ICS65.020.20DB23黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB23/T2476—2019本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1—2009的編寫規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)業(yè)技術(shù)中心、哈爾濱瑞康源生物科技有限公司、黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李春杰、王從麗、尤佳、胡巖峰、王英男、潘鳳娟、黃銘慧、姜野。DB23/T2476—20192大豆孢囊線蟲病抗性室內(nèi)鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆孢囊線蟲病抗性室內(nèi)鑒定方法中的試劑、材料和儀器設(shè)備、空氣環(huán)境與培養(yǎng)條件、鑒定材料、育苗與移苗、培養(yǎng)、線蟲接種液制備、接種、調(diào)查、抗性評價方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對大豆孢囊線蟲不同生理小種的抗性鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB4404.2糧食作物種子第2部分：豆類NY/T3059大豆抗孢囊線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程3試劑、材料和儀器設(shè)備3.1試劑霍格蘭氏（Hoagland）營養(yǎng)液：硝酸鈣945mg/L、硝酸鉀607mg/L、磷酸銨115mg/L、硫酸鎂493mg/L、鐵鹽溶液2.5mL/L、微量元素5mL/L、pH6.0，無菌水1L，使用時稀釋20倍。500mL、pH5.5。微量元素液：碘化鉀0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸錳22.3mg/L硫酸銅0.025mg/L、氯化鈷0.025mg/L。3.2材料（a）植物生長袋（長17.8cm，寬16.5cm）、（b）快撈夾（長29.8cm，寬23.3cm）、（c）快撈架（長39.5cm，寬32.5cm）、（d）蛭石（20目）、（e）培養(yǎng)缽（高11.5cm，直徑20cm）。3.3儀器設(shè)備（a）孢囊分離篩（20目、100目、200目、500目）、（b）移液器（5mL）、（c）線蟲孵化池、（d）線蟲計數(shù)板、（e）光學(xué)顯微鏡（4~40×)、（f）恒溫光照培養(yǎng)箱、（g）高壓蒸汽滅菌器（121℃、30min）。4室內(nèi)空氣環(huán)境與培養(yǎng)條件4.1室內(nèi)空氣環(huán)境室內(nèi)空氣環(huán)境質(zhì)量要求符合GB3095的規(guī)定。4.2培養(yǎng)條件DB23/T2476—20193培養(yǎng)箱調(diào)至光周期為16h光照、8h黑暗、白天溫度28℃、夜間溫度22℃、相對濕度70%的循環(huán)程序。5鑒定材料鑒定材料種子質(zhì)量應(yīng)符合GB4404.2的規(guī)定。6育苗與移苗6.1育苗將待鑒定的種子播種在裝有無菌蛭石的培養(yǎng)缽中，每缽40粒，常規(guī)管理。3d后種子萌發(fā)出幼苗，剔除生長不良的植株，保留生長一致的30株幼苗備用。6.2移苗（a）浸濕生長袋。向直立的生長袋內(nèi)濾紙頂端夾縫內(nèi)加入無菌水10mL，使生長袋中的濾紙充分浸濕且生長袋底部有少量無菌水存留。（b）移苗。將30株備用幼苗轉(zhuǎn)移到浸濕的濾紙頂端夾縫內(nèi)，保持子葉高于生長袋上沿，每個生長袋內(nèi)移入1株幼苗。（c）擺放。每2個生長袋放入1個快撈夾中，將快撈夾放到快撈架上，每個快撈架上放置30個快撈夾。7培養(yǎng)將整個快撈架置于培養(yǎng)箱中，每三天澆5mL霍格蘭氏營養(yǎng)液和5mL無菌水。8線蟲接種液制備8.1擴繁線蟲經(jīng)單孢囊純化的孢囊群體接種在感病品種根部土壤中培養(yǎng)35d。8.2收集孢囊收集感病品種根部及土壤中的孢囊：將感病品種根和根部土壤放入盛有1/3清水的1L燒杯中，用玻璃棒將泥水混合物劇烈攪拌，靜置1min左右，將上清液依次倒入20目和100目的孢囊分離篩中。用高壓水槍沖洗20目篩子上的感病品種根、土壤及殘留物，將落入100目篩子上的孢囊沖洗至燒杯中，用置于漏斗架上的單層濾紙（直徑為12.5cm）過濾。用毛筆輕輕地刷分布于濾紙邊緣的孢囊，收集后即得到大量孢囊。8.3分離線蟲卵將收集的孢囊轉(zhuǎn)移到200目篩子上，下面套500目篩子。用橡皮塞在200目篩子上碾磨孢囊使卵釋放出來，高壓水槍沖洗，收集落于500目篩子上的卵。8.4線蟲卵孵化將線蟲卵懸液加入線蟲孵化池內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱（28℃,黑暗）內(nèi)孵化4~5d，收集孵化出來的二齡幼蟲懸浮液。DB23/T2476—201948.5二齡幼蟲接種液制備將二齡幼蟲懸浮液注入線蟲計數(shù)板，于光學(xué)顯微鏡下調(diào)查二齡幼蟲濃度，不斷稀釋使線蟲濃度調(diào)至170條/mL，并作為接種液，備用。大豆孢囊線蟲不同生理小種二齡幼蟲接種液制備方法相同。9接種待測植株側(cè)根生長至5cm左右（約5~7d），從快撈夾中取出生長袋，用移液器向主根和側(cè)根及其周圍均勻滴加3mL孢囊線蟲二齡幼蟲懸浮液，將接種后的生長袋水平放置在培養(yǎng)箱中，24h后將生長袋垂直放在快撈架上，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每個品種接種30株，每10株為一個重復(fù)。培養(yǎng)至21d后將生長袋內(nèi)的濾紙連同整個根系取出，調(diào)查每株根系孢囊數(shù)量。11抗性評價方法抗性評價方法應(yīng)按NY/T3059執(zhí)行，孢囊指數(shù)按照（A.1）計算，對大豆孢囊線蟲病抗性評價標(biāo)準(zhǔn)見表1，鑒定調(diào)查表參見附錄表A.1?！?A.1)FI-孢囊指數(shù)；T-待鑒定材料單株