ICS65.020.20

CCSB16

3707

濰坊市地方標準

DB3707/T133—2024

西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforidentificationofwatermelonfusariumwilt

pathogen

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2024-12-19發(fā)布2025-01-20實施

濰坊市市場監(jiān)督管理局??發(fā)布

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目次

前言..................................................................................II

1范圍.................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.......................................................................1

3術(shù)語和定義...........................................................................1

4鑒定程序.............................................................................1

5田間取樣.............................................................................2

6癥狀檢查.............................................................................2

7病原菌的鑒定.........................................................................3

8過程記錄及檔案保存...................................................................4

附錄A（資料性）西瓜枯萎病危害癥狀.....................................................5

附錄B（資料性）馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）配制方法....................................6

附錄C（規(guī)范性）西瓜枯萎病菌致病性測定.................................................7

附錄D（資料性）西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征.................................8

附錄E（資料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取.................................................9

附錄F（資料性）西瓜枯萎病菌PCR檢測..................................................10

參考文獻..............................................................................11

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I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由濰坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、歸口并組織實施。

本文件起草單位：優(yōu)奈爾生物科技有限公司、濰坊郭牌農(nóng)業(yè)科技有限公司、濰坊市農(nóng)業(yè)科學院。

本文件主要起草人：由守昌、楊猛、金炳奎、王昌盛、徐立功、孫繼峰、劉金寶、王海艷、王逍逍、

楊珊、辛國鳳、楊琪、邢石磊。

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II

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西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件確立了西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)程序，規(guī)定了田間取樣、癥狀檢查、病原菌的鑒定、過程記錄

及檔案保存的指示，以及上述階段之間的轉(zhuǎn)換條件，描述了過程記錄、建立檔案等追溯方法。

本文件適用于西瓜枯萎病菌的檢測和鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

SN/T2589-2010界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

癥狀symptom

植物受病原物或不良環(huán)境因素的侵擾后，內(nèi)部的生理活動、外觀或生長發(fā)育所顯示的某種異常狀態(tài)。

[來源：SN/T2589—2010，定義3.2]

4鑒定程序

西瓜枯萎病菌鑒定技術(shù)規(guī)程包括田間取樣、癥狀檢查、病原菌的鑒定、過程記錄及檔案保存4個階

段。程序流程如圖1所示。

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1

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圖1西瓜枯萎病菌鑒定流程圖

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5田間取樣

宜選擇在西瓜枯萎病發(fā)病初期至病情發(fā)展到一定程度（但尚未完全枯死）的植株。取樣時，應戴好

一次性手套，小心地將根部從土壤中取出，隨后迅速將樣本植株放入密封的塑料袋或適宜容器中。在低

溫條件下運輸至實驗室，如將樣品放置在放有冰袋的泡沫盒中或4℃～8℃冷藏小冰箱內(nèi)。運輸過程中

應嚴格避免樣本受到擠壓、碰撞和震動，可在容器內(nèi)放置緩沖材料，如柔軟的泡沫或海綿等。

6癥狀檢查

6.1癥狀檢查操作如下:

a)觀察病株葉部有無西瓜枯萎病的可疑癥狀（見附錄A），如出現(xiàn)葉片萎蔫、發(fā)黃、干枯等。

2

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b)用小刀進行縱切和橫切病株根部病健交界處，觀察有無西瓜枯萎病的可見癥狀（見附錄A），

如基部有褐色條斑或發(fā)生表皮縱裂、維管束變褐等。

6.2樣本在經(jīng)詳細登記（包括樣本來源、取樣時間、取樣地點等信息）和經(jīng)手人簽字后，應存放在4℃

冰箱中冷藏，以備復核。當保存期滿后，應采用高壓滅菌處理后再行處置。應建立樣本保存數(shù)據(jù)庫，記

錄每個樣本的保存位置、保存時長等信息。

7病原菌的鑒定

7.1實驗用儀器設備和主要試劑的準備

7.1.1實驗儀器

實驗儀器包括生物顯微鏡、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、PCR儀、凝膠成像儀、電

泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱、4℃冰箱、-20℃冰箱、組織破碎儀、微量移液器（0.1μL～

2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）等。

7.1.2主要試劑

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。

——1%NaClO、75%酒精、30%滅菌甘油、滅菌石蠟油、瓊脂、DNA提取相關(guān)試劑、PCR相關(guān)試劑、電

泳相關(guān)試劑等。

——試驗中除PCR試驗所用的試劑配制為三級水外，其他用水均為一級水。

——馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）（配制方法見附錄B）。

7.2病原菌的培養(yǎng)

7.2.1直接培養(yǎng)

將樣本根部用75%酒精進行消毒處理30s后，用無菌水沖洗3遍，用1%瓊脂進行保濕，置于28℃條

件下培養(yǎng)2d～4d。

7.2.2分離培養(yǎng)

將病株根部或莖部病健交界處切成5mm左右的小塊，在1%NaClO溶液中浸泡2min，用75%酒精浸泡

15s，無菌水沖洗3次DB3707，滅菌濾紙片濰坊市地方標準全文公開吸干水分后放置在PSA培養(yǎng)基上，用parafilm膜封口，置于28℃恒

溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1d～3d。用挑針挑取單根菌絲接種到新鮮PSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)5d。按照附錄C

的規(guī)定將病原菌接種到健康植株上進行致病性測定，并密切觀察植株在接種后的發(fā)病情況，如發(fā)病時間、

癥狀表現(xiàn)等。

7.3形態(tài)學鑒定

用滅菌牙簽挑取按照7.2條培養(yǎng)獲得的菌絲及分生孢子，制成臨時玻片，在生物顯微鏡下觀察分生

孢子形態(tài)特征（見附錄D）。

病菌在PSA培養(yǎng)基平板上菌落突起，白色致密呈絮狀，菌絲體為有隔菌絲、無色，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)4

d～5d后出現(xiàn)粉紅色，小型分生孢子無色、長橢圓形、單胞或偶有一個分隔。大型分生孢子鐮刀形、無

色、有1個～5個隔膜、多數(shù)為3個隔膜。

7.4分子生物學鑒定

3

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將分離出的可疑菌落，接種到PSA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5d，用無菌手術(shù)刀刮取菌絲，用CTAB法（見

附錄E）提取可疑分離物DNA。將提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、

ACT-512F/ACT-783R作為引物分別擴增病原菌菌株的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（thenuclearribosomal

internaltranscribedspacerregion，ITS）、翻譯延伸因子（translationelongationfactor1-a，

TEF-1）、組蛋白（histoneH3，HIS）、肌動蛋白基因（actingenes，ACT）。將所獲得的片段提交測

序，并根據(jù)參考序列信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見附錄F），從而確定可疑分離物的種類。

7.5結(jié)果判定

應采用形態(tài)學檢測和分子生物學鑒定相結(jié)合的方法，進行結(jié)果判定。

a)分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述，且根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系

統(tǒng)發(fā)育樹，與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠聚到一個分支上，且置信度

大于95%，可判定檢出西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum（FON）。

b)分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合7.3條描述，但根據(jù)ITS、TEF-1、HIS、ACT序列構(gòu)建的系

統(tǒng)發(fā)育樹，與西瓜枯萎病菌參考菌株序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠聚到一個分支上，但置信

度不大于95%或不能夠聚集到一個分支上，可判定未檢出西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.

sp.niveum（FON）。

c)分離菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征不符合7.3條描述，可判定未檢出西瓜枯萎病菌Fusarium

oxysporumf.sp.niveum（FON）。

7.6病原菌的保存

從檢測樣品中分離并鑒定為西瓜枯萎病菌的菌株應妥善保存。將菌株接種于PSA培養(yǎng)基斜面上，在

28℃下培養(yǎng)3d后加入滅菌石蠟油，于4℃冰箱中保存，保存期間定期檢查菌株的存活情況和生長狀態(tài)，

如每隔一個月觀察一次菌落形態(tài)、顏色等變化；或?qū)⒕z塊轉(zhuǎn)入30%滅菌甘油中，使用液氮速凍后置于

-80℃超低溫冰箱中冷凍保存；或收集菌絲進行真空干燥后于-20℃冰箱中低溫保存。

7.7試驗結(jié)果記錄

在接種過程中，準確記錄接種時間、接種部位、接種量等信息；在病原菌的形態(tài)學鑒定和分子生物

學鑒定過程中，應保存相應的菌落照片、孢子照片、詳細記錄實驗條件（如溫度、時間、試劑用量等）

和結(jié)果（如電泳條帶的大小、測序結(jié)果等），同時保存相關(guān)的圖像資料（如電泳圖譜、測序峰圖等）等；

樣品保存過程中，應記錄液氮的使用量、速凍時間以及超低溫冰箱的溫度波動情況、干燥的溫度、真空

度、干燥時間等參數(shù)信息DB3707。濰坊市地方標準全文公開

8過程記錄及檔案保存

完整的試驗記錄應涵蓋樣品的來源（包括種植地點、品種等詳細信息）、種類、取樣時間、試驗的

起始和結(jié)束時間、試驗地點、所采用的方法（包括田間取樣方法、培養(yǎng)條件、鑒定方法等詳細步驟）和

結(jié)果（包括癥狀觀察結(jié)果、病原菌培養(yǎng)結(jié)果、鑒定結(jié)果等）等內(nèi)容，并且每份記錄都應有試驗人員和審

核人員的簽字確認。

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附錄A

（資料性）

西瓜枯萎病危害癥狀

西瓜枯萎病在西瓜生長的各個時期均可發(fā)病，伸蔓期至開花坐果期是西瓜枯萎病敏感期。幼苗發(fā)病

時呈立枯狀，病株莖蔓上的葉片自基部向上逐漸萎蔫，似缺水狀，中午更明顯。最初1d～2d，早晚尚

能恢復正常，數(shù)日后，植株萎蔫不再恢復，慢慢枯死。成株期發(fā)病，病株生長緩慢，下部葉片發(fā)黃，逐

漸向上發(fā)展。開始白天萎蔫，早晚恢復，數(shù)日后全株萎蔫枯死。病蔓基部常有褐色條斑或發(fā)生表皮縱裂，

并伴有樹脂狀膠質(zhì)溢出，莖部維管束變成褐色。潮濕時，莖部呈水浸狀腐爛，表面出現(xiàn)白色至粉紅色霉

狀物。西瓜枯萎病危害癥狀見圖A.1。

a)病株癥狀b)病株維管束病狀

圖A.1西瓜枯萎病田間發(fā)病癥狀

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附錄B

（資料性）

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）配制方法

將洗凈后去皮的馬鈴薯200g切成1cm左右的小塊，加水1000mL煮沸20min，用4層紗布過濾去除

馬鈴薯泥，然后加入20g蔗糖，融化后定容至1000mL，加入10g～15g瓊脂后加熱使瓊脂完全溶化，

將配制好的培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，塞好棉塞后用牛皮紙袋包裹，置于121℃高壓滅菌20min。

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附錄C

（規(guī)范性）

西瓜枯萎病菌致病性測定

選取疑似枯萎病或者測序結(jié)果為枯萎病菌的純培養(yǎng)菌落，采用浸根法接種。

將處于子葉平展期的西瓜苗根系漂洗干凈后，在6×106個孢子·mL-1的孢子懸浮液中浸根15min，

期間搖動孢子懸浮液3次。對照植株在無菌水中浸根15min。接種后幼苗移栽至經(jīng)過121℃高壓濕熱滅

菌2h的過篩土和草炭（1:1）混合的基質(zhì)中。在人工氣候室中培養(yǎng)，溫度26℃/22℃（日/夜），光照

14h/10h（日/夜），相對濕度60%，每個處理接種6株，3次重復，接種3d后剔除萎蔫和枯死的幼苗。

接種4d后開始調(diào)查記錄發(fā)病情況，21d內(nèi)持續(xù)觀察幼苗發(fā)病情況以確認分離菌株的致病性。

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附錄D

（資料性）

西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)特征

西瓜枯萎病病原為尖孢鐮刀菌西瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.niveum（FON），屬半知菌

亞門真菌。病菌產(chǎn)生三種類型的孢子。病菌在PSA培養(yǎng)基平板上菌落突起，白色致密呈絮狀，菌絲體為

有隔菌絲、無色，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d～5d出現(xiàn)粉紅色，小型分生孢子無色、長橢圓形、單胞或偶有一

個分隔。大型分生孢子鐮刀形、無色、有1個～5個隔膜、多數(shù)為3個隔膜。西瓜枯萎病菌菌落形態(tài)及分

生孢子形態(tài)特征見圖D.1。

a)菌落正面形態(tài)b)菌落背面形態(tài)

c)大型分生孢子d)小型分生孢子

DB3707濰坊市地方標準全文公開圖D.1西瓜枯萎病菌形態(tài)

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附錄E

（資料性）

西瓜枯萎病菌DNA的提取

DNA提取步驟如下：

a)將待測菌株于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，收集菌絲；

b)將收集的菌絲，放入含有破碎珠的破碎管中，將CTAB提取緩沖液加入到破碎管中，擰緊蓋子后，

放于組織破碎儀中進行破碎；

c)將破碎管放于65℃水浴鍋中，孵育30min，中間顛倒混勻2次；

d)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（體積比為25:24:1），混勻，12000rpm/min，4℃離心10min；

e)吸取上清液至1.5mL離心管中，重復步驟d）一次；

f)加入2倍或2.5倍的預冷無水乙醇和1/103MNaAc（pH5.2）（或用0.6倍的預冷異丙醇沉淀），

室溫沉淀20min，12000rpm/min離心10min；

g)用70%的乙醇洗滌沉淀兩次；

h)真空干燥或放入超凈工作臺自然吹干后，用40μL去離子水（或含RNase）進行溶解，用Nanodrop

檢測DNA的純度和濃度后，保存于-20℃冰箱中備用。

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附錄F

（資料性）

西瓜枯萎病菌PCR檢測

F.1PCR：以所提取的真菌基因組DNA為模板，用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、

ACT-512F/ACT-783R為引物分別擴增真菌的ITS、TEF-1、HIS、ACT基因（見表F.1）。

表F.1真菌鑒定用引物信息

擴增基因引物名稱引物序列退火溫度（℃）擴增片段大?。╞p）參考文獻

ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS54500-750Whiteetal.，1990

ITS45’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

EF1-728F5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’

EF52300-450Carbone&Kohn，1999

EF1-986R5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’

ACT-512F5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’

ACT56300-450Crousetal.，2004

ACT-783R5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’

CYLH3F5’-AGGTCCACTGGTGGCAAG-3’

HIS