臨床PCR技術(shù)2021/3/29星期一1KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制模型。一、PCR概述2021/3/29星期一2一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過重復(fù)DNA合成，以擴(kuò)增特定核苷酸序列的方法。特點(diǎn)高靈敏度高特異性體外進(jìn)行快捷2021/3/29星期一3PCR的概念核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個(gè)循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項(xiàng)突破性技術(shù)。2021/3/29星期一4PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文篇2021/3/29星期一5一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)2021/3/29星期一6二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）核酸提取1.DNA提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板2021/3/29星期一7二、實(shí)驗(yàn)步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA棄上清重復(fù)洗2次50ul血清2021/3/29星期一83、細(xì)胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴(kuò)增雜交顯色2021/3/29星期一9（二）擴(kuò)增HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC

下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG擴(kuò)增體系：（50μl體系）

10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA

---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl2021/3/29星期一10反應(yīng)程序預(yù)變性94

C3min循環(huán)延伸72

C5min。注：每組實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照用無菌生理鹽水代替模板58

C45s72

C45s94

C45s30循環(huán)2021/3/29星期一11（三）結(jié)果判讀2021/3/29星期一12（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題污染：表現(xiàn)為陰性對(duì)照同樣出現(xiàn)目的條帶或陰性對(duì)照出現(xiàn)‘S’形曲線。污染的來源：來自其他測(cè)試樣品的DNA來自試驗(yàn)材料如重組克隆的DNA外源DNA污染來自同一靶序列前一次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2021/3/29星期一13（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染實(shí)驗(yàn)室分區(qū)2021/3/29星期一14酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。紫外線表面照射消除試劑、加樣頭中的DNA污染。對(duì)短PCR產(chǎn)物效果不好以預(yù)防污染為主良好的實(shí)驗(yàn)室操作2021/3/29星期一15三、熒光定量PCR2021/3/29星期一16（一）熒光PCR定量的概念

以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，通過擴(kuò)增及對(duì)熒光值的監(jiān)測(cè)，對(duì)PCR起始模板量的定量。2021/3/29星期一17（二）熒光定量PCR原理染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)記TaqManTM

分子信標(biāo)(Molecularbeacons)2021/3/29星期一18TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'2021/3/29星期一19（三）定量PCR的數(shù)學(xué)原理PCR理論方程N(yùn)=N0x(1+E)nN: 擴(kuò)增數(shù)量N0: 起始模板數(shù)量E： 擴(kuò)增效率n: 循環(huán)數(shù)

2021/3/29星期一20指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期Geometric2021/3/29星期一21PCR曲線線性圖譜半對(duì)數(shù)圖譜2021/3/29星期一22起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量終點(diǎn)定量“加進(jìn)不同拷貝的膜板”半對(duì)數(shù)圖譜線性圖譜2021/3/29星期一23同一個(gè)樣品重復(fù)96次起點(diǎn)定量的優(yōu)勢(shì)終點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：誤差太大拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小2021/3/29星期一24起點(diǎn)定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號(hào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著增長(zhǎng)(穿過閾值線)時(shí)的循環(huán)次數(shù)CT值半對(duì)數(shù)圖譜CT值線性圖譜2021/3/29星期一25CT

起始DNA濃度當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時(shí)：RT=RB+X0(1+E)CT

Rs

lg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b（線性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRs2021/3/29星期一26CT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0+b2021/3/29星期一27四、PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用

（一）標(biāo)本采集要求2021/3/29星期一28項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無菌試管。。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)，陽性率才會(huì)高。（于發(fā)熱時(shí)抽?。㎝P

咽拭子2021/3/29星期一29項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV2021/3/29星期一30（二）結(jié)果分析、報(bào)告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較2.定量PCR測(cè)定的臨床意義3.定性PCR測(cè)定的臨床意義4.定性和定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告及解釋2021/3/29星期一311.定性PCR與定量PCR的比較2021/3/29星期一32瓊脂糖凝膠電泳2021/3/29星期一33定量PCR擴(kuò)增曲線圖2021/3/29星期一342.定量PCR的臨床意義對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè)彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對(duì)治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測(cè)用于基因表達(dá)方面的研究2021/3/29星期一35某患者HBV-DNA的PCR結(jié)果動(dòng)態(tài)圖日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+02021/3/29星期一363、定性測(cè)定的臨床應(yīng)用診斷用于篩檢耐藥突變檢測(cè)病毒基因型檢測(cè)GGAGGGAGAAAA2021/3/29星期一374.定性和定量測(cè)定的結(jié)果報(bào)告及解釋（1）定性陰性陽性（2）定量(以我科參考值為例)HBV-DNA<100IU/ml(不同項(xiàng)