[15]，由此我們推測SlSL1可能也通過K域結(jié)合互作蛋白，但實際情況還需要進一步的實驗驗證。在此基礎(chǔ)上設(shè)計特異性引物將以上六個基因按照-MIKC、-IKC，-MI，-C不同結(jié)構(gòu)域進行截短（REF_Ref163412755\r\h圖3-3）?；蚪囟棠Ｊ綀DFig.3-3GeneTruncationPatternDiagram隨后構(gòu)建酵母雙雜截短蛋白載體并轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株。檢驗pGBKT7-SlSL1-MI、pGBKT7-SlSL1-IKC和pGBKT7-SlSL1-C的Y2H酵母的毒性和自激活情況（圖3-2），毒性檢測實驗結(jié)果顯示將三者轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold后均能在Trp培養(yǎng)基上正常生長，自激活實驗結(jié)果顯示將三者與pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母后接種于四缺培養(yǎng)基上均不能正常生長，說明三者均無毒性和自激活現(xiàn)象發(fā)生。pGBKT7-SlSL1-MI/IKC/C酵母毒性及自激活檢驗A：pGBKT7-SlSL1-MI/IKC/CY2H酵母毒性檢測，培養(yǎng)基為-Trp缺素培養(yǎng)基，Y2H菌株為陰性對照；B：pGBKT7-SlSL1-MI/IKC/CY2H酵母自激活檢測Fig.3-4Self-activationanalysisforyeastofpGBKT7-SlSL1-MI/IKC/CA,ToxicityanalysisforyeastofpGBKT7-SlSL1-MI/IKC/C,yeastcellsgrownonSDmediumlackingTrpandY2Hyeastasnegativecontrol;B,Self-activationofpGBKT7-SlSL1-MI/IKC/Cinyeast根據(jù)附表一的組合進行酵母雙雜截短實驗，步驟與酵母雙雜全長實驗相同，結(jié)果顯示SlSL1與五個MADS-box家族蛋白的互作情況一致：所有組合的酵母均能夠在二缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu）上正常生長，但只有SlSL1-F＋prey-IKC、SlSL1-IKC＋prey-F和SlSL1-IKC＋prey-IKC和全長一樣能夠在四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal）上生長并變藍（圖）。對結(jié)果進行分析，SlSL1-F＋prey-IKC組合能互作說明互作結(jié)構(gòu)域為I域、K域或者C末端，Gene-MI的所有組合均不能在四缺培養(yǎng)基上生長，所以互作結(jié)構(gòu)域不可能為I域，同時我們知道Gene-C的組合均不互作，因此排除C末端，可知SlSL1與MC、SEP3、FUL1、FUL2和JOINTLESS三個蛋白互作形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域為K域。酵母雙雜探究SlSL1與MADS-box家族蛋白互作結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交探究SlSL1與JOINTLESS、MC、SEP3、FUL1及FUL2蛋白互作結(jié)構(gòu)域。培養(yǎng)基為二缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu）和四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu）加40μg/mlX-α-gal和100ng/mlAbA。Fig.3-5Yeasttwo-hybridexperimentinvestigatingtheinteractiondomainbetweenSlSL1andMADS-boxproteinfamilyYeasttwo-hybridexperimentexplorestheinteractiondomainofSlSL1withJOINTLESS,MC,SEP3,FUL1,andFUL2proteins.Themediausedweretwo-dropoutmedia(SD/-Trp/-Leu)andfour-dropoutmedia(SD/-Trp/-Ade/-His/-Leu)supplementedwith40μg/mlX-α-galand100ng/mlAbA.3.3酵母三雜交探究SlSL1與同家族蛋白互作關(guān)系3.3.1酵母三雜交SlSL1、MC和JOINTLESS三個蛋白互作情況分析2012年Toshitsugu等人的研究發(fā)現(xiàn)，在番茄中，MC和JOINTLESS能夠發(fā)生互作形成復(fù)合物調(diào)控離層的發(fā)育，實驗室前期進行酵母雙雜實驗驗證了SlSL1能夠分別與MC、JOINTLESS蛋白互作，那么MC和JOINTLESS是否能夠和SlSL1形成三元復(fù)合物進而調(diào)控離層發(fā)育呢？為此我們設(shè)計了酵母三雜交對SlSL1、MC和J三個蛋白的互作情況進行探究。在酵母三雜交實驗中，分別將SlSL1、MC和JOINTLESS三個蛋白作為橋梁蛋白，構(gòu)建pBridge-SlSL1-MC（link）、pBridge-SlSL1-JOINTLESS（link）、pBridge-MC-SlSL1（link）、pBridge-JOINTLESS-SlSL1（link）分別和對應(yīng)的另一個基因的PGADT7-prey載體進行酵母三雜交實驗。實驗結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)化的酵母菌均能夠在SD/-Trp/-His/-Met/-Leu/X-a-Gal/Aba培養(yǎng)基和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-a-Gal/Aba培養(yǎng)基上生長并變藍（圖3-3），這說明在酵母細胞中bait和prey之間存在相互作用，下游報告基因被激活表達，進一步說明SlSL1、MC和JOINTLESS能夠形成三元復(fù)合物，參與調(diào)控番茄離層的發(fā)育。酵母三雜交SlSL1、MC和JOINTLESS三個蛋白互作情況分析酵母細胞分別在-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA和-Trp/-Met/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA四缺培養(yǎng)基上的生長情況。Fig.3-6AnalysisoftheinteractionamongproteinsSlSL1,MC,andJOINTLESSbyyeastthree-hybridYeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinAandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandMetwith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinA.3.3.2酵母三雜交SlSL1、SlMBP21、MC、JOINTLESS四個蛋白互作情況分析2012年的研究發(fā)現(xiàn)MC和JOINTLESS能夠互作形成復(fù)合物調(diào)控番茄離層的發(fā)育，隨后的研究認為SlMBP21、MC和JOINTLESS三個蛋白能形成蛋白復(fù)合物，并且推測他們能夠與另一個未知蛋白形成四聚物調(diào)控下游WUS、LS、GOB等相關(guān)基因的表達，影響離層和萼片的發(fā)育。結(jié)合已有報道及SlSL1能夠分別與MC、JOINTLESS蛋白互作的實驗結(jié)果，我們推測SlSL1調(diào)控作用機制與JOINTLESS-MC-SlMBP21蛋白復(fù)合物有一定的關(guān)系。由此我們對SlSL1和SlMBP21蛋白的互作情況進行了分析。我們首先進行酵母雙雜交實驗，將pGBKT7-SlSL1＋pGADT7-SlMBP21與pGADT7-SlSL1＋pGBKT7-SlMBP21酵母菌Mating后接種至二缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu），兩者均能夠在二缺培養(yǎng)基上正常生長，再將其接種至四缺培養(yǎng)基（SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-a-Gal/Aba）后則不能正常生長，說明SlSL1蛋白并不能與SlMBP21蛋白發(fā)生互作。酵母雙雜交驗證SlSL1和SlMBP21蛋白互作情況pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照，pGBKT7-Lam+pGADT7-T為陰性對照，培養(yǎng)基為二缺培養(yǎng)基（-Trp/-Leu）和四缺培養(yǎng)基-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA。Fig.3-7Yeasttwo-hybridanalysisbetweenSlSL1andSlMBP21YeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,LeuandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinA;pGBKT7-53+pGADT7-Twaspositivecontrol,pGBKT7-Lam+pGADT7-Twasnegativecontrol.隨后進行酵母三雜交實驗，以SlSL1為橋梁蛋白，構(gòu)建pBridge-JOINTLESS-SlSL1（link）和pBridge-MC-SlSL1（link）載體，分別與PGADT7-SlMBP21載體共轉(zhuǎn)化酵母，其結(jié)果顯示兩者均能正常在兩種四缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-His/-Met/-Leu/X-a-Gal/Aba和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-a-Gal/Aba上生長并變藍。同時利用已有的pBridge-SlSL1-MC（link）、pBridge-SlSL1-JOINTLESS（link）載體分別與pGADT7-SlMBP21共轉(zhuǎn)化酵母，其結(jié)果顯示兩者不能在四缺培養(yǎng)基上生長。已知SlSL1蛋白并不與SlMBP21蛋白發(fā)生互作，所以當SlSL1作為橋梁蛋白時并不會對MC和JOINTLESS分別與SlMBP21蛋白形成蛋白復(fù)合物產(chǎn)生影響，因此這兩種組合能夠激活報告基因的表達，但當MC和JOINTLESS作為橋梁蛋白時，報告基因不能被激活，說明MC和JOINTLESS并不能作為橋梁蛋白將SlSL1蛋白與SlMBP21蛋白連接形成蛋白復(fù)合物。綜上所述，我們推測植物體內(nèi)可能同時存在SlSL1-MC-JOINTLESS和SlMBP21-MC-JOINTLESS兩種三元復(fù)合物，但是SlSL1、MC、JOINTLESS和SlMBP21四個蛋白并不能形成四元蛋白復(fù)合物。SlSL1、SlMBP21、MC、JOINTLESS四個蛋白互作情況分析酵母三雜交分析四個蛋白的互作情況，酵母細胞分別在-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA和-Trp/-Met/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA四缺培養(yǎng)基上的生長情況。Fig.3-8AnalysisofinteractionoffourproteinsSlSL1,MC,JOINTLESSandSlMBP21bytheyeastthree-hybridYeastthree-hybridanalysisofSlSL1,MC,JOINTLESSandSlMBP21;YeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinAandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandMetwith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinA.3.3.3酵母三雜交SlSL1、SEP3、MC、JOINTLESS四個蛋白互作情況分析在植物ABCDE開花調(diào)控模型中，SEP3是一個調(diào)控花器官發(fā)育重要的E類蛋白，該蛋白通過與其他花器官特征決定基因形成蛋白復(fù)合物維持四輪花器官的正常發(fā)育，同時SEP3還在多聚物的形成過程中發(fā)揮重要的作用。在3.1中我們證實了SlSL1能夠與SEP3發(fā)生互作，由此推測SEP3也可能與SlSL1形成多元復(fù)合物，于是設(shè)計了SlSL1、SEP3和MC、JOINTLESS四個蛋白的酵母三雜交實驗。構(gòu)建pBridge-SEP3-SlSL1（link）載體，分別與pGADT7-JOINTLESS和pGADT7-MC共轉(zhuǎn)化酵母，同時將pBridge-SlSL1-JOINTLESS（link）和pBridge-SlSL1-MC（link）載體分別與pGADT7-SEP3共轉(zhuǎn)化酵母，結(jié)果顯示以上組合均能激活報告基因表達，酵母細胞在兩種四缺培養(yǎng)基上正常生長并變藍（圖）。以上結(jié)果說明SlSL1、SEP3和MC、JOINTLESS分別能夠形成SlSL1-SEP3-JOINTLESS、SlSL1-SEP3-MC蛋白復(fù)合物，同時我們知道MC和JOINTLESS能夠形成二元復(fù)合物，因此推測SlSL1除了能與MC和JOINTLESS形成三元蛋白復(fù)合物，還能夠依靠SEP3形成四元蛋白復(fù)合物調(diào)控離層和萼片的發(fā)育，不過是否能夠形成SlSL1-SEP3-MC-JOINTLESS還有待進一步的實驗驗證。SlSL1、SEP3、MC、JOINTLESS四個蛋白互作情況分析酵母細胞分別在-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA和-Trp/-Met/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA四缺培養(yǎng)基上的生長情況。Fig.3-9AnalysisofinteractionoffourproteinsSlSL1,MC,JOINTLESSandSEP3bytheyeastthree-hybridYeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinAandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandMetwith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinA.3.3.4酵母三雜交SlSL1、FUL1、FUL2及RIN蛋白的互作分析Marian和Wang等分別在2012年和2014年證實了FUL1和FUL2能夠與RIN蛋白形成蛋白復(fù)合物共同調(diào)控番茄果實的成熟，并且FULs基因?qū)Ψ压麑嵆墒斓恼{(diào)控部分依賴于與RIN蛋白形成復(fù)合物之后對下游基因進行調(diào)控。因此我們設(shè)計實驗進一步對SlSL1、FUL1/2、RIN蛋白之間的互作情況進行了研究分析。實驗室前期證實了SlSL1和FUL1、FUL2蛋白存在互作關(guān)系，對pGBKT7-SlSL1＋pGADT7-RIN與pGADT7-SlSL1＋pGBKT7-RIN組合進行酵母雙雜實驗，結(jié)果顯示兩個組合均不能在四缺培養(yǎng)基上正常生長，說明SlSL1蛋白不能直接和RIN蛋白發(fā)生互作。酵母雙雜交驗證SlSL1和RIN蛋白互作情況pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照，pGBKT7-Lam+pGADT7-T為陰性對照，培養(yǎng)基為二缺培養(yǎng)基（-Trp/-Leu）和四缺培養(yǎng)基-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA。Fig.3-10Yeasttwo-hybridanalysisbetweenSlSL1andRINYeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,LeuandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinA;pGBKT7-53+pGADT7-Twaspositivecontrol,pGBKT7-Lam+pGADT7-Twasnegativecontrol.將SlSL1作為橋梁蛋白構(gòu)建pBridge-FUL1-SlSL1（Link）和pBridge-FUL2-SlSL1（Link）載體，利用酵母三雜交技術(shù)將兩個載體分別和pGADT7-RIN載體共轉(zhuǎn)化Y2H酵母菌株，并觀察轉(zhuǎn)化子在兩種四缺培養(yǎng)基上的生長情況，在普通四缺培養(yǎng)基上MCSⅠ蛋白被誘導(dǎo)表達，而在Met缺陷培養(yǎng)基上，MCSⅡ位點蛋白即SlSL1也被誘導(dǎo)表達。實驗結(jié)果顯示，對照pBridge-FUL1-empty和pGADT7-RIN能在兩種缺陷培養(yǎng)基上正常生長，pBridge-FUL1-SlSL1和pGADT7-RIN也能夠在SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-a-Gal/Aba培養(yǎng)基上生長并變藍，說明FUI1和RIN能夠互作激活報告基因表達，但不能夠在SD/-Trp/-His/-Met/-Leu/X-a-Gal/Aba四缺培養(yǎng)基上正常生長，說明在Met缺陷培養(yǎng)基上，SlSL1蛋白被誘導(dǎo)表達并抑制了FUL1與RIN蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，使得報告基因不能被激活。FUL2基因的結(jié)果與FUL1相一致。推測在番茄植株中SlSL1可能通過與RIN蛋白競爭性結(jié)合FUL1和FUL2從而調(diào)控番茄果實的成熟與發(fā)育。SlSL1、FUL1、FUL2、RIN四個蛋白互作情況分析酵母三雜交分析四個蛋白的互作情況，酵母細胞分別在-Trp/-Ade/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA和-Trp/-Met/-His/-Leu+40μg/mlX-α-gal+100ng/mlAbA四缺培養(yǎng)基上的生長情況。Fig.3-11AnalysisofinteractionoffourproteinsSlSL1,FUL1,FUL2andRINbytheyeastthree-hybridYeastthree-hybridanalysisoffourproteins;YeastcellsgrownonSDmediumlackingTrp,Leu,HisandAdewith40μg/mlX-α-gal,100ng/mlAureobasidinAandSDmediumlackingTrp,Leu,HisandMetwith40μg/mlX-α-gal，100ng/mlAureobasidinA.

結(jié)論MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個階段，是植物正常生長必需的轉(zhuǎn)錄因子，但目前在番茄中對于該家族轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究還不夠完善。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)番茄MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子SlSL1參與調(diào)控果實成熟及離層的發(fā)育，但機制尚不明