序

生物化學(xué)是一門重要的實(shí)驗(yàn)性基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)科。生物化學(xué)所闡述的是人體物質(zhì)

組成、物質(zhì)代謝過程、代謝平衡的調(diào)控、物質(zhì)代謝與生理機(jī)能之間的關(guān)系等內(nèi)容,

是進(jìn)一步學(xué)習(xí)其他基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科和臨床醫(yī)學(xué)課程必備的基礎(chǔ)知識(shí)。理論知識(shí)來源于

實(shí)踐研究，生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法不僅為生物化學(xué)的迅速發(fā)展創(chuàng)立了條件，

也為其他基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課是幫助同學(xué)掌

握基本實(shí)驗(yàn)技能、基本實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，提高獨(dú)立思考，獨(dú)立分析和獨(dú)立解決問題

的能力，把同學(xué)們所學(xué)的得生化理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相結(jié)合的重要手段。

近年來，各高等院校在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方面沒有統(tǒng)一的規(guī)定。各院校都是根據(jù)

自己的具體情況，或自己編寫教材，或兒所院校聯(lián)合編寫。雖然編寫的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

不盡相同，但從總體來看，內(nèi)容是接近的。有的院校生物化學(xué)基本試驗(yàn)多一些，

偏重于與理論課相結(jié)合；有的院校大型實(shí)驗(yàn)占的比例大一些，注重同學(xué)們的技能

培養(yǎng)和能力訓(xùn)練。無論哪種形式，都有其長(zhǎng)處。

我們教研室從八三年開始，連續(xù)編寫四版生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。經(jīng)過近二十

年的實(shí)踐，效果較好。在編寫過程中博采眾家之長(zhǎng)，既注意到和理論內(nèi)容相結(jié)合,

又注意到技能的培養(yǎng)和大實(shí)驗(yàn)的操作，做到各方面內(nèi)容兼顧。

這次實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的改編，在原版實(shí)驗(yàn)教材的基礎(chǔ)上加以修改，并增加了大量的

分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。首先，在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上，我們將全部實(shí)驗(yàn)分成兒個(gè)大的板

塊，分類細(xì)致；其次，增加了與臨床聯(lián)系較密切的一些實(shí)驗(yàn)，刪除了一些內(nèi)容相

似、重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。使本實(shí)驗(yàn)教材更適合于我們學(xué)校的實(shí)驗(yàn)條件并達(dá)到培養(yǎng)目標(biāo)的

要求。

我們生化教研室全體同志，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)方面積累了一定的經(jīng)驗(yàn)。

全體同志認(rèn)真的討論原版的實(shí)驗(yàn)教材內(nèi)容并提出許多修訂意見。盡管如此，由于

我們的水平有限，也難免有缺點(diǎn)和錯(cuò)誤，希望生化同仁批評(píng)和指正。

目錄

第一部分生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

第二部分蛋白質(zhì)化學(xué)

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的鹽析作用

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)三服酶的凝膠過濾分離純化

實(shí)驗(yàn)四血清Y-球蛋白的分離純化（分子篩層析法）

實(shí)驗(yàn)五血清蛋白質(zhì)的分離（離子交換層析法）

實(shí)驗(yàn)六胰臟彈性蛋白醐的分離純化（親和層析法）

實(shí)驗(yàn)七血清蛋白質(zhì)的電泳分離

實(shí)驗(yàn)八SDS—PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量

實(shí)驗(yàn)九蛋白質(zhì)印跡免疫分析

第三部分酶作用及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

實(shí)驗(yàn)十酶的特異性、激動(dòng)劑及抑制劑

實(shí)驗(yàn)十一的促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)十二堿性磷酸酶Km值的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)十三乳酸脫氫酶及其輔的1的作用

實(shí)驗(yàn)十四堿性磷酸酶的提取分離和純化及比活性的測(cè)定

第四部分核酸化學(xué)

實(shí)驗(yàn)十五組織中核酸的分離及定量

實(shí)驗(yàn)十六真核生物基因組DNA的制備（苯酚法）

實(shí)驗(yàn)十七DNA與RNA含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)十八瓊脂糖凝膠電泳分離DNA

實(shí)驗(yàn)十九質(zhì)粒DNA的制備（堿變性法）

實(shí)驗(yàn)二十動(dòng)物組織總RNA的提取

實(shí)驗(yàn)二十一聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA

第五部分臨床生化檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)二十二血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)二十三血糖的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)二十四胰島素及腎上腺素對(duì)血糖濃度的影響

實(shí)驗(yàn)二十五尿糖定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二十六運(yùn)動(dòng)對(duì)尿中乳酸含量的影響

實(shí)驗(yàn)二十七酮體的生成和利用

實(shí)驗(yàn)二十八膽固醇提取定性

實(shí)驗(yàn)二十九血清總膽固醇的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)三十尿素生成實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)三十一血清尿素氮測(cè)定

實(shí)驗(yàn)三十二血清無機(jī)磷定量

實(shí)驗(yàn)三十三血清鈣定量（EDTA滴定法）

實(shí)驗(yàn)三十四尿淀粉酶活性測(cè)定（溫氏法）

第一部分生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

一、實(shí)驗(yàn)課的目的要求

【生化實(shí)驗(yàn)課的目的】

1、通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證生化基本理論，加深理解。

2、通過實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握生化基本操作技術(shù)，進(jìn)行基本操作技能訓(xùn)練，培養(yǎng)獨(dú)立工作能力，

為臨床實(shí)際應(yīng)用和從事科研工作打下基礎(chǔ)。

3、通過實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考和實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)。

【生化實(shí)驗(yàn)課要求】

1、實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康模斫鈱?shí)驗(yàn)基本原理及大體操作步驟。

2、實(shí)驗(yàn)中正規(guī)操作，掌握關(guān)鍵環(huán)節(jié)，認(rèn)真觀察，做好記錄，綜合分析，結(jié)果真實(shí)。

3、實(shí)驗(yàn)后及時(shí)總結(jié)，按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

4、遵守實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度，愛護(hù)儀器。節(jié)約用試劑、煤氣、水、電等，保持室內(nèi)衛(wèi)生。

5、注意安全。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室后熟悉水、電、煤氣設(shè)備，實(shí)驗(yàn)后認(rèn)真檢查，杜絕事故發(fā)生。

二、生化實(shí)驗(yàn)的基本操作技術(shù)

1、吸管的使用

吸管是生化實(shí)驗(yàn)中最常用的量器，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度與能否正確使用吸管有密切關(guān)系。

因此必須正確掌握使用方法，熟悉各種吸管的規(guī)格，正規(guī)操作。

常用的吸管有刻度吸管，1、2、5、10ml等，也有0.1>0.2、0.5、0.01、0.05ml等微量

吸管，使用時(shí)注意。

正確使用吸管。取液時(shí)，右手拇指的中指夾住管身上端，使食指能自由按住上口，用吸

球取液體，待液面上升到所需刻度線的上方，迅速用食指按住上口，用濾紙擦去管下端外壁

吸著的多余液體，然后稍松食指，調(diào)整液面下降到所需刻度。看刻度時(shí)使吸管垂直：液面與

眼同高，看與液面凹面底部成切線的刻度。放液時(shí)，把吸管插進(jìn)受器，使吸管尖端接觸管壁,

與受器成一定角度，使液體自然流出。或用食指與上口接觸松緊控制流出速度。在使用吸管

量取總量或用下段時(shí)，必須在液體流出后，停留10?15秒，轉(zhuǎn)動(dòng)吸管，使尖端內(nèi)部液體流出。

使用微量吸管時(shí)，放出液體后，靠壁停留10?15秒，然后把管尖端液體吹出。

2、玻璃儀器的清洗

生化實(shí)驗(yàn)所用器材必須清潔，以免雜質(zhì)污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在定量分析實(shí)驗(yàn)中要求更

加嚴(yán)格。一般清洗方法如下：

1）一般容器如燒杯、試管、三角瓶等用自來水沖洗，用毛刷蘸肥皂粉或去污粉刷洗，然

后用自來水沖洗，器壁光潔不掛水珠，然后以少量蒸儲(chǔ)水沖洗3次。

2）吸管容量瓶等不能用毛刷刷洗，一般用自來水沖洗，然后用洗滌劑浸泡，再用自來水

沖洗，最后用蒸儲(chǔ)水沖洗3次。

3、洗滌液的配制

生化實(shí)驗(yàn)室常用的洗滌液是格硫酸液，一般用濃度為5%、10%。

5%銘硫酸液的配制：取重鋁酸鉀粉末5g,放燒杯中，加水5mL攪拌使其盡量溶解（可

小火加熱），然后緩緩加入粗濃硫酸100ml,邊加邊搖勻。溶液由紅色變成棕紅色，冷卻后

倒入有蓋的容器內(nèi)保存。

格硫酸液清潔效力主要利用強(qiáng)氧化性。當(dāng)遇有被氧化物質(zhì)存在時(shí)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，

氧化作用很強(qiáng)，可以使有機(jī)物炭化，進(jìn)一步氧化分解。硫酸越濃，銘酊越多，則清潔效力越

強(qiáng)。當(dāng)洗液變成綠色，即失去氧化能力。

注意事項(xiàng)：

1）重銘酸鉀有毒，配制和使用時(shí)一定要注意，小心操作。

2）配制銘硫酸液忖注意安全，要把硫酸緩慢地加到水里。

3）使用倍硫酸液時(shí)要小心，不要濺到眼、皮膚和衣服上。

4）用鋁硫酸液浸泡儀器時(shí)，盡量把儀器先用水沖洗干凈，并使其干燥，再浸入洗液內(nèi)，

以防吸水，可以較長(zhǎng)時(shí)間使用。

4、液體的混勻

在生化實(shí)驗(yàn)中，除特殊情況外，一般每加一試劑后，都要隨時(shí)混勻，以保證反應(yīng)充分進(jìn)

行。不混勻則往往影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。簡(jiǎn)單介紹兒種混勻液體的方法：

1）旋轉(zhuǎn)：把容器圓形搖動(dòng)，使液體旋轉(zhuǎn)混勻。

2）振蕩：將試管振蕩、搖動(dòng)。也可以用手掌稍加抵擋給以沖力，便于混勻。注意防止

液體濺出。

3）攪拌：用干凈玻璃棒攪拌混勻。

4）顛倒：當(dāng)容器口細(xì)液體量較多時(shí)，可用瓶蓋把口蓋住，顛倒數(shù)次使液體混勻。如無

瓶蓋可用拇指或手掌按緊管口，顛倒數(shù)次，使液體混勻。

5、沉淀的分離

1）過濾

一般生化實(shí)驗(yàn)中，常用過濾法分離沉淀，濾液用于各種分析。過濾用優(yōu)質(zhì)濾紙和小

漏斗進(jìn)行。先把圓形濾紙對(duì)折兩次成圓椎體與漏斗內(nèi)壁靠緊，濾紙與漏斗壁之間無

氣泡，使過濾速度加快，向?yàn)V紙上傾注液體，沿玻璃棒加于中央，加液量不要過多。

2）離心分離

被分離的液體量過少或粘稠，難以過濾或不適于長(zhǎng)時(shí)間過濾者，可離心分離。

離心法是利用離心力將不同質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行分離。離心力與轉(zhuǎn)速的平方、物質(zhì)質(zhì)量

及旋轉(zhuǎn)半徑成正比。目前常用的電動(dòng)離心機(jī)轉(zhuǎn)速快，分離效果較好，能迅速地使溶

液中的懸浮物沉淀下來，使上清液和沉淀物分離，用于進(jìn)一步分析。

電動(dòng)離心機(jī)的使用方法：

1）檢查離心管套是否有異物，必須徹底清除。

2）平衡對(duì)稱物重量，用天平稱量對(duì)稱位置上的管套、離心管和內(nèi)容物的總重量。

3）將管套放入離心機(jī)對(duì)稱位置，離心管不能過高，最后蓋上離心機(jī)蓋。

4）先將調(diào)速旋鈕轉(zhuǎn)到零位，接通電源，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，逐漸加快轉(zhuǎn)速，待達(dá)到所需轉(zhuǎn)

數(shù)為止，記時(shí)間。

5）先將調(diào)速旋鈕調(diào)到零位，關(guān)閉開關(guān)；等待轉(zhuǎn)動(dòng)自然停止，不能用手強(qiáng)制的使之停止、

開蓋，取出離心管。

注意事項(xiàng)：

1）離心機(jī)需放在牢固平穩(wěn)的地面上，保持水平位置。

2）使用離心機(jī)，關(guān)鍵問題是對(duì)稱位置離心力平衡，不僅對(duì)稱位置上的總重量相等，而

且重心所在位置也應(yīng)對(duì)稱，只有這樣才能保證儀器正常運(yùn)轉(zhuǎn)和得到較好的離心效

果。

3）起動(dòng)和停止都必須逐漸的進(jìn)行，起動(dòng)過快，可能有多余電流變?yōu)闊崮埽袩€的危

險(xiǎn)，振動(dòng)大，易使液體濺出或打破玻璃管。強(qiáng)制停止，會(huì)使沉淀振起來，也會(huì)損

壞儀器。

4）起動(dòng)或離心過程中出現(xiàn)異常響聲時(shí)，要及時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)行檢查。

5）離心過程中勿使液體濺出腐蝕機(jī)體，機(jī)腔內(nèi)保持干燥清潔。

6）離心機(jī)要經(jīng)常檢查和維修。

第二部分蛋白質(zhì)化學(xué)

概述

一、蛋白質(zhì)分子的基本概念

蛋白質(zhì)是特定基因的表達(dá)產(chǎn)物，是含氮的生物大分子，其基本組成單位是氨基酸：組成

蛋白質(zhì)的氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成多肽鏈，并在此基礎(chǔ)上形成特定的立體構(gòu)

象。有些蛋白質(zhì)分子由兩條以上具特定立體構(gòu)象的肽鏈組成。蛋白質(zhì)的立體構(gòu)象決定蛋白質(zhì)

的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能。構(gòu)象破壞使蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并喪失生物學(xué)活性，稱為蛋

白質(zhì)的變性。不同的蛋白質(zhì)氨基酸組成及其在多肽鏈內(nèi)的排列順序不同，立體構(gòu)象及生物學(xué)

功能也各不相同。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能的多樣性是一切生物生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

作為蛋白質(zhì)基本成分的氨基酸共20種。多肽鏈中相當(dāng)于氨基酸的結(jié)構(gòu)單元，稱為殘基。

多肽鏈中具有游離a-氨基的一端稱為N端或氨基端：具有游離a-竣基的一端稱為C端或竣

基端。蛋白質(zhì)分子中還有非肽鏈結(jié)構(gòu)的部分，有些通過共價(jià)鍵連接，有些通過非共價(jià)鍵連接，

統(tǒng)稱輔基。

研究蛋白質(zhì)的目的在于闡明蛋白質(zhì)的分子組成、結(jié)構(gòu)及其與功能的聯(lián)系。它不僅是生物

學(xué)、醫(yī)藥學(xué)工作者重要的研究對(duì)象，也與化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)密切相關(guān)。

二、蛋白質(zhì)的分離和純化

蛋白質(zhì)通過分離純化得到純的或比較純的蛋白質(zhì)是研究蛋白質(zhì)最基本的起點(diǎn)。必須熟悉

并掌握蛋白質(zhì)特有的理化性質(zhì)，確定合適的分離制備方案。這包括生物材料的選擇和處理，

目的蛋白質(zhì)的提取、分離、純化和鑒定。蛋白質(zhì)純化分離的基本目標(biāo)是得到足夠量的具有天

然生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，為此，在整個(gè)分離純化過程中必須避免蛋白質(zhì)的變性和降解。抽提

蛋白質(zhì)的第一步是將組織粉碎、破壞細(xì)胞，一般用低濃度緩沖溶液提取。具體的溶劑系統(tǒng)與

提取條件的選擇因不同組織而異，例如，因?yàn)榧∪庵泻腥樗幔杂袝r(shí)用稀堿提取肌肉中

的蛋白質(zhì)（如乳酸脫氫酶），而最后提取液卻是中性的；又如提取膜蛋白時(shí)加入表面活性劑

以增加溶解度；在提取過程中?般需注意低溫操作，避免強(qiáng)烈攪拌，防止產(chǎn)生大量泡沫，避

免與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及重金屬離子作用，并添加相應(yīng)的蛋白酶抑制劑，如二異丙基氟磷酸（DFP）、

甲苯磺酚氟（PMSF）、對(duì)氯汞苯甲酸（PCMB）和螫合劑（如EDTA）等。有許多實(shí)驗(yàn)技術(shù)可用

于蛋白質(zhì)的分離純化，可選用的常用方法包括：鹽析和有機(jī)溶劑沉淀；透析；各種層析方法

如離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等及電泳法。層析和電泳都是生物化學(xué)中最常用的手

段，廣泛用于各種類型分子的分離和分析，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，相對(duì)地說，層析在大量制備方

面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，而制備電泳要求大功率電源，電流大，必須同時(shí)具有有效的散熱裝置。

三、蛋白質(zhì)的定量

蛋白質(zhì)的定量是研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。各種蛋白質(zhì)的含氮量是相當(dāng)恒定的，平均為16%。

測(cè)定蛋白質(zhì)的含氮量是蛋白質(zhì)定量的經(jīng)典方法，但操作繁瑣。目前應(yīng)用較廣泛的是雙縮胭法、

福林-酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法、考馬氏亮藍(lán)法等。雙縮胭法是基于蛋白質(zhì)分子中

的肽鍵，凡具兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)均有此反應(yīng)，它受蛋白質(zhì)特異氨基酸組成的影響較小，適

用于毫克級(jí)蛋白質(zhì)的測(cè)定；福林-酚試劑法靈敏度高，主要基于蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形

成復(fù)合物，此復(fù)合物以及芳香族氨基酸殘基還原酚試劑而產(chǎn)生藍(lán)色，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（通常采

用牛血清白蛋白）比色定量，如樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸差異較大時(shí)，會(huì)有較大的

系統(tǒng)誤差；紫外吸收法是利用蛋白質(zhì)中含有芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸等），在280nm

左右有吸收峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)比較而定量，但也同樣存在不同蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸含

量不同而有較大差異的問題。紫外吸收法的優(yōu)點(diǎn)是迅速簡(jiǎn)便而且不消耗樣品；考馬氏亮藍(lán)

G-250法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。

四、蛋白質(zhì)純度的鑒定

純凈的蛋白質(zhì)樣品?般是指不含有其他雜蛋白。用于蛋白質(zhì)純度鑒定的方法有各種分

析電泳和層析，如聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）、等

電聚焦（IEF）、毛細(xì)管電泳（CE）、離子交換層折、凝膠過濾和基于蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)的反相

層析等。一些新方法如質(zhì)譜等也引入蛋白質(zhì)的純度的檢測(cè)中。有電泳法檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度時(shí),

應(yīng)取分布在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)不同的pH值分別進(jìn)行檢測(cè)，這樣得出的結(jié)論才較可

靠?一般檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度必須應(yīng)用兩種不同機(jī)理的分析方法才能作出判斷，例如，一個(gè)用

凝膠過濾和SDS證明是純的蛋白質(zhì)樣品，由于這兩種方法的機(jī)理是相同的，因而此判

斷還是不夠充分的。

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的鹽析作用

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.掌握鹽析的原理和方法

2.掌握離心機(jī)的使用

【實(shí)驗(yàn)原理】

用中性鹽類使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出的過程稱為蛋白質(zhì)的鹽析作用。蛋白質(zhì)是親

水膠體，當(dāng)加入適量的輕金屬鹽類時(shí)蛋白質(zhì)分子即處于高滲透壓的溶液中，使蛋白質(zhì)外周水

化膜被破壞，同時(shí)鹽類的離子中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破

壞而沉淀；但此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)沒有改變，仍然保持其天然蛋白質(zhì)的性質(zhì),即可復(fù)

溶解于原來的溶劑中。

沉淀蛋白質(zhì)所需鹽類濃度視蛋白質(zhì)種類而異.呈粗分散系者（如球蛋白）較細(xì)分散系者

（如清蛋白）容易鹽析。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1、取小試管或離心管加蛋清稀釋液1ml及飽和（NHD2SO4（74.5%）溶液1ml混和

后靜置10分鐘，球蛋白即沉淀析出，離心十分鐘（2000轉(zhuǎn)/分）。

2、將離心后的上清液（含有清蛋白），吸出1ml加入另一支小試管，逐漸加入（NHQ2SO4

結(jié)晶粉末，每加一次需用細(xì)玻璃棒充分?jǐn)嚢?，直至粉末不再溶解而達(dá)到飽和狀態(tài)為

止，靜置約十分鐘，離心十分鐘，傾去上清液，此時(shí)的沉淀即為清蛋白。

3、向上述兩個(gè)離心管的沉淀內(nèi)各加水1ml,用細(xì)玻璃棒攪拌沉淀，觀察沉淀能否復(fù)溶,

此得出什么結(jié)論。

【注意事項(xiàng)】

加（NH4）SC）4沉淀清蛋白時(shí),，一定加入適量，倘若太過量則清蛋白不能沉淀，而呈乳

膠狀物，其原因是因溶液濃度太大，使蛋白質(zhì)不能下沉，而比重太輕。

【儀器和試劑】

1、蛋清

2、（NH4）2s。4飽和溶液

3、（NH4）2sO4結(jié)晶的粉末。

實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法較多，基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性建

立起來的。常用的方法有：

一、根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，經(jīng)典的測(cè)定方法為凱氏定氮法

(Kjeldahfsmethod)o

二、利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮脈

法和酚試劑法(lowry'smethod)o

三、利用蛋白質(zhì)對(duì)280nm紫外光有最大的吸光度而采用紫外分光光度法。

四、血清蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(酚試劑法)DeterminationofserumproteinContent

(byPhenolmethods)

五、改良的Lowry法

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法

2.學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

3.掌握721分光光度計(jì)使用

【實(shí)驗(yàn)原理】

蛋白質(zhì)的呈色劑是酚試劑。主要成分為磷鋁酸--鴇酸的混和酸，其化學(xué)成分包括

3H2OP2O5*13WO3*5MOO；!*10H2O和3H2O?P2O5*14WO3*4MoO^10H2O可被蛋白質(zhì)中半

胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸還原成多種還原型混和酸，并且具有特殊的藍(lán)色。反應(yīng)

式為：

3H20P*13WO3?5MOC)3?1OH2O

3H2OP2O5*14WO3*4MOO3*10H2O

蛋白質(zhì)

v

3H20P2。3?13WC)2?5MoC)3?10H2。

3H2OP2O3*14WO2*4MoO3*10H2O

與此同時(shí)，蛋白質(zhì)肽鍵在堿性條件下，發(fā)生烯醇化反應(yīng)，能使銅離子在pH10條件下

螯合在肽鍵結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混和酸的顯色劑上，增強(qiáng)了酚試劑對(duì)

蛋白質(zhì)的敏感性。蛋白質(zhì)與酚試劑呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，利用蛋白質(zhì)的濃度與

呈色的關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，來測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1)用己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液(濃度為50mg%)配成一系列不同濃度的蛋白

質(zhì)溶液。

2)取六支試管，編號(hào)，按下表操作。

編號(hào)123456

蛋白質(zhì)含量(Ng)50100150200250空白

標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.10.20.30.40.5

生理鹽水(ml)0.90.80.70.60.51.0

試劑A(ml)0.90.90.90.90.90.9

混勻，置50℃水浴十分鐘，冷卻

試劑B0.10.10.10.10.10.1

室溫放置十分鐘

試劑C3.03.03.03.03.03.0

立即混勻，50℃水浴10分鐘,冷卻后在波長(zhǎng)650nm條件下比色，測(cè)定其光密度值。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制_

以蛋白質(zhì)的含量（Ug）為橫坐標(biāo)，光密度值（OD）為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)含量的

標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、血清蛋白樣品的測(cè)定

取兩支試管按下表操作。

測(cè)定管空白管

稀釋的未知樣品（ml）0.5

生理鹽水（ml）0.51.0

試劑A(ml)0.90.9

混勻后，50℃水浴10分鐘冷卻。

試劑B(ml)0.10.1

室溫放置10分鐘

試劑C(ml)3.03.0

混勻后50℃水浴10分鐘，冷卻，在波長(zhǎng)650nm條件下以空白管調(diào)零，測(cè)其光密度值。

從蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到樣品中蛋白質(zhì)的ug數(shù)。

計(jì)算

每100ml血清中所含蛋白質(zhì)的克數(shù)為：

g%=樣品中蛋白質(zhì)含量（Ug數(shù)）X1/0.5X100X10^X500

【注意事項(xiàng)】

1、測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度最好在25?110ug之間，故血清稀釋倍數(shù)一般為250?500。

2、各管加酚試劑應(yīng)快，必須立即混勻，否則就會(huì)出現(xiàn)混濁。

【試劑】

1、試劑A:2g酒石酸鉀鈉及l(fā)OOgNa2cCh溶于500ml1.0NNaOH用水稀釋至1000ml.

2、試劑B:2g酒石酸鉀鈉及l(fā)gCuSCV5H2O混合后加水至90ml,再力口1mlINNaOH即可。

3、試劑C:（l）市售的酚試劑按1：5稀釋，最后濃度為0.15-0.18N（用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定）。

（2）自制為：稱取NaW（V2HQ,Na2MoO『2HQ各25g溶于700ml水中，加85%H；,PO；50ml,

濃HC1100ml,混合后置圓底燒瓶?jī)?nèi)，文火回流蒸發(fā)10小時(shí)，加入LiSO4-H2O15g,

H2O50ml和溟水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)沸騰15分鐘除浪，冷卻后加H,0稀釋至1000ml,過濾后，

濾液呈金黃色，置棕色瓶中保存，應(yīng)用時(shí)稀釋。

4、生理鹽水即0.9%NaCL。

附：改良的Lowry法

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客懊妗?/p>

【實(shí)驗(yàn)原理】同前面。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1樣品

精確量取一定體積樣品（含蛋白質(zhì)50四左右）于試管中，加5ml堿性銅液，混勻于室

溫放置10分鐘，快速加入0.5ml酚試劑，搖勻，于室溫放置30分鐘，用650nm波長(zhǎng)或

紅色濾光片比色（呈色后，如發(fā)現(xiàn)混濁，經(jīng)3000r/min,離心15分鐘后再比色）

2標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（lOOng/mDo0、0.2、0.4、0.6、0.8,1.0ml,分別置于試管

中，加蒸儲(chǔ)水補(bǔ)至1ml,其余操作同樣品，可得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3計(jì)算

從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的毫升數(shù)A：

樣品蛋白質(zhì)含量（g/ml尸A*0.01%/樣品毫升數(shù)

【附注】

檢測(cè)A群腦膜炎多糖抗原半成品原液可取1ml（含抗原3-10mg）

【試劑】

1、4%碳酸鈉溶液

取4g碳酸鈉，加蒸鐳水溶液成100ml.

2、0.2mol/L氫氧化鈉溶液

取0.8g氫氧化鈉加蒸儲(chǔ)水，溶解成100mL

3、0.04mol/L硫酸銅溶液

取lgCuSO4?5H2。,加蒸儲(chǔ)水溶解成100mL

4、2%酒石酸鉀（或O.lmol/L酒石酸鈉）

取2g酒石酸鉀（或酒石酸鈉），加蒸儲(chǔ)水溶解成100ml.

5、堿性銅液

臨用前取試劑1和2各25ml，試劑3和4各0.5ml混勻配制而成。

6、酚試劑

稱取100g鋁酸鈉（Na2WO「2H2O,25g鋁酸鈉（NazMoOCH?。）.置150ml燒瓶中，

加入700ml蒸譚水，50ml85%磷酸及100ml濃鹽酸，上連回流管（使用木塞或錫紙包

裹的橡皮塞）微沸加流10小時(shí)，取下回流管，加入150g硫酸鋰，50ml蒸儲(chǔ)水，幾

滴溟液。煮沸約15分鐘，驅(qū)除過量的澳，冷卻，加蒸儲(chǔ)水稀釋至1000ml,過濾，為

酚試劑貯備液。

酚試劑貯備液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，測(cè)定酸濃度，而后用蒸儲(chǔ)水稀釋至相當(dāng)lmol/L

鹽酸濃度，即為酚試劑。

7、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（由檢定所統(tǒng)一標(biāo)定發(fā)給），準(zhǔn)確稀釋至1mg/ml（含

0.02%NaN3）,為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液。精確量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)貯備液2.5ml于25ml容量

瓶中，用含0.02%Na、的蒸儲(chǔ)水稀釋至刻度，為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（lOOgg/ml）

紫外分光光度法

【實(shí)驗(yàn)原理】

蛋白質(zhì)中含有酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基，在紫外光280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,

故可用280nm的光吸收值（即光密度的大?。﹣頊y(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

由于核酸在280nm也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有干擾作用。但核酸的最大吸收峰在

260nm，如同時(shí)測(cè)定260nm的光吸收，通過計(jì)算可以消除其對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響，因此溶

液中存在核酸時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定280nm和260nm的光密度，方向通過計(jì)算測(cè)得溶液中的

蛋白質(zhì)濃度。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1、稀釋血清（或其他蛋白質(zhì)溶液），準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用蒸

儲(chǔ)水稀釋至刻度(即500倍)。

2、測(cè)定光密度在紫外分光光度計(jì)匕將稀釋的蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色杯中，用生理

鹽水做對(duì)照，測(cè)得280nm和260nm兩個(gè)波長(zhǎng)的光密度。

【計(jì)算】

將測(cè)得280nm和260nm波長(zhǎng)的光密度值按下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45D28O-0.74D26O

【附注】

1、不同的蛋白質(zhì)和核酸的光吸收率不完全是恒定不變，所以可能產(chǎn)生誤差。另外核酸

中的嗯吟堿，嗓咤堿在波長(zhǎng)260nm和280nm都有光吸收作用。所以核酸的含量在20%以

下，D28，D260>L5時(shí)，方可以使用上述公式。

2、本法對(duì)于微量蛋白質(zhì)的測(cè)定即快又方便，它還適應(yīng)于用硫酸錢或其他鹽類提純的蛋

白質(zhì)樣品(這種蛋白質(zhì)樣品含多種鹽類混雜，用其他方法測(cè)定比較困難)。

3、如純系蛋白質(zhì)樣品，可根據(jù)該蛋白質(zhì)在280nm附近標(biāo)準(zhǔn)吸光系數(shù)，直接測(cè)定該蛋白

質(zhì)的含量。如牛血清白蛋白的El28o(%)為6.3測(cè)定時(shí)，按下列公式計(jì)算。

樣品中牛血清白蛋白濃度(mg/ml)=D28O/6.3*10

4、為簡(jiǎn)便起見，對(duì)于混合蛋白質(zhì)溶液，可用D280乘以0.75來代表其中蛋白質(zhì)的大致含

量(mg/ml)。

實(shí)驗(yàn)三胭酶的凝膠過濾分離純化

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握胭酶凝膠過濾分離純化蛋白質(zhì)的方法和原理

【實(shí)驗(yàn)原理】

胭酶分子量較大，達(dá)490,000達(dá)爾頓。當(dāng)胭酶粗制品通過交聯(lián)葡聚糖SenhadexG-

200層析柱時(shí)，此前本身不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，而其他小分子物質(zhì)及分子量較小

的蛋白質(zhì)可擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒。因此，用蒸鏘水作為洗脫劑，分子量大的胭酶首先被

洗脫下來從而達(dá)到與其他物質(zhì)分離的目的。

凝膠過濾

定時(shí)或定量收集洗脫液，分別在紫外分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定其光密度，以280nm

的光密度為縱座標(biāo)，收集管號(hào)為橫座標(biāo)，繪出胭酶粗制品蛋白質(zhì)分離的洗脫曲線；再分別測(cè)

定洗脫峰內(nèi)各管的胭酶活性，以酶活性為縱座標(biāo)，以管號(hào)為橫座標(biāo)，繪出酶活性曲線。酶活

性與蛋白質(zhì)洗脫曲線中峰值重疊的部位即為分離所得到的版酶所在部位。

胭酶活性測(cè)定系根據(jù)胭酶催化尿素水解釋放氨和CO2的作用。在反應(yīng)中產(chǎn)生黃色化合

物，顏色的深淺與版酶催化尿素釋出的氨量成正比，黃色化合物顏色越深，說明釋出的氨越

多，即胭酶的活性越大。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1、凝膠的準(zhǔn)備；

稱取SePhadexG—2001g,置于三角燒瓶中，加水60ml,于沸水浴中加熱5小時(shí)（此

為加熱溶脹，如在室溫溶脹需放置48?72小時(shí)）取出，待冷卻至室溫裝柱。

2、裝柱：

取直徑為0.1~1.2cm,長(zhǎng)度為45cm的層析玻璃管，底部裝上有細(xì)玻璃管的橡

皮塞，用尼龍布包好塞緊，垂直夾于鐵架上，細(xì)玻璃管接上一段細(xì)塑膠管，夾好。柱

中先加入少量水，充滿細(xì)玻璃管，并殘留部分水于層析玻璃管中。關(guān)閉細(xì)玻璃管的出

口，自頂部緩慢加人溶脹處理過的SephadexG—200懸液，待底部凝膠沉積到1?2cm

時(shí)，再打開出口，使凝膠上升至離層析玻璃管頂端3cm左右為宜，最后用蒸儲(chǔ)水平

衡凝膠柱。在加入凝膠時(shí)速度應(yīng)均勻，并使凝膠均勻下沉，以免層析床分層，同時(shí)防

止柱內(nèi)混有氣泡。如層析床表面不平整，可在凝膠表面用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，再讓凝膠

自然沉降，使床面平整。根據(jù)凝膠床所能承受的最大水壓，必須調(diào)整細(xì)塑膠管位置，

把SenhadexG—200的凝膠層析床承受的水壓控制在10cm水柱高度，作為操作壓，

否則易使凝膠變形而影響流速及層析特征。

3、樣品的制備：

稱取2g大豆粉置于三角瓶中，加入32%丙酮6ml,振搖10分鐘，進(jìn)行提取，

然后倒入離心管中，用32%丙酮2ml洗小三角燒瓶一次，洗液也倒入離心管中，離

心（3000/分）5分鐘，將上清液倒入刻度離心管中量取體積，加入等體積的冷丙酮,

使蛋白質(zhì)沉淀。進(jìn)一步離心（3000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，棄去上清液。待沉淀中的丙酮

蒸發(fā)后，加蒸儲(chǔ)水2.5ml,使沉淀溶解。如有沉淀，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，

取上清液，為胭酶粗提取液，供凝膠過濾進(jìn)一步分離純化。

4、加樣：

加樣時(shí)先將層析柱出口打開，使層析床面上的蒸儲(chǔ)水緩慢下流，達(dá)到床面將近

露出為止，（注意：不可使床面干掉，以免氣泡進(jìn)入凝膠）。關(guān)緊出口。用吸管吸取

0.5ml胭酶粗提取液緩慢地沿著層析柱內(nèi)壁小心加于床表面，盡量不使床面擾動(dòng)，

然后打開出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，達(dá)到床面重新將近露出為止。再用滴管小心加入

1ml蒸儲(chǔ)水。這樣可使樣品稀釋最小而又能完全進(jìn)入床內(nèi)。當(dāng)少量蒸儲(chǔ)水將近流干

時(shí)，再加入蒸儲(chǔ)水使其充滿層析床上面的空間，接上貯液瓶，進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)必

須保持床面的平整（有時(shí)可在床面上的液體表面加-塑料薄板，以保護(hù)床面的平

整。）

5、洗脫與收集：

流速是影響物質(zhì)分離效果的重要因素之一。流速慢分離效果好，但太慢而成

峰形過寬，反而影響分離效果，因此把流速控制在3ml/15分鐘較好。流出的液體

分別收集在刻度離心管中，收集量為3ml/管，共約收集12管。

6、檢測(cè)與制圖

1）蛋白質(zhì)檢測(cè)：將所有的收集管分別在紫外分光光度計(jì)280nm波長(zhǎng)測(cè)定其光密度，

并以光密度為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)，在小方格紙上繪制出蛋白質(zhì)洗脫曲線。

2）胭酶活性的檢測(cè)；

先將胭酶粗提取液0.1ml用蒸儲(chǔ)水稀釋40倍得上樣稀釋液，然后取試管若干,

編號(hào)，制備酶促反應(yīng)液。按下表操作：

空白洗脫液（各管）上樣稀釋液

3%尿素(ml)0.50.50.5

pH6.80.1M磷酸緩沖液（ml）1.01.01.0

酶液（ml）-???0.10.5

無離子水（ml）().5

37℃保溫15分鐘。保溫結(jié)束，各管中立即加入1NHC10.5ml以終止反應(yīng)。另取若干支

試管同上編號(hào)，按卜表操作，進(jìn)行顯色。

空白洗脫液（各管）上樣稀釋液

酶促反應(yīng)液（ml）0.10.10.1

無離子水（ml）2.92.92.9

3%阿拉伯膠2滴2滴2滴

充分混勻

Nessler試劑（ml）0.750.750.75

立即混勻，在721分光光度計(jì)480nm波長(zhǎng)比色測(cè)定其光密度

3）計(jì)算及作圖

根據(jù)測(cè)得的光密度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得氨的微克分子數(shù)，然后計(jì)算各管中每毫升洗脫液每

小時(shí)保溫所能產(chǎn)生氨的微克分子數(shù)作為酶活性單位數(shù)，以及每管洗脫液中酶活性單位數(shù)。以

每管的醒活性為縱坐標(biāo)，以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)在方格紙上繪制酶的洗脫曲線。

每毫升洗脫液的酶活性（NE微克分子數(shù)/ml洗脫液/每小時(shí)保溫）

=查得標(biāo)準(zhǔn)曲線NH3的微克分子數(shù)X2.5（前促反應(yīng)液總量）/取酶促反應(yīng)液（ml數(shù)）X

1/0.5（洗脫液）X60/15（保溫時(shí)間分鐘）

每管洗脫液的酶活性=每毫升洗脫液的酶活性X3

各管胭前比活性=每毫升洗脫液的前活性/每毫升洗脫液的蛋白質(zhì)含量

試比較上樣稀釋液及酶活性最高一管的比活性，從而計(jì)算酶活性提高倍數(shù)。

【試劑】

1.3%尿素溶液：稱取3g尿素溶液溶于100ml無離子水中。

2.pH6.80.1M磷酸緩沖液:稱取11.18gK2HPO4?3比0和6.94gKH2Po溶于100ml蒸

儲(chǔ)水中。

3.1NHC1：將12NHC1用蒸儲(chǔ)水稀釋成12倍即是。

4.Nessler試劑：于500ml錐形瓶中加入150gKJ和100克b，加水100ml及金屬汞140?

150g,劇烈振搖瓶中內(nèi)容物，使其反應(yīng)，約7?15分鐘至碘的顏色消失。以流水冷卻

錐形瓶，繼續(xù)振搖，直至溶液呈黃綠色，把溶液傾出倒入大燒杯中，并添加蒸儲(chǔ)水至

2升體積，放置備用。此即為配制Nessler試劑之母液。

于一5升試劑瓶中,加入10%NaOH溶液3500ml及750ml上述準(zhǔn)備的母液,750ml

蒸僧水，混勻。即為Nessler試劑，放置數(shù)月待沉淀下沉后，取出上清液供實(shí)驗(yàn)使用。

Nessler試劑中的堿濃度很重要，堿濃度不準(zhǔn)會(huì)在使用時(shí)發(fā)生混濁或沉淀，因此應(yīng)

經(jīng)過滴定?？捎?0mlN標(biāo)準(zhǔn)HC1與Nessler試劑滴定，最佳終點(diǎn)（以酚肽作指示劑）

應(yīng)消耗Nessler試劑11?11.5ml,如堿太多，可用6NHC1滴定。

5.32%丙酮溶液：32ml丙酮加蒸儲(chǔ)水至100ml。

6.3%阿拉伯膠：稱取3g阿拉伯膠，先加50ml蒸儲(chǔ)水，加熱溶解，最后加蒸儲(chǔ)水至

100ml刻度。

7.0.02N標(biāo)準(zhǔn)硫酸核溶液的配制：取分析純（NH4）2s置10℃烘箱內(nèi)烘3小時(shí)，取

出后置干燥器內(nèi)冷卻，精確稱取干燥的（NH/SO4132mg，置于100ml容量瓶中，加重

蒸儲(chǔ)水若干，使其溶解，再以重蒸饋水稀釋至刻度，即為0.02N標(biāo)準(zhǔn)硫酸鏤溶液（親

液）。

8.0.002N標(biāo)準(zhǔn)（N?4）2sO4溶液的配制：取0.02N（NH4）2sO4標(biāo)準(zhǔn)液10ml至

100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，即為0.002N（NH4）2so4應(yīng)用液。

加之Nessler試劑后，立即混勻。在721分光光度計(jì)480nm波長(zhǎng)比色。測(cè)定得到的

光密度為縱座標(biāo)，所含NH3的微克分子數(shù)為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

硫酸錢標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:

按下表操作

試劑1234567

0.02N(NH4)2SO4(ml)0.10.20.30.40.50.6/

含N%的微克分子數(shù)0.20.40.60.81.01.2/

重蒸水(ml)2.92.82.72.62.52.43.0

3%阿拉伯膠(滴)2222222

混勻

0.750.750.750.750.750.750.75

實(shí)驗(yàn)四血清Y-球蛋白的分離純化

（分子篩層析法）

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握鹽析和分子篩層析法分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法

【實(shí)驗(yàn)原理】

利用硫酸鏤分段鹽析將血清中的Y-球蛋白與清蛋白、a-球蛋白、球蛋白等加以分

離，再用凝膠過濾法除鹽即可得到比較純的Y-球蛋白。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1.鹽析

⑴血清1ml放入離心管中，加入磷酸鹽緩沖液-生理鹽水（PBS）1ml混勻逐滴加入pH7.2

飽和硫酸鏤溶液1mL邊加邊搖勻。靜置30分鐘后，離心3000rpm10分鐘，傾上清液（上

清中主要含清蛋白）。

⑵將離心管中的沉淀用1mlPBS攪拌溶解，再逐滴加入pH7.2飽和硫酸鍍?nèi)芤?/p>

0.5ml,邊加邊搖勻。靜置30分鐘后，離心3000rpm10分鐘。傾上清液（上清中主要含a、

。球蛋白）。

2.脫鹽

⑴裝柱：稱取葡聚糖凝膠G-501g,放入100ml燒杯中，加蒸儲(chǔ)水50ml,微火煮沸1

小時(shí)（注意需隨時(shí)補(bǔ)充蒸儲(chǔ)水以免蒸干）。冷卻后傾棄上清液。再加入PBS10ml,用玻璃棒

輕輕攪拌，傾入有尼龍布堵住下口的玻璃層析柱內(nèi)。于柱下口接一小段膠管，待全部凝膠傾

入柱內(nèi)且液面接近凝膠上表面時(shí)將出口膠管夾緊。為使凝膠表面平坦，可用手指輕輕彈動(dòng)層

+

析柱，然后小心放松調(diào)節(jié)夾，使液體緩緩流出8~10滴/分。同時(shí)檢查流出液中是否有NH4存

在，若有則需用PBS洗至流出液中無NH4+為止。當(dāng)液面恰好與凝膠表面重合時(shí)，立即將出

口膠管夾緊，裝柱即結(jié)束（注意：液面不得低于凝膠表面，且柱內(nèi)不得有氣泡）。

⑵脫鹽：向裝有Y-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS10滴，用玻璃棒攪拌使之溶解。再用

乳頭吸管吸出Y-球蛋白液，加到層析柱內(nèi)凝膠表面。然后稍打開流出口，使流速為8?10

滴/分。待Y-球蛋白液全部進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時(shí)，再用乳頭吸管小心加入PBS約1cm高，待大部

分液體進(jìn)入凝膠柱后，再繼續(xù)加PBS直至洗脫完畢（加液時(shí)注意不要沖擊凝膠表面）。在整

個(gè)洗脫過程中不能讓液而降至凝膠面以下。

⑶收集：準(zhǔn)備12只小試管用于收集流出液。從加樣后開始，每管收集1ml。收集12管

后繼續(xù)用PBS洗至無NHJ時(shí)，停止洗脫。回收凝膠和尼龍布等。

（4）檢測(cè)：準(zhǔn)備反應(yīng)板兩塊。將12管收集液各取1滴分別放入反應(yīng)板的12個(gè)凹孔。一

塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有NH4+者呈黃色至橙色?？捎?、一號(hào)表示有無呈色或顏

色深淺。再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮版試劑1滴，有蛋白者呈藍(lán)紫色。亦可用+、一號(hào)表

示有無呈色或顏色深淺。將呈色最深的一管收集液保留供電泳實(shí)驗(yàn)使用。利用醋酸纖維素薄

膜電泳檢測(cè)木次實(shí)驗(yàn)所提Y-球蛋白的純度。

【儀器和試劑】

玻璃層析柱(1.0X12cm),圓形尼龍布(直徑1.5cm)、凹孔白瓷板、試管、離心管、

燒杯、滴管、螺旋夾等。

1.血清

2.磷酸鹽緩沖液-生理鹽水(PBS)：用O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液配制的0.9%NaCl溶液。

配制方法如下：

0.2mol/LNa2HPO472ml

?混勻后稀釋20倍

0.2mol/LNaH2PO428ml

3.pH7.2飽和硫酸鏤溶液：用氨水將飽和硫酸鍍?nèi)芤赫{(diào)到pH7.2

4.葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50)

5.納氏試劑(Nesslersreagent)：

⑴儲(chǔ)存液:于500ml錐形瓶?jī)?nèi)加碘化鉀(KI)150g,蒸儲(chǔ)水100mL溶解后加碘(12)

110g,振搖至溶解后再加汞(Hg)150g,連續(xù)振搖7?15分鐘。在此過程中，碘的顏色漸淺

并發(fā)熱，可在冷水浴中連續(xù)振搖到溶液由棕紅色(碘色)轉(zhuǎn)變成淺黃綠色(碘化鉀汞色)為

止.將上清液倒入2升量筒內(nèi)，并用蒸儲(chǔ)水洗錐形瓶?jī)?nèi)沉淀物數(shù)次，洗液全部倒入量筒內(nèi)，

再加水至2升后混勻。

⑵應(yīng)用液：取儲(chǔ)存液150ml加10%NaOH溶液700ml、蒸鐲水150ml混勻，放棕色瓶

內(nèi)靜置數(shù)日后取上清液使用。此液要求酸堿度適宜。即與LONHCI滴定時(shí)需此試劑11.0?

11.5ml使酚獻(xiàn)指示劑變色為宜，否則需加以糾正。

6、雙縮腺試劑：

CuSO4-5H2O0.39g,酒石酸鉀鈉1.2g分別溶于50ml蒸儲(chǔ)水中，加2.5NNaOH60ml,

KI0.2g,混勻后加水至200mlo

實(shí)驗(yàn)五血清蛋白質(zhì)的分離

（離子交換層析法）

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握離子交換層析法分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法

【實(shí)驗(yàn)原理】

DEAE纖維素是陰離子交換劑，在PH=8的溶液中，血清蛋白皆解離為陰離子，可交換結(jié)

合到DEAE纖維素離子交換層析柱上，然后用梯度洗脫法，即逐步改變洗脫液的pH值與離子

強(qiáng)度使DEAE纖維素與蛋白質(zhì)的親和力降低可使不同蛋白質(zhì)按其親合力的大小不同分步洗脫

下來，從而達(dá)到分離提純的目的。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1.DEAE纖維素-222.5g,傾灑在盛有40ml0.5NHC1的燒杯中。用玻璃棒輕攪

拌使纖維素粉下沉，浸泡30分鐘。加蒸儲(chǔ)水60ml,用玻璃棒攪拌，靜置10分鐘。輕棄上

層液體。重復(fù)加水?dāng)嚢?，靜置棄上清，重復(fù)上述步驟1?2次。使上層液體沒有細(xì)的混懸物,

然后傾入有100目尼龍濾布的漏斗中。用蒸儲(chǔ)水充分洗滌，直到流出液pH24（用pH試紙

檢查）。將纖維素放到250ml的燒杯中，加0.5NNaOH40ml浸泡30分鐘后，傾棄上清。加

蒸儲(chǔ)水100ml攪拌，然后有100目尼龍濾布的漏斗中。用蒸儲(chǔ)水充分洗滌，直到流出液pH

W8,濾去水份。

將上述纖維素放到250ml的燒杯中，加入0.Olmol/LNa2HPO,100ml浸泡并攪拌。置10

分鐘。輕棄上層液體。再加入0.Olmol/LNa2HP0,100ml浸泡并攪拌。必要時(shí)重復(fù)操作到溶

液pll=8為止。

2.裝柱

在層析柱（20Xlcm）底部安上帶有小圓尼龍布和細(xì)玻璃管的膠塞。細(xì)玻璃管下端出口

套上細(xì)膠管，用螺旋夾扭緊。把層析柱夾在鐵支架上，使柱豎直放好。柱中加數(shù)毫升

0.Olmol/LNa?HPO,液。然后打開出口，排出氣泡。待柱中液體只剩約1cm高時(shí)關(guān)閉出口。

將處理好的DEAE纖維素混懸液用乳頭吸管加入層析柱內(nèi)，擰松下口螺旋夾，使液體流

出。注意不要帶入氣泡。如懸液過濃，可加0.Olmol/LNaJIPOu液適當(dāng)稀釋。將DEAE纖維素

懸液均勻加到柱內(nèi)，并注意保持表面平整。纖維素全加到柱內(nèi)后待液面接近纖維素上界面（床

面）時(shí)，關(guān)閉出U。

3.安裝梯度發(fā)生器

把梯度發(fā)生器兩筒間及出口膠管處螺旋夾都擰緊。向有出口的?側(cè)筒內(nèi)加入0.Olmol/L

N&HPOnOml,另側(cè)加I0.5mol/LNaHFO,40ml。把此梯度發(fā)生器放到磁力攪拌器上，攪拌子

放在出口側(cè)的盛液筒中。此磁力攪拌器放在比層析柱高約30?50cm處。使梯度發(fā)生器出口

細(xì)膠管內(nèi)充滿液體。排出氣泡擰緊該螺旋夾，將細(xì)膠管下端連到層析柱上端膠塞上的連接管

上。

4.加樣

打開層析柱的上口，擰緊出口螺旋夾，待液面恰好到床頂表面時(shí)關(guān)閉出口。用吸管吸

取血清0.2ml緩慢加入（不要攪動(dòng)床面）。打開下口，讓液體緩慢流出，流速按每分鐘5?

10滴。到全部血清恰好流入纖維素界面時(shí)，立即小心地加入0.01mol/LN&HPO”液0.5ml?

到液面接近纖維素界面時(shí)，擰緊下口膠管的螺旋夾，并把膠管連接到收集管上。

5.洗脫

擰松梯度發(fā)生器兩盛液筒間的螺旋夾，開動(dòng)磁力攪拌器，（攪拌速度不宜過快，以免空

氣卷入液內(nèi)）。將連接梯度發(fā)生器出口的細(xì)膠管連接管上，使液體流入層析管內(nèi)。擰松層析

柱下端膠管的螺旋夾，控制流速約15滴/分，使洗脫液滴入收集管內(nèi)，每管收集到約3ml

時(shí)，換管。收集完為止。

6.檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)讀各管的光密度值（波長(zhǎng)280nm）,以0.01mol/LN&HPO,液作空白

管。吸光度值作為縱坐標(biāo)，管號(hào)為橫坐標(biāo)，用方格坐標(biāo)紙繪出血清蛋白層析圖譜，觀察并判

斷結(jié)果。第1及第2號(hào)吸收高峰的溶液分別保留于試管內(nèi)，標(biāo)明出吸光度，保存于冰箱，以

供電泳實(shí)驗(yàn)用。

【儀器和試劑】

721型分光光度計(jì)、梯度發(fā)生器、磁力攪拌器、量筒、漏斗、燒杯、試管、移液管、乳

頭吸管、玻璃棒、尼龍布、螺旋夾。

1.DEAE纖維素-22（DiethylaminoethylCellulose）

2.0.5N1IC1

3.0.5NNaOH

4.0.Olmol/LNa2HpOi

5.0.5mol/LNaH2P0t

實(shí)驗(yàn)六胰臟彈性蛋白酶的分離純化

（親和層析法）

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握親和層析法分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法

【實(shí)驗(yàn)原理】

本實(shí)驗(yàn)采用彈性蛋白酶的底物（［L-Ala］「4-NA）作為配基，使其與活化載體（Sepharose

6B）進(jìn)行偶聯(lián)后，得到專?性很強(qiáng)的親和吸附劑，將其裝入色譜柱內(nèi)。然后把山豬胰臟制備

的彈性蛋白酶（粗制品）溶液流經(jīng)此柱。這時(shí)彈性蛋白酶被具有親和性載體所吸附，酶與配

基作用生成酶一底物絡(luò)合物（ES）而保留在柱內(nèi)。由于全部展層過程是在低溫（-14℃）和

高鹽濃度條件下進(jìn)行，所以酶的周轉(zhuǎn)速率是很低的或受到控制，終止（或很少有）酶促反應(yīng)

產(chǎn)物的生成。最后在保持低溫條件下，選用50%乙二醇含鹽緩沖液，可以將被吸附在載體上

的彈性蛋白酶洗脫下來。通過親和層析獲得的彈性蛋白酶純度很高，不再含有（或很少有）

胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等雜蛋白。

【實(shí)驗(yàn)操作】

1.豬胰臟彈性蛋白酶（粗酶液）的制備

（1）抽提

取新鮮（或冷凍）的胰臟100g,剝?nèi)ブ炯敖Y(jié)締組織后剪碎，用絞肉機(jī)或組織搗碎器

破碎細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入燒杯內(nèi)加入2—3倍體積預(yù)冷的乙酸酸化溶液（pH3.0）,放入冰箱內(nèi)抽

提，并時(shí)加攪拌。在抽提過程中，為使pll值維持在3.0左右，可用乙酸調(diào)節(jié)。抽提8h后取

出，用四層紗布過濾，濾渣用少量乙酸酸化溶液洗一次，合并濾液用2moi/LHzSO,溶液調(diào)至

pH3.0o靜置2h以上，再用折疊濾紙過濾，收集濾液并量其體積。濾液通常為黃色透明溶液。

取樣測(cè)其酶活力及蛋白質(zhì)含量。

（2）鹽析

向?yàn)V液中加入研細(xì)的（NHJ）2soi粉沫，使溶液達(dá)到0.45飽和度（按每L溶液加入262g

（NH.）2soi計(jì)算），放入冰箱（2℃）中靜置4—6h,除去上清液,然后冷凍離心（4000rpm）

lOmin,收