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SHAIA

上海市分析測試協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

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甲基化分析中的DNA樣品制備方法沉淀法

PreparationofDNASamplesinMethylationAnalysisbyPrecipitationMethod

（工作組討論稿）

在提交反饋意見時(shí)，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

上海市分析測試協(xié)會??發(fā)布

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甲基化分析中的DNA樣品制備方法沉淀法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織和培養(yǎng)的細(xì)胞等生物樣本中DNA甲基化分析的樣品制備方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于從組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取DNA用于甲基化分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

國家標(biāo)準(zhǔn)或國際標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

DNA甲基化（DNAmethylation）是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，是在不改變DNA序列的前提下

對基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。

4原理

DNA甲基化檢測可以采用的方法比較多，PCR法是比較是比較簡單易行的方法之一。原理是利用亞

硫酸氫鹽處理DNA，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在轉(zhuǎn)化過程中保持不變。

轉(zhuǎn)化后，DNA的甲基化情況可以通過PCR擴(kuò)增或DNA測序來判定。

在PCR法檢測中DNA的純化最常用的的方法是沉淀法。除上述比較經(jīng)典的沉淀法以還有有物理的方

法：如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法?；瘜W(xué)方式如異硫氰酸胍法、堿裂解法。生物方式如酶法，

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等。

沉淀法是在去污劑的作用下將細(xì)胞裂解，然后在細(xì)胞裂解也中加入SDS加速細(xì)胞破碎，再加入酒精

將DNA沉淀，采用蛋白酶K和氯仿/異戊醇去除蛋白質(zhì)，得到純化的DNA。

5儀器設(shè)備

5.1高速臺式離心機(jī)，

5.2高速冷凍離心機(jī)，

5.3紫外可見分光光度計(jì)，

5.4紫外及化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀。

5.5超純水系統(tǒng)

5.6可調(diào)移液器，（0.5~10μl,10~200μl,100~1000μl,）

6試劑和材料

6.1.細(xì)胞裂解液（10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS），

6.2.純凈水ddH2O，電阻率>18Ω（分子生物學(xué)級）

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6.3.乙醇（75%和100%）（分子生物學(xué)級），

6.4.苯酚（分子生物學(xué)級），

6.5氯仿（分子生物學(xué)級）。

7樣品

樣品來源：甲基化檢測的樣品可以來源于血液、冷凍組織樣本或石蠟組織塊。用于甲基化分析的

樣品應(yīng)采用冷凍和其他適當(dāng)?shù)姆椒ū４媪己靡苑罉悠方到狻?/p>

樣品處理：采用細(xì)胞裂解液或其他適當(dāng)?shù)脑噭┨崛〖?xì)胞和組織中的DNA，進(jìn)一步將DNA與蛋白

質(zhì)和其他雜質(zhì)等分離并采用苯酚-氯仿或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绯恋矸ǖ燃兓疍NA，純化后的DNA經(jīng)95%

或100%酒精再次沖洗沉淀，獲得的DNA沉淀采用純凈水再次溶解備用。

8DNA樣品制備

試劑配制

細(xì)胞裂解液：10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS。

9DNA樣品分析

DNA純度檢測一半采用分光光度法在波長260nm對其進(jìn)行檢測，同時(shí)可以通過測定DNA樣品在

260/280（A260/A280）的紫外吸收值估算DNA的純度，其比值在1.8為純度較好，其比值高于2.0預(yù)示

著樣品中有RNA沒有除盡。同時(shí)也可以采用凝膠電泳的方法檢測DNA的純度，并檢測樣品中是否有RNA

存在。

3

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A

A

附錄A

（資料性）

XXXXXXXXX

核酸提取方法主要包括以下幾種：

1、沉淀法。通過采用細(xì)胞裂解液破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來釋放核酸，采用化學(xué)試劑將細(xì)胞中的DNA提取出

的方法。

2、化學(xué)試劑法。利用核酸和雜質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度差異進(jìn)行分離提純。該方法使用異硫

氰酸胍和乙醇/異丙醇來沉淀水相中的核酸。

3、柱純化法。利用二氧化硅材料吸附原理，在高鹽濃度下，通過帶正電荷的二氧化硅柱膜和帶負(fù)

電荷的核酸之間的親和力，使核酸被富集于二氧化硅基質(zhì)，其他雜質(zhì)被清除。

4、磁珠法。利用磁珠與核酸的特異性結(jié)合，通過磁場作用進(jìn)行分離。

此外，還有吸附材料結(jié)合法，如硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂和磁珠，這些方法利用核酸與吸附材料

之間的特異性結(jié)合進(jìn)行分離。每種方法都有其特定的應(yīng)用和優(yōu)勢，選擇哪種方法取決于實(shí)驗(yàn)的具體需求

和條件。

沉淀法提取DNA：從組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中分離DNA

1.將組織切成小塊，培養(yǎng)的細(xì)胞直接進(jìn)行下一步。

2.加入提取緩沖液（10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS），充分混合，加入RNaseA至

最終濃度20ug/ml，在37℃下孵育1小時(shí)。

3.加入蛋白酶K至最終濃度100ug/ml，充分混合，在50℃下孵育3小時(shí)或過夜。

4.在室溫下冷卻溶液，加入等體積的苯酚（pH8.0），通過緩慢地將管端翻轉(zhuǎn)10分鐘或?qū)⒐芊胖迷?/p>

滾筒設(shè)備上混勻1小時(shí)，將兩相輕輕混合。

5.將試管在10000g下離心15分鐘。

6.將水相（上層）轉(zhuǎn)移到新試管中。

7.在室溫下加入0.2倍體積的10mol乙酸銨（NH4Ac）和2倍體積的100%乙醇，輕輕混合。如果使用

NaAc（pH5.2），則添加0.1體積的3molNaAc和2體積的100%乙醇（-20℃下預(yù)冷的）。

8.在室溫下以10000g離心5分鐘或從酒精中取出沉淀的DNA。