采樣后，樣品應(yīng)及時送至微生物檢驗室進(jìn)行檢測。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。

9試樣的制備

按照GB/T20195進(jìn)行。

10操作步驟

10.1檢樣制備與稀釋

以無菌操作取試樣25g(mL)，注入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)1min～2min

或置振蕩器中振蕩30min，制成1︰10的初始菌懸液。吸取1︰10的初始菌懸液1mL，加入9mL0.85%

滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1︰100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述操作順序做進(jìn)一步的10

倍系列遞增稀釋的稀釋度。

10.2接種和培養(yǎng)

選擇2個～3個適宜稀釋度，每個梯度3個平行，用無菌移液器分別吸取0.1mL稀釋液，接種到改良

FTG培養(yǎng)基上，pH7.0±0.2。使用無菌的涂布棒快速、準(zhǔn)確地涂布接種于培養(yǎng)基表面，涂布棒不應(yīng)接觸

平皿邊緣。每個平皿用一支無菌涂布棒。將涂布好的平皿蓋好，室溫中放置15min，使接種物完全被培

養(yǎng)基吸收，倒置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h±1h。

10.3菌落計數(shù)及篩選

3

DB21/T3698—2023

培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個～300個之間的平板計數(shù)，若平板中有較大片狀菌落生長時，則不宜采

用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表

全皿菌落數(shù)。培養(yǎng)后的平板內(nèi)的培養(yǎng)基顏色由粉色變成淡黃色，典型丁酸梭菌菌落形態(tài)呈端圓，白色，

稍凸，不透明，表面菌落稍有不規(guī)則。

11確證試驗

11.1菌種制備

自平板上挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)24h

±1h，從平板上選取至少5個良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進(jìn)行確證試驗。

11.2形態(tài)觀察

自轉(zhuǎn)接平板上挑取典型單菌落，做革蘭氏染色鏡檢。丁酸梭菌為革蘭氏陽性菌，顯微鏡觀測菌體呈

梭狀，有芽孢，芽孢呈橢圓形，中生或近中生。

11.3生化確認(rèn)試驗

目前商業(yè)上的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標(biāo)準(zhǔn)確證試驗所用的培養(yǎng)基一

致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進(jìn)行該項確證試驗。

將挑選純化的單一菌落，用生化鑒定試劑盒或者生化鑒定管或者微生物鑒定儀按說明進(jìn)行鑒定試驗。

丁酸梭菌生化特征見表1。

表1丁酸梭菌生化特征

特征結(jié)果特征結(jié)果

乳糖+蜜二糖+

水楊苷+松三糖-

木糖+棉子糖+

山梨醇-鼠李糖-

淀粉水解+明膠水解-

注：+：陽性；-：陰性。

11.4PCR確證試驗

11.4.1DNA提取

用商用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒或常用提取方法（附錄B）提取試樣DNA，并設(shè)置陰性、陽性對照。

11.4.2擴(kuò)增引物序列

上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；

4

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下游引物：R5′-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3′。

PCR反應(yīng)體系如表2所示。

預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物大小為171bp。

11.4.3PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系見表2。

表2PCR反應(yīng)體系

試劑使用量（μL）

2×TaqMasterMix5

上游引物（20μM）0.5

下游引物（20μM）0.5

模板（100ng/μL）1

ddH2O3

總體積10

11.4.4程序設(shè)定

程序設(shè)定如下：①預(yù)變性：95℃5min；②變性：95℃30s；③退火：55℃30s④延伸：72℃

30s；⑤保溫：4℃10min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設(shè)為35。

11.4.5電泳

用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠，加入Gelred染料。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行點(diǎn)樣。

用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳30min，電泳檢測結(jié)果用凝膠成像儀記錄

并保存。

11.4.6確證結(jié)果

11.4.6.1當(dāng)陽性對照孔出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，陰性對照孔未出現(xiàn)目的條帶時,試驗結(jié)果成立。

11.4.6.2被檢樣品出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，丁酸梭菌陽性；未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判為陰性。

12結(jié)果計算與報告

12.1菌落計數(shù)

只計算符合10.3的菌落。

菌落計數(shù)后，隨機(jī)挑取5個菌落進(jìn)行鑒定，根據(jù)證實為丁酸梭菌菌落數(shù)計算出該皿內(nèi)的菌數(shù)，然后

乘其稀釋倍數(shù)即得每g（mL）樣品中的菌數(shù)，按式（1）計算：

·······································································(1)

C

A=B×5×?

式中：

5

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A—測定的丁酸梭菌菌落數(shù)，CFU/g(mL)。

B—丁酸梭菌的可疑菌落總數(shù)。

C—5個鑒定的菌落中確認(rèn)為丁酸梭菌的菌落數(shù)。

f—稀釋倍數(shù)。

最終結(jié)果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。

示例：含有丁酸梭菌的樣品中106稀釋液在培養(yǎng)基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落為100個，取5

個鑒定，證實為丁酸梭菌的是4個，由1g飼料中含丁酸梭菌菌數(shù)為：

467

100×5×10=8.0×10CFU/g

12.2樣品中丁酸梭菌菌數(shù)的計算方法與報告

選擇兩個連續(xù)稀釋度平板（每個稀釋度至少有一塊平板，其上經(jīng)確證后的丁酸梭菌數(shù)介于30個～300

個之間），通過式（2）計算，即為1mL或1g樣品中的丁酸梭菌菌數(shù)N：

····································································(2)

?

N=??1+0.1?2?

式中：

N----------樣品中丁酸梭菌菌落數(shù)；

∑a--------所有平板經(jīng)確證后的丁酸梭菌菌數(shù)的總和；

V----------平板的接種體積，單位為毫升（mL）；

n1----------第一個稀釋度的平板數(shù)；

n2----------第二個稀釋度的平板數(shù)；

d----------第一個稀釋度的稀釋因子（未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值）。

按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則將計算出的結(jié)果保留至兩位有效數(shù)字，也可將樣品的丁酸梭菌菌落數(shù)

記錄為1.0--9.9乘以10的指數(shù)冪表示。

報告每mL或每g樣品的丁酸梭菌估計數(shù)，單位CFU/g（mL）。

示例1：

若第一個稀釋度（10-4）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為137和201，第二個稀釋度（10-5）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為

34和56，則：

137+201+34+56428

?4

N=0.1×2+0.1×2×10=0.000022=19454545

式中：

按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中含丁酸梭菌估計數(shù)為19454545CFU/g（mL）或

1.9×107CFU/g（mL）。

示例2：

若只有最后一個稀釋液（10-5）經(jīng)證實含丁酸梭菌菌落數(shù)為121和135，則：

121+135256

?5

N=0.1×2×10=0.000002=128000000

式中：

按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中丁酸梭菌估計數(shù)為128000000CFU/g（mL）或

1.3×108CFU/g（mL）。

6

DB21/T3698—2023

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑

A.1改良FTG培養(yǎng)基

A.1.1成分

胰蛋白胨15g

酵母粉5g

葡萄糖10g

硫代乙醇酸鈉3g

L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g

氯化鈉2.5g

瓊脂20g

刃天青0.001g

蒸餾水1000mL

A.1.2制法

將上述成分加于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0±0.2，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15min。

A.2革蘭氏染色

A.2.1結(jié)晶紫染色液

A.2.1.1成分

結(jié)晶紫1g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

A.2.1.2制法

將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.2.2革蘭氏碘液

A.2.2.1成分

碘1g

碘化鉀2g

蒸餾水300mL

A.2.2.2制法

將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.2.3沙黃復(fù)染液

7

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A.2.3.1成分

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.2.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.2.4染色法

將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染色1