ICS67.120.20

CCSB45

DB42

湖北省地方標準

DB42/T1631—2021

禽蛋中酰胺醇類藥物殘留量的測定高效液

相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Determinationofamphenicolsresiduesineggsbyhighperformanceliquid

chromatography-tandemmassspectrometry

2020-12-30發(fā)布2021-03-01實施

湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB42/T1631—2021

目次

前言................................................................................Ⅲ

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語和定義........................................................................1

4原理..............................................................................1

5試劑和材料........................................................................1

6儀器和設(shè)備........................................................................2

7試樣的制備和保存..................................................................2

8測定步驟..........................................................................2

9結(jié)果計算..........................................................................4

10靈敏度、準確度和精密度...........................................................6

附錄A（資料性）....................................................................7

I

DB42/T1631—2021

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位:湖北省獸藥監(jiān)察所、武漢華揚動物藥業(yè)有限責任公司、湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研

究所、湖北新佳農(nóng)牧科技有限公司。

本文件主要起草人：曾勇、王峻、王建華、董文婷、馬立保、張金林、羅青平、舒金秀、盧芳、陳

肖、金秀娥、徐軍、周青、吳曉翠、龔波、馮超林。

本文件實施過程中有疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：

hbsnab@126.com；湖北省獸藥監(jiān)察所，聯(lián)系電話郵箱：hbssyjcs@163.com。對本文件

有關(guān)修改意見建議請反饋至湖北省獸藥監(jiān)察所，聯(lián)系電話郵箱：zengyong633@126.com。

III

DB42/T1631—2021

禽蛋中酰胺醇類藥物殘留量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本文件規(guī)定了禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留量的液相色譜-串聯(lián)

質(zhì)譜測定方法。

本文件適用于雞蛋、鴨蛋、鵝蛋和鵪鶉蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘

留量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

試樣中殘留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺，用乙腈提取，正己烷除脂，PCX固相萃

取小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考以基質(zhì)匹配內(nèi)標法定量，氟苯尼

考胺以基質(zhì)匹配外標法定量。

5試劑和材料

5.1以下所用試劑，除特別注明者外均為分析純試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。

5.2乙腈：色譜純。

5.3甲醇：色譜純。

5.4正己烷：優(yōu)級純。

5.5氨水：優(yōu)級純。

5.610%甲醇溶液：取10mL甲醇（5.3），用水溶解并稀釋至100mL。

5.75%氨水甲醇溶液：取5mL氨水（5.5），用甲醇溶解并稀釋至100mL。

5.8標準物質(zhì)：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，含量≥99.0%；氟苯尼考胺，含量≥98.0%。

5.9內(nèi)標標準液：氘代氯霉素（d5-氯霉素），100μg/mL，溶劑為丙酮，氘化度≥98%。

5.10標準儲備液：精密稱取10mg的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標準物質(zhì)于100mL

容量瓶中，用甲醇分別配成100μg/mL的標準儲備液，-18℃以下保存，有效期6個月。

1

DB42/T1631—2021

5.11混合標準中間液：準確量取1.00mL氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的標準儲備液

（5.10）于100mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為1μg/mL的混合標準中間液，于4℃以下保存，有效期

1個月。

5.12混合標準工作液：準確量取1.00mL濃度為1μg/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考

胺的混合標準中間液（5.11）于100mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為10ng/mL的混合標準工作液，現(xiàn)

用現(xiàn)配。

5.13內(nèi)標標準中間液：準確吸取100μL內(nèi)標標準液（5.9）于10ml容量瓶中，用甲醇配成濃度為1μg/mL

的內(nèi)標標準中間液，于4℃以下保存，有效期1個月。

5.14內(nèi)標標準工作液：準確吸取1.00mL內(nèi)標標準中間液（5.13）于100ml容量瓶中，用甲醇配成濃

度為10ng/mL的內(nèi)標標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.15空白基質(zhì)提取液：選取不含待測物的樣品，不加入內(nèi)標標準工作液，其他按8.1和8.2步驟操作，

得到空白基質(zhì)提取液。

5.16基質(zhì)標準工作溶液的配制：根據(jù)標準的靈敏度和儀器線性范圍，精密量取一定量的氯霉素、甲砜

霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的混合標準工作液和內(nèi)標標準工作液適量，用空白基質(zhì)提取液配成濃度為

0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL的系列基質(zhì)標準工作溶液（氯

霉素同位素內(nèi)標濃度為2ng/mL），現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.17固相萃取小柱：PCX（60mg，3mL）。

6儀器和設(shè)備

6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。

6.2天平：感量0.01g和0.01mg。

6.3氮吹儀。

6.4冷凍高速離心機：轉(zhuǎn)速≥10000r/min。

6.5固相萃取裝置。

6.6振蕩器。

6.7渦旋混合器。

6.8離心管：50mL。

7試樣的制備和保存

7.1試樣的制備

禽蛋樣品的蛋清蛋黃均勻混勻后作為供試試樣。

7.2試樣的保存

-18℃以下條件保存。

8測定步驟

8.1提取

稱取5g（精確至0.01g）試樣，置于50mL聚丙烯離心管中，加入內(nèi)標標準工作液（5.14）100μL，

加入10mL乙腈（5.2），于渦旋混合器上渦旋1min，振蕩5min，10000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)

2

DB42/T1631—2021

移至另一離心管中。上清液加乙腈飽和的正己烷10mL，渦旋混勻，10000r/min離心5min，棄去上層正

己烷，下層再加乙腈飽和的正己烷10mL重復(fù)操作一次，取下層乙腈在40℃水浴中氮吹至近干，加入2mL

水溶解備用。

8.2凈化

取PCX固相萃取小柱，依次用甲醇3mL，水3mL活化，將備用液（8.1）以每秒一滴的速度全部過柱，

用水淋洗，真空抽干，再用3mL5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液在40℃水浴中氮吹至近干。用1mL

水溶解，渦旋1min，過0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

8.3測定

8.3.1液相色譜條件

色譜柱：C18柱，粒徑5μm，內(nèi)徑2.1mm，柱長150mm，或相當者；

流動相：梯度洗脫條件見表1；

柱溫：40℃；

流速：0.3mL/min；

進樣量：10μL。

表1梯度洗脫程序

時間（min）10%甲醇（%）乙腈（%）

18020

33070

58020

68020

8.3.2質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；

掃描方式:負離子掃描（氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考）和正離子掃描（氟苯尼考胺）；

離子源接口電壓：4.5kv；

加熱模塊溫度：400℃；

DL(脫溶劑管)溫度：250℃；

霧化氣：氮氣3.0L/min；

干燥氣：氮氣10L/min；

碰撞氣：氬氣；

駐留時間：100ms；

延遲時間：3ms；

多反應(yīng)監(jiān)測（MRM采集模式）；

各種藥物的MRM參數(shù)見表2。

3

DB42/T1631—2021

表2MRM參數(shù)

定性離子對定量離子對Q1PreCEQ3Pre

藥物名稱

m/zm/zBias(V)（V）Bias（V）

321.20＞152.1516.018.028.0

氯霉素321.20＞152.15

321.20＞194.2016.013.020.0

354.00＞185.1018.021.019.0

甲砜霉素354.00＞185.10

354.00＞290.0018.013.020.0

356.00＞185.2018.020.019.0

氟苯尼考356.00＞336.00

356.00＞336.0018.011.023.0

氯霉素-D5326.10＞157.15326.10＞157.1516.018.016.0

248.10＞130.00-12.0-21.0-23.0

氟苯尼考胺248.10＞230.10

248.10＞230.10-13.0-12.0-26.0

8.4定性定量方法

8.4.1定性方法

每種被測組分選擇1個母離子，2個以上子離子，在相同試驗條件下，樣品中待檢測物質(zhì)和內(nèi)標物的

保留時間之比，也就是相對保留時間，與標準溶液中對應(yīng)的相對保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品譜

圖中各組分的兩個子離子的相對豐度與濃度接近的標準溶液的相對豐度一致，偏差不超過表3規(guī)定的范

圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。

表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度（%）＞50＞20～50＞10～20≤10

允許的相對偏差（%）±20±25±30±50

8.4.2定量方法

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考測定以內(nèi)標法定量：在儀器最佳工作條件下，對基質(zhì)標準工作

溶液進樣，以標準溶液中被測組分峰面積和氘代氯霉素（d5-氯霉素）峰面積的比值為縱坐標，標準溶

液中被測組分濃度與氘代氯霉素（d5-氯霉素）濃度的比值為橫坐標繪制標準工作曲線，用標準工作曲

線對樣品進行定量，樣品溶液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。

氟苯尼考胺測定以外標法定量：在儀器最佳工作條件下，對基質(zhì)標準工作溶液進樣，以標準

溶液中被測組分峰面積為縱坐標，標準溶液中被測組分濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，用標準工作曲

線對樣品進行定量，樣品溶液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。

氯霉素、氘代氯霉素（d5-氯霉素）、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的基質(zhì)匹配標準溶液和空

白添加試樣溶液中特征離子的質(zhì)量色譜圖參見附錄A。

8.5空白試驗

除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。

9結(jié)果計算

9.1氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定結(jié)果按式（1）～式（4）計算。

單點校準：

4

DB42/T1631—2021

…………………(1)

或基質(zhì)標準曲線校準，由：

…………………(2)

求得a和b，則

…………………(3)

…………………(4)

式中：

X——試樣中被測組分的殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）；

——對照溶液中被測組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

Ci——基質(zhì)標準曲線中被測組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

V——試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

——試樣稱取量，單位為克（g）；

——對照溶液中被測組分的峰面積；

——試樣中內(nèi)標物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

——對照溶液中內(nèi)標物的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

——試樣溶液中被測組分的峰面積；

——試樣溶液中內(nèi)標物的峰面積；

——對照溶液中內(nèi)標物的峰面積。

9.2氟苯尼考胺殘留量的測定結(jié)果按式（5）～式（8）計算。

單點校準：

…………………(5)

或基質(zhì)標準曲線校準，由：

…………………(6)

求得a和b，則

5

DB42/T1631—2021

…………………(7)

…………………(8)

式中：

X——試樣中被測組分的殘留量（μg/kg）；

——對照溶液中被測組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

C——基質(zhì)標準曲線中被測組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

——試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

——試樣稱取量，單位為克（g）；

——試樣溶液中被測組分的峰面積；

——對照溶液中被測組分的峰面積。

計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

10靈敏度、準確度和精密度

10.1靈敏度

本方法的檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.2μg/kg。

10.2準確度和精密度

本方法在0.2μg/kg～2μg/kg添加濃度水平上的回收率為60%～120%。

本方法批內(nèi)相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。

6

DB42/T1631—2021

AA

附錄A

（資料性）

酰胺醇類藥物離子色譜圖

圖A.1給出了酰胺醇類藥物基質(zhì)匹配標準溶液離子色譜圖，圖A.2給出了酰胺醇類藥物空白雞蛋添

加的離子色譜圖。

(x10,000)

2.001:chlorumphenicol321.20>152.15(-)CE:18.0

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min

1）氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖（321.20＞152.15）

(x10,000)

2.002:chlorumphenicol-d5326.10>157.15(-)CE:18.0

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min

2）氯霉素D5特征離子質(zhì)量色譜圖（326.10＞157.15）

7

DB42/T1631—2021

(x10,000)

1.03:JFMSTIC(-)

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min

3）甲砜霉素特征離子質(zhì)量色譜圖（354.00＞185.10）

(x1,000)

2.004:FBNK356.00>336.00(-)CE:11.0

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0min

4）氟苯尼考特征離子質(zhì)量色譜圖（356.00＞336.00）

8

DB42/T1631—2021

(x10,000)

5.01:FBNKA248.10>230.10(+)CE:-12.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min

5）氟苯尼考胺特征離子質(zhì)量色譜圖（248.10＞230.10）

圖A.11.0μg/L氯霉素、氯霉素D5、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺基質(zhì)匹配標準溶液離子色譜圖

9

DB42/T1631—2021

(x10,000)

2.001:chlorumphenicol321.20>152.15(-)CE:18.0

1.75

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min

1）氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖（321.20＞152.15）

(x10,000)