ICS65.020.30

CCSB41

53

云南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB53/T1067—2021

純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程

TechnicalspecificationforidentificationofpurePavomuticus

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實(shí)施

云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB53/T1067—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.....................................................................................................................................................1

4形態(tài)鑒定.........................................................................................................................................................1

4.1鑒定材料.................................................................................................................................................1

4.2鑒定內(nèi)容.................................................................................................................................................2

4.3形態(tài)特征.................................................................................................................................................2

4.4綠孔雀與藍(lán)孔雀性狀差別.....................................................................................................................2

4.5疑似綠孔雀?jìng)€(gè)體形態(tài)鑒定.....................................................................................................................2

5分子鑒定.........................................................................................................................................................2

5.1鑒定材料.................................................................................................................................................3

5.2鑒定原理.................................................................................................................................................3

5.3樣品采集.................................................................................................................................................3

5.4DNA制備..................................................................................................................................................3

5.5基因組重測(cè)序.........................................................................................................................................4

5.6參考基因組選擇.....................................................................................................................................4

5.7純種鑒定.................................................................................................................................................4

附錄A（資料性）藍(lán)孔雀和綠孔雀性狀對(duì)比圖.......................................................................................5

附錄B（資料性）DNA樣品的提取與檢測(cè)................................................................................................6

附錄C（資料性）試劑及儀器設(shè)備............................................................................................................8

附錄D（資料性）鑒定結(jié)果樣表................................................................................................................9

I

DB53/T1067—2021

前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。

本文件主要起草人：董鋒、黃艷梅、單鵬飛、李建春、王潔、李杰、吳飛、伍和啟、高建云、巖道、

常江、楊曉君。

III

DB53/T1067—2021

純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了純種綠孔雀（Pavomuticus）鑒定技術(shù)的形態(tài)鑒定、分子鑒定。

本文件適用于綠孔雀的純種鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T30989-2014高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程

GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南

3術(shù)語(yǔ)和定義

GB/T30989界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

物種鑒定speciesidentification

通過形態(tài)特征、分子鑒定，確定檢測(cè)樣本是否為純種個(gè)體的過程。

3.2

基因組genome

一種生物體具有的所有遺傳信息的總和。

[來源：GB/T30989-2014，3.2]

3.3

參考基因組序列referencegenomesequence

通過對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)行從頭測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行拼接、組裝，而獲得的基因

組序列信息。

3.4

基因組重測(cè)序genomeresequencing

針對(duì)有參考基因組序列的物種的不同個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，以獲取個(gè)體或群體間的差異性信息。

3.5

小片段基因組文庫(kù)small-insertgenomiclibrary

片段大小在1kb以下的普通DNA文庫(kù)（200bp、350bp、500bp等），可用于基因組重測(cè)序。

4形態(tài)鑒定

4.1鑒定材料

1

DB53/T1067—2021

供鑒定的個(gè)體應(yīng)為綠孔雀亞成體或成體。

4.2鑒定內(nèi)容

鑒定內(nèi)容見表1。

表1綠孔雀形態(tài)學(xué)鑒定內(nèi)容

性狀鑒定項(xiàng)目

整體性狀體型、體色

冠羽性狀冠羽顏色、形狀、羽軸結(jié)構(gòu)

面部性狀眼先顏色、裸皮顏色、形狀

頸胸、背部性狀羽色、形狀

4.3形態(tài)特征

4.3.1整體性狀

4.3.1.1個(gè)體較大，雄性體重3850g～5000g，雌性體重1060g～1160g，體羽主要呈金翠綠色。

4.3.1.2雄鳥頭頂具一簇直立的冠羽，下背具閃耀紫輝的銅錢狀花斑；尾屏發(fā)達(dá)，長(zhǎng)可達(dá)1m，羽端

有一閃耀藍(lán)色和翠綠色相嵌的眼狀斑；尾羽黑褐色，形短而隱于尾屏下；初級(jí)覆羽和初級(jí)飛羽棕黃色。

4.3.1.3雌鳥無尾屏，初級(jí)飛羽外翈有黑色橫斑，背羽多呈黑褐色而密布棕褐色斑紋，羽色也較淡鈍，

不如雄鳥艷麗。

4.3.2冠羽性狀

4.3.2.1冠羽顏色：羽緣具翠綠色寬緣，中央呈輝藍(lán)色。

4.3.2.2冠羽形狀：簇狀。

4.3.2.3羽枝結(jié)構(gòu)：羽軸兩側(cè)由羽基至頂端均著生羽小枝。

4.3.3頰部性狀

4.3.3.1眼周裸皮呈淺鈷藍(lán)色，頰部裸皮呈淺鈷黃色。

4.3.3.2眼先雄性藍(lán)黑色，雌性棕褐色。

4.3.4頸胸背性狀

頸胸部及上背部呈金銅色的銅錢狀花斑，羽基暗紫藍(lán)色，常展露于外，羽緣閃翠綠色。

4.4綠孔雀與藍(lán)孔雀性狀差別

綠孔雀與藍(lán)孔雀整體形態(tài)對(duì)比參見附錄A圖A.1。綠孔雀與藍(lán)孔雀之冠羽、頰部以及頸胸背性狀對(duì)比

見附錄A圖A.2。

4.5疑似綠孔雀?jìng)€(gè)體形態(tài)鑒定

將待檢個(gè)體與純種綠孔雀按4.3、4.4條要求進(jìn)行逐一觀察、比對(duì)及記錄，全部性狀符合純種綠孔雀

形態(tài)學(xué)特征，判定為疑似綠孔雀。

5分子鑒定

2

DB53/T1067—2021

5.1鑒定材料

經(jīng)形態(tài)鑒定為疑似綠孔雀或無法進(jìn)行形態(tài)鑒定的個(gè)體的血液、羽毛樣品等。

5.2鑒定原理

綠孔雀與藍(lán)孔雀（Pavocristatus）存在顯著的基因組水平遺傳分化，可通過計(jì)算和統(tǒng)計(jì)待檢樣品

基因組中兩物種的遺傳組成貢獻(xiàn)率判斷其種質(zhì)資源狀況。

5.3樣品采集

5.3.1樣品采集中的動(dòng)物福利應(yīng)符合GB/T35892的要求。

5.3.2血液采集使用一次性真空采血管（添加EDTA-K2）采血50μL～100μL。血樣短期保存于-20℃

冰箱，長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱。

5.3.3血液不可獲取時(shí)，可用無菌塑膠手套收集自然脫落飛羽、尾羽或尾上覆羽等。剪取如圖1所示

的羽根部分，短期保存于-20℃冰箱，長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱。

圖1用于DNA提取的羽毛部分示意圖

5.4DNA制備

可采用傳統(tǒng)DNA提取方法（參見附錄B中B.1）或商業(yè)試劑盒提取DNA，常用試劑和儀器參見附錄C，

用于建庫(kù)的DNA宜符合如下要求：

a)使用1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)（DNA完整性膠檢測(cè)見附錄B中B.2）檢測(cè)DNA完整性，

凝膠電泳條帶清晰且應(yīng)在2kb以上（如圖2示例）；

b)使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度（檢測(cè)方法參見附錄B中B.3），在260nm和280nm

的紫外線吸收值比值（OD260/280）在1.8～2.0之間，濃度不低于50ng/uL，總質(zhì)量不低于3

μg。

3

DB53/T1067—2021

圖2瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶示意圖

注：其中M代表DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，1～6代表待檢DNA樣品。圖中DNA主帶清晰且在2Kb以上。

5.5基因組重測(cè)序

開展DNA樣品的小片段基因組文庫(kù)構(gòu)建（即建庫(kù)）和測(cè)序，技術(shù)要求應(yīng)符合GB/T30989的要求。

選擇兩端序列對(duì)讀（即雙端測(cè)序）模式。上述建庫(kù)和測(cè)序可送至商業(yè)公司開展。為保證分析質(zhì)量，每待

檢個(gè)體總測(cè)序原始數(shù)據(jù)量不低于5Gbp，去除接頭序列以備后需分析。

5.6參考基因組選擇

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇已發(fā)布最新版本的純種藍(lán)孔雀基因組（如GenBank訪問號(hào)：GCA_005519975.1）

和純種綠孔雀基因組（如GenBank訪問號(hào)：GCA_016647715.1）作為參考基因組。

5.7純種鑒定

可采用開源軟件sppIDer，分別計(jì)算和統(tǒng)計(jì)待檢個(gè)體基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)到純種綠孔雀和藍(lán)孔雀

參考基因組成分的比例。當(dāng)藍(lán)孔雀的基因組貢獻(xiàn)率低于1%時(shí)，軟件判定待檢個(gè)體為純種綠孔雀?jìng)€(gè)體。

當(dāng)藍(lán)孔雀的基因組貢獻(xiàn)率高于1%時(shí)，軟件判定待檢個(gè)體為非綠孔雀純種個(gè)體，鑒定結(jié)果模板參見附錄D。

4

DB53/T1067—2021

附錄A

（資料性）

藍(lán)孔雀和綠孔雀性狀對(duì)比圖

圖A.1綠孔雀與藍(lán)孔雀整體形態(tài)對(duì)比

注：引自DanielGiraudElliot,1872.AmonographofthePhasianidae,or,Familyofthepheasants.

圖A.2綠孔雀與藍(lán)孔雀的冠羽、面部以及頸胸背部性狀對(duì)比

注：引自DanielGiraudElliot,1872.AmonographofthePhasianidae,or,Familyofthepheasants.

5

DB53/T1067—2021

附錄B

（資料性）

DNA樣品的提取與檢測(cè)

B.1使用傳統(tǒng)方法提取血液或羽毛DNA

B.1.1取5μL～10μL血液或1～3個(gè)來自同一個(gè)體的羽根于1.5mL離心管中。如是羽根，使用滅過菌

的眼科剪剪碎。

B.1.2加入500μL于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（配方為：100mMTris-HCl，5mMEDTA，500mMNaCl，

1%SDS，pH8.0），混勻懸濁液。

B.1.3向裂解產(chǎn)物中加入20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL），混勻后，放入恒溫混勻儀于1000rpm混勻

頻率和55℃消化3h以上，但不要超過10h。

B.1.4將消化液溫度降至室溫，加入200μL醋酸鉀溶液上下顛倒搖晃20s左右，使其充分混合。

B.1.5放入普通高速離心機(jī)中13000rpm離心5min，使蛋白/SDS復(fù)合物沉淀。

B.1.6將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈1.5mL離心管中，加入600μL異丙醇，充分混合，用13000rpm離心

5min收集DNA沉淀。

B.1.7倒去上清，加入500μL70％乙醇溶液，顛倒管子數(shù)次，用13000rpm離心3min。

B.1.8倒去上清，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上敞口放置3min～10min促使殘余乙醇揮發(fā)。

B.1.9將DNA沉淀溶解于50μL～100μL雙蒸水中，吸取5μL用于瓊脂糖凝膠檢測(cè)和核酸定量檢測(cè)，其

余轉(zhuǎn)入-20℃保存。

B.2DNA完整性膠檢測(cè)

B.2.1用雙蒸水洗凈制膠模板和梳子，調(diào)節(jié)水平，放在制膠平板上，向電泳槽中倒入1XTAE電泳緩沖液，

其量以沒過電泳槽0.2cm為宜。

B.2.2稱取1g瓊脂糖與100mL1xTAE緩沖液，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，旋轉(zhuǎn)搖晃均勻。

B.2.3微波爐內(nèi)加熱2.5min，取出后加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。

B.2.4倒入膠槽，加入梳子，室溫下放置30min至凝膠完全凝結(jié)，小心向上拔出梳子，將凝膠預(yù)浸在電

泳槽內(nèi)，靜置2min至加樣孔內(nèi)無氣泡。

B.2.5使用移液器取1μLDNA樣品，與1μL6×loadingbuffer混勻后，加入凝膠的加樣孔內(nèi)。

B.2.6接通電泳儀電源，保證加樣孔的一端朝向負(fù)極，150V恒壓運(yùn)行20min～40min，loadingbuffe

r中溴酚藍(lán)代表的片段大小為300bp，電泳中保證該指示劑不要泳動(dòng)出凝膠。

B.2.7電泳完畢，關(guān)閉電源，在凝膠成像儀紫外模式下觀察電泳帶及其位置，并與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Mar

ker比較以判斷DNA樣品的完整性。

B.3DNA純度和濃度測(cè)量

B.3.1本文件采用的紫外分光光度計(jì)為NanoDrop2000，若用其它品牌和型號(hào)的儀器，分析步驟請(qǐng)參考

具體說明書。

B.3.2啟動(dòng)NanoDrop2000配套軟件，設(shè)置檢測(cè)樣品為“核酸”，進(jìn)入檢測(cè)界面。

B.3.3命名樣品ID，設(shè)置樣品類型為DNA，使用雙蒸水作為空白液進(jìn)行基線校準(zhǔn)。

B.3.4使用濾紙擦凈空白液，依次檢測(cè)DNA樣品。

6

DB53/T1067—2021

B.3.5測(cè)量結(jié)束后，將測(cè)量參數(shù)輸出到表格，使用雙蒸水和濾紙清潔3～5次，并關(guān)閉軟件。

7

DB53/T1067—2021

AA

附錄C

（資料性）

試劑及儀器設(shè)備

C.1主要試劑

C.1.150×TAE緩沖液(Tris-醋酸鹽-EDTA)：一種核酸電泳緩沖液，主要用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳。

主要成分為Tris-乙酸鹽（濃度40mM）和EDTA（濃度1mM）?？芍苯佑秒p蒸水稀釋50倍至工作濃度（1×）

使用。

C.1.2核酸熒光染料：用于凝膠成像顯示條帶。

C.1.36xLoadingBuffer：瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液，可以顯示兩條帶，前面的藍(lán)色條帶是溴酚藍(lán)，

代表的片段大小是300bp，后面的綠色條帶是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。

C.1.4蛋白酶K溶液：用于核酸與蛋白質(zhì)的分離，濃度為10mg/mL。

C.1.53M醋酸鉀溶液：取60mL的5mol/L醋酸鉀，加11.5mL冰醋酸，加雙蒸水稀釋至100mL，

PH4.8。

C.1.6異丙醇：分析純級(jí)。

C.1.770%乙醇溶液。

C.1.8雙蒸水：ddH2O。

C.1.9瓊脂糖。

C.1.10細(xì)胞裂解緩沖液：100mMTris-HCl，5mMEDTA500mMNaCl，1%SDS,pH8.0。

C.1.11蛋白酶K。

C.1.12SDS：十二烷基硫酸鈉。

C.1.13DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker：100bp～2000bp。

C.2儀器設(shè)備

C.2.1單道可調(diào)式移液器（如，最大量程分別為3μL，20μL，200μL，1000μL）。

C.2.2恒溫混勻儀。

C.2.3普通高速離心機(jī)。

C.2.4電子天平（量程0.01mg～10000mg）。

C.2.5高壓滅菌器。

C.2.6水平電泳儀。

C.2.7凝膠成像系統(tǒng)。

C.2.8紫外分光光度計(jì)。

8

DB53/T1067—2021

B

附錄D

（資料性）

鑒定結(jié)果樣表

鑒定結(jié)果見表D.1。

表D.1鑒定結(jié)果

鑒定個(gè)體編號(hào)：________；個(gè)體年齡_______；個(gè)體性別_______；鑒定人_______。

結(jié)果描述

鑒定方法鑒定內(nèi)容

綠孔雀藍(lán)孔雀其他

雄性□體羽呈金翠綠色□體羽呈藍(lán)色□體羽呈混雜

整體性狀

雌性□體羽呈金翠綠色□體羽呈棕褐色□體羽呈混雜

冠羽性狀□冠羽簇形□冠羽傘狀□冠羽性狀雜合

□眼先呈藍(lán)黑色□眼先呈亮藍(lán)色□混雜

形態(tài)鑒定（如未雄性□眼周裸皮淺鈷藍(lán)色□眼周裸皮白色□眼周裸皮雜色

開展，可不填此□頰部裸皮淺鈷黃色□頰部裸皮白色□頰部裸皮雜色

面部性狀

項(xiàng)）□眼先呈棕褐色□眼先呈銹褐色□混雜

雌性□眼周裸皮淺鈷藍(lán)色