運(yùn)城市中醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如ELISA、分子生物學(xué)）操作考核一、單選題（每題2分，共20題）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板清洗的主要目的是什么？A.去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體B.增強(qiáng)抗體與抗原的結(jié)合C.增加樣本的吸光度值D.提高酶的活性2.在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，SDS電泳時(shí)，凝膠的pH值通常控制在多少？A.6.8-7.2B.8.0-8.5C.5.0-5.5D.9.0-9.53.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，用于逆轉(zhuǎn)錄的酶是？A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.腺苷酸脫氨酶（ADA）D.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）4.ELISA實(shí)驗(yàn)中，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）常用的底物是？A.TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）B.ABTS（2,2′-連氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸））C.DAB（3,3′-二氨基聯(lián)苯胺）D.以上都是5.PCR實(shí)驗(yàn)中，引物退火溫度通常根據(jù)什么因素確定？A.引物長(zhǎng)度B.引物GC含量C.退火緩沖液pH值D.以上都是6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜常用的方法是？A.電轉(zhuǎn)移B.濕轉(zhuǎn)C.半干轉(zhuǎn)D.以上都是7.ELISA實(shí)驗(yàn)中，復(fù)孔設(shè)置的主要目的是？A.提高重復(fù)性B.減少誤差C.增加樣本量D.以上都是8.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因的選擇原則是？A.表達(dá)量穩(wěn)定B.上調(diào)或下調(diào)明顯C.與實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒o(wú)關(guān)D.以上都不是9.PCR實(shí)驗(yàn)中，dNTPs的作用是？A.提供合成DNA的原料B.引導(dǎo)DNA延伸C.退火引物D.以上都不是10.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，封閉液常用的成分是？A.牛血清白蛋白（BSA）B.脫脂奶粉C.酪蛋白D.以上都是二、多選題（每題3分，共10題）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，常見(jiàn)的干擾因素包括？A.樣本中的高濃度脂類(lèi)B.非特異性結(jié)合C.抗體交叉反應(yīng)D.pH值波動(dòng)2.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白分子量測(cè)定常用的標(biāo)準(zhǔn)品是？A.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）B.預(yù)染MarkerC.未預(yù)染MarkerD.自制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品3.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系通常包含？A.逆轉(zhuǎn)錄酶B.Oligo(dT)引物C.RNA模板D.dNTPs4.PCR實(shí)驗(yàn)中，影響擴(kuò)增效率的因素包括？A.引物設(shè)計(jì)B.循環(huán)數(shù)C.溫度梯度D.范圍5.ELISA實(shí)驗(yàn)中，常用的酶標(biāo)儀檢測(cè)方式是？A.吸光度檢測(cè)B.熒光檢測(cè)C.chemiluminescence檢測(cè)D.以上都是6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)是？A.靈敏度高B.背景低C.可長(zhǎng)期保存D.以上都是7.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，常用的引物設(shè)計(jì)原則包括？A.避免引物二聚體B.GC含量在40%-60%C.退火溫度在55-65℃D.以上都是8.PCR實(shí)驗(yàn)中，瓊脂糖凝膠電泳用于？A.檢測(cè)PCR產(chǎn)物B.確定分子量C.鑒別擴(kuò)增條帶D.以上都是9.ELISA實(shí)驗(yàn)中，樣本前處理的目的是？A.去除抑制劑B.提高抗體結(jié)合效率C.防止降解D.以上都是10.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，常用的抗體類(lèi)型包括？A.一抗B.二抗C.HRP標(biāo)記抗體D.FITC標(biāo)記抗體三、判斷題（每題1分，共10題）1.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板的孔底材質(zhì)通常是聚苯乙烯。2.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，SDS的濃度越高，分離效果越好。3.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，RNA模板需用DNase處理以去除基因組DNA污染。4.PCR實(shí)驗(yàn)中，Mg2?濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。5.ELISA實(shí)驗(yàn)中，復(fù)孔平均值用于計(jì)算結(jié)果，單孔異常值需剔除。6.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜后需用封閉液封閉1-2小時(shí)。7.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因的表達(dá)量應(yīng)不受實(shí)驗(yàn)處理影響。8.PCR實(shí)驗(yàn)中，引物二聚體出現(xiàn)說(shuō)明引物設(shè)計(jì)不合理。9.ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)儀的讀數(shù)范圍通常為0-4OD。10.WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，ECL檢測(cè)需在暗室進(jìn)行。四、簡(jiǎn)答題（每題5分，共5題）1.簡(jiǎn)述ELISA實(shí)驗(yàn)的基本步驟及其原理。2.簡(jiǎn)述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白印跡轉(zhuǎn)移的原理及注意事項(xiàng)。3.簡(jiǎn)述RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因選擇的重要性及方法。4.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)中，引物設(shè)計(jì)的要點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題。5.簡(jiǎn)述ELISA實(shí)驗(yàn)中，樣本前處理的目的及常見(jiàn)方法。五、論述題（每題10分，共2題）1.試述ELISA實(shí)驗(yàn)中，如何減少非特異性結(jié)合及提高結(jié)果可靠性。2.試述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白條帶出現(xiàn)異常（如彌散、缺失）的可能原因及解決方法。答案及解析一、單選題1.A解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，酶標(biāo)板清洗的主要目的是去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體或底物，以減少非特異性結(jié)合，提高結(jié)果準(zhǔn)確性。2.A解析：SDS電泳時(shí)，凝膠的pH值通?？刂圃?.8-7.2，以保證SDS與蛋白結(jié)合后的負(fù)電荷穩(wěn)定，從而實(shí)現(xiàn)按分子量分離。3.A解析：RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)錄酶用于將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，是PCR擴(kuò)增的前提。4.D解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，HRP常用的底物包括TMB、ABTS、DAB等，均用于顯色檢測(cè)。5.D解析：PCR實(shí)驗(yàn)中，引物退火溫度根據(jù)引物長(zhǎng)度、GC含量及退火緩沖液pH值綜合確定。6.D解析：WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜方法包括電轉(zhuǎn)移、濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。7.D解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，復(fù)孔設(shè)置可提高重復(fù)性、減少誤差，并確保結(jié)果可靠性。8.A解析：RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因需表達(dá)量穩(wěn)定，以校正樣本間差異。9.A解析：PCR實(shí)驗(yàn)中，dNTPs是合成DNA的原料，提供A、T、C、G四種堿基。10.D解析：WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，封閉液常用BSA、脫脂奶粉或酪蛋白，以封閉非特異性位點(diǎn)。二、多選題1.A、B、C、D解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，干擾因素包括高濃度脂類(lèi)、非特異性結(jié)合、抗體交叉反應(yīng)及pH值波動(dòng)。2.A、B、C解析：WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白分子量測(cè)定常用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）、預(yù)染或未預(yù)染Marker。3.A、B、C、D解析：RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)引物、RNA模板及dNTPs。4.A、B、C解析：PCR實(shí)驗(yàn)中，影響擴(kuò)增效率的因素包括引物設(shè)計(jì)、循環(huán)數(shù)及溫度梯度。5.A、B、C解析：ELISA實(shí)驗(yàn)中，常用吸光度、熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方式。6.A、B、C解析：ECL檢測(cè)靈敏度高、背景低且可長(zhǎng)期保存，是WesternBlot常用方法。7.A、B、C解析：RT-PCR引物設(shè)計(jì)需避免二聚體、保證GC含量及退火溫度合理。8.A、B、C解析：瓊脂糖凝膠電泳用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物、確定分子量及鑒別條帶。9.A、B、C解析：ELISA樣本前處理需去除抑制劑、提高抗體結(jié)合效率及防止降解。10.A、B、C解析：WesternBlot常用一抗、二抗及HRP標(biāo)記抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體較少用。三、判斷題1.正確2.錯(cuò)誤解析：SDS濃度過(guò)高可能導(dǎo)致條帶彌散，分離效果反而不佳。3.正確4.正確5.正確6.正確7.正確8.正確9.錯(cuò)誤解析：酶標(biāo)儀讀數(shù)范圍通常為0-2OD，過(guò)高需稀釋樣本。10.正確四、簡(jiǎn)答題1.ELISA實(shí)驗(yàn)基本步驟及其原理答：ELISA實(shí)驗(yàn)基本步驟包括：①包被（將抗原或抗體包被于酶標(biāo)板孔底）；②封閉（用封閉液封閉非特異性位點(diǎn)）；③加樣（加入樣本、酶標(biāo)抗體等）；④顯色（加入酶底物，酶催化后變色）；⑤檢測(cè)（用酶標(biāo)儀讀取吸光度值）。原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合，通過(guò)酶催化底物顯色，間接檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。2.WesternBlot蛋白印跡轉(zhuǎn)移原理及注意事項(xiàng)答：原理是利用電場(chǎng)將SDS分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜上，使蛋白與膜結(jié)合，后續(xù)進(jìn)行抗體孵育檢測(cè)。注意事項(xiàng)包括：①轉(zhuǎn)移緩沖液需預(yù)冷；②膜需用甲醇預(yù)處理；③轉(zhuǎn)移條件（電壓、時(shí)間）需優(yōu)化。3.RT-PCR內(nèi)參基因選擇的重要性及方法答：重要性是校正樣本間差異，確保結(jié)果可靠性。方法包括：①選擇表達(dá)量穩(wěn)定的基因（如GAPDH、β-actin）；②通過(guò)geNorm或NormFinder軟件評(píng)估。4.PCR引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題答：要點(diǎn)包括：①長(zhǎng)度18-25bp；②GC含量40%-60%；③Tm值接近（55-65℃）；④避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)問(wèn)題包括引物二聚體、擴(kuò)增條帶彌散等。5.ELISA樣本前處理目的及方法答：目的包括去除抑制劑、提高結(jié)合效率、防止降解。方法包括：①高溫滅活（如56℃水浴30min）；②離心去除雜質(zhì)；③酸堿調(diào)節(jié)pH值。五、論述題1.如何減少ELISA非特異性結(jié)合及提高結(jié)果可靠性答：減少非特異性結(jié)合的方法包括：①優(yōu)化包被濃度和時(shí)間；②加強(qiáng)封閉（封閉液含BSA/脫脂奶粉）；③使用高純度抗體；④洗滌充分（洗滌液含Tween-20）。提高結(jié)果可靠性的方法包括：①設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照；②復(fù)孔計(jì)算均值；③校準(zhǔn)酶