目錄\f\o"#_Toc163154541"摘要 1\o"#_Toc163154542"Abstract 1\o"#_Toc163154543"第1章導(dǎo)論 3\o"#_Toc163154544"1.1葉色突變體 3\o"#_Toc163154545"1.2BSA-Seq基本原理 3\o"#_Toc163154546"1.3植物中PPR蛋白家族的研究進(jìn)展 4\o"#_Toc163154547"1.4技術(shù)路線 5\o"#_Toc163154548"第2章番茄苗期黃化突變體LA3553的生長(zhǎng)與光合特性 6\o"#_Toc163154549"2.1材料與方法 6\o"#_Toc163154550"2.1.1番茄材料和種植條件 6\o"#_Toc163154551"2.1.2LA3553植株與對(duì)照野生型AC的性狀觀察 6\o"#_Toc163154552"2.1.3LA3553植株與對(duì)照野生型AC葉片光合色素含量的測(cè)定 6\o"#_Toc163154553"2.1.4LA3553植株與對(duì)照野生型AC葉片的光合特性實(shí)驗(yàn) 7\o"#_Toc163154554"2.1.5LA3553植株與對(duì)照野生型AC酶活性的測(cè)定 8\o"#_Toc163154555"2.1.6LA3553植株與對(duì)照野生型葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 11\o"#_Toc163154556"2.2結(jié)果與分析 11\o"#_Toc163154557"2.2.1LA3553植株的主要園藝性狀特點(diǎn) 11\o"#_Toc163154558"2.2.2LA3553植株葉片的光合色素含量分析 13\o"#_Toc163154559"2.2.3LA3553植株葉片及野生型AC的光合特性分析 15\o"#_Toc163154560"2.2.4LA3553植株葉片及野生型AC的酶活性分析 15\o"#_Toc163154561"2.2.5LA3553植株葉片及野生型AC的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 16\o"#_Toc163154562"2.3討論 17\o"#_Toc163154563"第3章番茄苗期黃化突變體LA3553的關(guān)鍵基因定位 18\o"#_Toc163154564"3.1材料與方法 18\o"#_Toc163154565"3.1.1番茄材料和種植條件 18\o"#_Toc163154566"3.1.2植物DNA的提取 18\o"#_Toc163154567"3.1.3黃化突變體植株BSA性狀定位分析 19\o"#_Toc163154568"3.2結(jié)果分析 20\o"#_Toc163154569"3.2.1番茄葉色黃化突變體的遺傳分析 20\o"#_Toc163154570"3.2.2利用BSA-Seq分析對(duì)葉色突變性狀進(jìn)行定位分析 21\o"#_Toc163154571"3.3討論 24\o"#_Toc163154572"第4章結(jié)論 28\o"#_Toc163154573"縮略詞表 33番茄葉色黃化突變體LA3553的遺傳及基因定位分析摘要TC"摘要"\fC：番茄（Solanumlycopersicum）是研究植物生長(zhǎng)發(fā)育的模式作物之一，同時(shí)也是一種重要蔬菜作物及經(jīng)濟(jì)作物。葉色是植物的重要性狀，葉色突變體可作為植物光合特性、葉綠體合成與降解、提高產(chǎn)量等研究方面的重要遺傳材料，同時(shí)也可以作為標(biāo)記性狀用于快速鑒定品種純度及篩選雜交后代，在新品種選育中有良好的應(yīng)用前景。本研究以番茄苗期黃化突變體LA3553與野生型AC為材料，對(duì)其表型、光合特性、遺傳規(guī)律3個(gè)方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)突變體植株在葉長(zhǎng)、葉寬、株高、根長(zhǎng)等方面長(zhǎng)勢(shì)較弱。同時(shí)發(fā)現(xiàn)突變體中葉綠素a含量和總?cè)~綠素含量顯著降低。為進(jìn)一步探索其黃化的原因，我們將突變體LA3553和野生型AC進(jìn)行雜交，通過對(duì)F1代和由F1代自交得到的F2代進(jìn)行表型鑒定，該黃化突變性狀受到一對(duì)隱形核基因控制。利用BSA-Seq的方法進(jìn)行基因定位分析，將基因定位到番茄第3條染色體上的一個(gè)五肽重復(fù)序列（PPR：Solyc03g025700）基因。關(guān)鍵詞：番茄；葉色黃化突變體；生理特性；BSA-SeqGeneticAnalysisandGeneMappingoftheTomatoYellowLeafMutantLA3553AbstractTC"Abstract"\fC:Tomato(Solanumlycopersicum)isoneofthemodelplantsforthestudyofplantgrowthanddevelopment,aswellasanimportantvegetablecropandcashcrop.Leafcolorisanimportanttraitinplants,furthermore,leafcolormutantscanbeusedasimportantgeneticmaterialsforthestudyofchloroplastsynthesisanddegradation,photosyntheticcharacteristics,andyieldimprovement,etc.Theycanalsobeusedasmarkertraitsforrapididentificationofvarietalpurityandscreeningofhybridprogeny,andhavegoodprospectsforapplicationintheselectionandbreedingofnewvarieties.Inthisstudy,weusedthetomatoseedlingyellowingmutantLA3553andwild-typeACasmaterials,andstudiedthreeaspectsoftheirphenotypes,photosyntheticcharacteristics,andgeneticpatterns,andfoundthatthemutantplantswereweakerintermsofleaflength,leafwidth,plantheight,rootlength,andotheraspectsofgrowth.Itwasalsofoundthatchlorophyllacontentandtotalchlorophyllcontentweresignificantlyreducedinthemutant.Tofurtherexplorethecauseofitsyellowing,wecrossedthewildtypewiththemutantLA3553,andtheyellowingmutationwasasingle-generecessivemutationbyphenotypingtheF1generationandtheF2generationobtainedbyselfingfromtheF1generation.GenelocalizationanalysisusingtheBSA-Seqapproachlocalizedthegenetoapentapeptiderepeatsequence(PPR:Solyc03g025700)geneonchromosome3oftomato.Keywords:Tomato;Leafyellowingmutant;Physiologicalcharacteristics;BSA-Seq

第1章導(dǎo)論1.1葉色突變體葉綠素是進(jìn)行光合作用的生物體內(nèi)所含有的重要色素，是一類嵌在類囊體膜上的鎂卟啉化合物，葉綠素的生物合成調(diào)控機(jī)理尚不完全清楚。葉片失綠突變性狀較易鑒定，依照不同的失綠程度可簡(jiǎn)單劃分為白化[1]、黃化[2]、淺綠[3]、黃綠[4]等表型，也有部分表現(xiàn)為花斑（白斑、黃斑）[5]表型。雖然部分突變體在全生育期葉片失綠[6]，但是大量突變體僅在特定的生育階段才表現(xiàn)出不同程度的葉片失綠，如僅在幼苗期表現(xiàn)出黃化，后期恢復(fù)為綠色，或者在特定的環(huán)境條件如低溫時(shí)才表現(xiàn)出葉片失綠，溫度恢復(fù)正常后葉片也恢復(fù)為綠色表型。人工誘變的方式主要有物理誘變[7]和化學(xué)誘變[8]，其中物理誘變是利用各種輻射，例如γ射線、α粒子、β粒子、質(zhì)子、中子和紫外線等，此外還有新型的離子束和激光等。而化學(xué)誘變則主要依賴于化學(xué)試劑如甲基磺酸乙酯（EMS）、2-氨基嘌呤、秋水仙素、硫酸二乙酯（DMS）等，西瓜品種“703”就是通過甲EMS誘變得到的[9]。缺失突變是指基因內(nèi)的堿基數(shù)目減少，由此可能會(huì)造成編碼蛋白的改變，最終造成性狀改變的突變[7]。與自然突變相比，人工誘變突變頻率很高并且多數(shù)可以穩(wěn)定遺傳，依靠人工誘變可以在短時(shí)間內(nèi)獲得更多的突變體，大大提高了育種的效率。但是人工誘變同樣具有不定向性，在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定的局限性。1.2BSA-Seq基本原理BSA（BulkSegregationAnalysis）技術(shù)于1991年出現(xiàn)[10]，最初是為了鑒定F2群體中和生菜霜霉病抗性位點(diǎn)（Dm5/8）連鎖的分子標(biāo)記，該實(shí)驗(yàn)通過對(duì)極端表型分組（每個(gè)混池由20個(gè)左右單株形成），然后利用AFLP，RAPD，SCAR，SSR等分子標(biāo)記技術(shù)，通過比較混池中的條帶多態(tài)性差異，從而鎖定與目標(biāo)位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記。該方法克服了許多常規(guī)遺傳學(xué)技術(shù)的局限性，如：降低了非靶基因?qū)z測(cè)的干擾，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性；突破了在農(nóng)作物中很難獲得近等基因系的局限；最后，該方法無需進(jìn)行大規(guī)模的多態(tài)標(biāo)記篩選，節(jié)省了時(shí)間。BSA是通過將一對(duì)具有相對(duì)性狀的親本雜交，從其任一分離后代群體（如F2代群體、雙單倍體DH、回交群體BC、重組自交系RIL等）中，隨機(jī)選出20個(gè)以上目標(biāo)性狀極端表型的單株，混合構(gòu)建兩個(gè)DNA混池。兩個(gè)混池之間的DNA表現(xiàn)出明顯差異的片段即基因的候選區(qū)域，再利用合適的分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)分離群體中的個(gè)體進(jìn)行分析，完成對(duì)目標(biāo)性狀基因的定位。BSA有常見的方法有三種，第一種常規(guī)方法是將高通量測(cè)序（NGS）與BSA結(jié)合在一起[11]，在水稻中首次得到應(yīng)用；第二種是利用Mutmap[12]，這種方法可以對(duì)由化學(xué)誘變得到的性狀進(jìn)行定位，第三種是使用RNA測(cè)序來進(jìn)行BSR[13]，將BSA中的測(cè)序?qū)ο髲腄NA換成了RNA。BSA作為一種快速有效的技術(shù)，可以解決作物遺傳育種中多種復(fù)雜的基因定位問題。如研究番茄黃葉卷葉病毒和辣椒卷葉病毒[14]；鑒定與辣椒成熟果實(shí)白色性狀有關(guān)的基因[15]；定位控制玉米中胚軸長(zhǎng)度的候選基因[16]；培育具有高淀粉含量特點(diǎn)的馬鈴薯等[17]。近年來,BSA分析法在標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種和基因定位方面的應(yīng)用也越來越多。WuL[18]等通過BSA和遺傳分析篩選出控制淺綠色未成熟辣椒果實(shí)的候選基因CaPP2C35。WangG等用SLAF-seq和BSA鑒定出12個(gè)與花青素積累有關(guān)的候選基因[19]。1.3植物中PPR蛋白家族的研究進(jìn)展在真核生物中，是由一系列不同的RNA結(jié)合蛋白（RBP）促進(jìn)RNA成熟并進(jìn)行調(diào)控的。RBP通常包含一個(gè)或多個(gè)RNA結(jié)合域。五肽重復(fù)序列（PPR）蛋白是植物細(xì)胞器中最大的RBP家族。最近研究表明，在擬南芥中，PPR基因中一共含有3種基序：一種為P型（35個(gè)氨基酸）；另外一種為S型（31個(gè)氨基酸）；還有一種為L(zhǎng)型（35~36個(gè)氨基酸）[20]?；赑PR基序，PPR蛋白可分為P亞家族或PLS亞家族。另一方面，根據(jù)C端結(jié)構(gòu)的不同，PLS亞族可分為PLS、E1、E2、E+、DYW亞族和其他亞族[21]。迄今為止，已在許多陸地植物中發(fā)現(xiàn)PPR蛋白。Wang等分析了近幾年對(duì)整個(gè)基因組測(cè)序的33個(gè)物種，在每個(gè)物種中平均發(fā)現(xiàn)了大約500個(gè)PPR基因，在罌粟（Papaversomiferum）發(fā)現(xiàn)了多達(dá)900個(gè)成員，小?？Х龋–offeaarabica）和阿月渾子（Pistaciavera）分別位于第二、第三位[22]。然而，在除陸生植物以外的其他真核生物中，僅含有很少的PPR編碼基因，已知含有PPR基因最多的生物是寄生原生動(dòng)物布氏錐蟲（Trypanosomabrucei）含有28個(gè)PPR基因[23]，酵母基因組中有5個(gè)PPR基因，人類基因組有6個(gè)PPR基因，綠藻只含有12個(gè)PPR基因[24]。大多數(shù)作用于葉綠體轉(zhuǎn)錄物的RNA保護(hù)因子是PPR蛋白，它們被動(dòng)地結(jié)合到末端RNA區(qū)域，以防止它們被外切酶降解[25]。1.4技術(shù)路線

第2章番茄苗期黃化突變體LA3553的生長(zhǎng)與光合特性對(duì)于植物葉色突變體研究，主要集中在擬南芥[26]、煙草[27,28]等模式植物，西瓜[9]、黃瓜[29,30]等葫蘆科作物及大田作物水稻[31-33]與等作物上。相對(duì)而言，關(guān)于番茄葉色突變[34]的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)基于前期從國(guó)際番茄種質(zhì)中心TGRC引進(jìn)的葉色黃化突變體LA3553，經(jīng)過多代種植，判斷該葉片黃化性狀能夠穩(wěn)定遺傳。LA3553在幼苗期子葉黃化，表現(xiàn)為黃綠色，在后期開花結(jié)果期也持續(xù)表現(xiàn)為黃綠色且長(zhǎng)勢(shì)較弱，其野生型背景自交系為AC，本章針對(duì)該突變體的園藝性狀與生理特性進(jìn)行觀察比較。2.1材料與方法2.1.1番茄材料和種植條件研究所用番茄葉色黃化突變體LA3553株系以及野生型AC自交系均由長(zhǎng)江上游農(nóng)業(yè)生物安全與綠色生產(chǎn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。首先將番茄種子浸泡在55℃水浴鍋20min，熱激活后靜置在室溫下5h，黑暗條件下置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，待3-4d后種子露白，隨后將其播種于混合基質(zhì)（草炭：蛭石：珍珠巖=3:1:1）中，在隆平樓702房間中種植，種植的環(huán)境指標(biāo)為：光照強(qiáng)度300μmol·m-2·s-1、16h光照（25℃）/8h黑暗（22℃）、空氣相對(duì)濕度控制在65-80%，按照正常地栽培管理措施進(jìn)行管理。2.1.2LA3553植株與對(duì)照野生型AC的性狀觀察選取種植的LA3553株系突變體植株和野生型AC正常植株各21株植株，分別在出苗后45d，調(diào)查統(tǒng)計(jì)其葉長(zhǎng)、葉寬、根長(zhǎng)和株高性狀指標(biāo)。2.1.3LA3553植株與對(duì)照野生型AC葉片光合色素含量的測(cè)定隨機(jī)選取定植的LA3553突變體LA3553和野生型AC各10株，分別在出苗后30d和40d，測(cè)定并計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總?cè)~綠素含量的平均含量，具體方法如下：取樣取新鮮植物葉片或其他綠色組織（多個(gè)植株個(gè)體取相同部位為宜），用雙蒸水洗滌干凈，再用吸水紙將組織表面擦拭干凈，剪碎（除中脈），混勻。樣品處理稱取待測(cè)的已經(jīng)剪碎處理的新鮮樣品0.1g（可調(diào)整），共3份，分別放入試管中。每個(gè)試管中加入5ml的95％乙醇，將試樣充分浸沒。將樣品放置于黑暗中24h后，進(jìn)行比色測(cè)定。測(cè)定用95％乙醇潤(rùn)洗，將色素提取液倒入比色杯內(nèi)（注意手持磨砂面），用95％乙醇對(duì)照調(diào)零，再分別在波長(zhǎng)665nm、649nm和470nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算按公式2-1、2-2、2-3分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素濃度和類胡蘿卜素的濃度（mg/L），計(jì)算得出色素的濃度后，再按下式計(jì)算組織中單位鮮重的各色素的含量（單位mg/g）：葉綠體色素的含量Ca=13.95A665－6.88A649#Cb=24.96A649－7.32A665#Cx.c=式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx.c為類胡蘿卜素的總濃度。2.1.4LA3553植株與對(duì)照野生型AC葉片的光合特性實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取植株LA3553和正常植株各15株，分別在出苗后45d，檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析其凈光合速率（Pn）及蒸騰速率（Tr）。使用LI-6400便攜式光合儀，方法參照說明書，操作方法參考宋麗華[35]。儀器安裝連接：按照說明書依次將主機(jī)支架、電池、葉室、CO2進(jìn)氣緩沖瓶等裝置安裝好。開機(jī)：首先打開電源開關(guān)，開機(jī)預(yù)熱15-20min。日常檢查：按照說明書進(jìn)行日常檢查。葉室配置選擇：選擇Factorydefault（常規(guī)），其測(cè)量葉片面積為6cm2；測(cè)量方式選擇M（measured），葉溫傳感器測(cè)量；葉型選擇為B，寬葉型；保存設(shè)置，然后回車自動(dòng)進(jìn)入主菜單。手動(dòng)測(cè)量：按F4“NewMeasurements”菜單進(jìn)入測(cè)量菜單。①設(shè)定文件：創(chuàng)建一個(gè)新的文件，按F1“OpenLogfile”。按下回車鍵后輸入設(shè)定的文件名稱。當(dāng)屏幕上有“EnterRemark”的提示時(shí)，輸入需要的標(biāo)記。按回車鍵，完成文件設(shè)置。在夾入葉片之前如果ΔCO2大于0.5或小于-0.5，按F5“Match”進(jìn)行匹配。②參數(shù)設(shè)置：按labels，在頁面中找到lampOFF（F5）,選擇為Quantumflux，輸入光強(qiáng)800-1000；找到TempOFF（F4）,溫度設(shè)置為25℃左右；Flow設(shè)置為500μmol/s回車確認(rèn)。③測(cè)定：選擇所需要測(cè)定的植株的葉片（3-5次重復(fù)）。順Bypass方向旋轉(zhuǎn)堿石灰管和位于12干燥管上端的螺母。將葉片夾住（使葉片盡可能充滿整個(gè)葉室空間，面積為6cm2，較小的葉片需要測(cè)量葉面積，并在測(cè)量菜單狀態(tài)下按數(shù)字“3”，然后按F1修改葉面積的數(shù)值，關(guān)閉葉室，擰緊固定螺絲到合適的位置）。④等待C行PHOTO讀數(shù)穩(wěn)定（小數(shù)點(diǎn)后末位數(shù)字的上下浮動(dòng)在2左右）時(shí)，就可以進(jìn)行記錄（按下F1“LOG”按鈕或按下儀器手柄上的黑色按鍵2秒，就可以記錄一組數(shù)據(jù)）。⑤換另一片葉片進(jìn)行測(cè)量，重新標(biāo)記，輸入相應(yīng)的名稱。重復(fù)②-④。數(shù)據(jù)輸出：將儀器同電腦連接，調(diào)整儀器的工作狀態(tài)（在主菜單界面下按F5“UTILITY”進(jìn)入應(yīng)用菜單界面，繼續(xù)點(diǎn)擊“FILEEXCHANGE”，然后回車）。運(yùn)行WINFX軟件，點(diǎn)擊CONNECT。然后，在LI-6400中將“USER”文件夾下的數(shù)據(jù)文件存到計(jì)算機(jī)中即可。用EXCEL軟件打開，文件擴(kuò)展名選擇所有文件，選擇分隔符為逗號(hào)，然后打開文檔，即可使用數(shù)據(jù)。關(guān)閉LI-6400：按“ESCAPE”按鈕返回到主菜單界面，松開葉室（留下一點(diǎn)間隙），將兩個(gè)化學(xué)管螺旋到中間的松位置，然后關(guān)掉主機(jī)。取出電池進(jìn)行充電。2.1.5LA3553植株與對(duì)照野生型AC酶活性的測(cè)定隨機(jī)選取定植的LA3553突變體植株和野生型AC植株各10株植株，分別在出苗后30d、40d，測(cè)定并計(jì)算出SOD、POD、CAT酶活性，具體方法如下：（一）氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧化物岐化酶（SOD）酶液提取稱取0.2g樣品（不同植株最好取同一部位的新鮮葉片）洗凈后置于研缽中（研缽置于冰上預(yù)冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8），之后在冰上研磨得到勻漿，然后轉(zhuǎn)到離心管，在4℃、12000g下離心20min，得到的上清夜即為酶的粗提液。酶活性測(cè)定①反應(yīng)混合液配制（以60個(gè)樣為準(zhǔn)）：分別取配好的甲硫氨酸（Met）溶液162ml，EDTA-2Na溶液6ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml，混合均勻后搖勻；②將3ml的反應(yīng)混合液和40μl的酶液（可視情況調(diào)整）放入指形管中，這就是反應(yīng)管；在同一時(shí)間做兩個(gè)對(duì)照處理，其中1個(gè)試管加入3ml的反應(yīng)混合物和40μlPBS（不加入酶液）作為最大光還原管，另1個(gè)試管加入3ml的反應(yīng)混合液和40μlPBS，用錫箔紙包好，作為測(cè)定時(shí)調(diào)零對(duì)照。③將試管放入光照培養(yǎng)箱，在4000lux光照25℃下反應(yīng)20min；④完成反應(yīng)后，以未照光的對(duì)照管調(diào)零，在560nm下，分別測(cè)定每個(gè)管的吸光度（OD560）。計(jì)算結(jié)果SOD的一個(gè)活性單位（U）是以抑制NBT光化還原的50％來計(jì)算。按下式計(jì)算活性：n=SOD總活性＝SOD比活力＝用每克鮮重酶（u/gFW）來表達(dá)SOD總活性；用酶單位每毫克蛋白來表示比活力單位；Ack是照光對(duì)照組的吸光度；AE是樣品管的吸光度；V是樣品液總體積（ml）；Vt是測(cè)量時(shí)的酶液的使用量（ml）；W表示樣品的鮮重（g）；蛋白質(zhì)的含量以mg/g作為單位。（二）愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定酶液提取稱取0.2g樣品（不同植株最好取同一部位的新鮮葉片）洗凈后置于研缽中（研缽置于冰上預(yù)冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8），之后在冰上研磨得到勻漿，然后轉(zhuǎn)到離心管，在4℃、12000g下離心20min，得到的上清夜即為酶的粗提液。酶活性測(cè)定①反應(yīng)混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）緩沖液倒入燒杯中，加入28μl愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）放于磁力攪拌器上進(jìn)行加熱和攪拌，直到溶解愈創(chuàng)木酚溶解，在溶液冷卻之后，加入19μl30％的H2O2，混勻后放在冰箱中待用。②酶活性測(cè)定：取3ml反應(yīng)液，加入40μl酶液后測(cè)定在40秒內(nèi)OD470值的變化。用PBS代替酶液作為為對(duì)照進(jìn)行調(diào)零。計(jì)算結(jié)果以每minOD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。按下式計(jì)算活性：POD活性=ΔA470：在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W表示樣品的鮮重（g）；t表示反應(yīng)時(shí)間（min）；Vt表示提取酶液總體積（ml）；Vs為測(cè)定時(shí)所取用的酶溶液體積（ml）。（三）CAT（過氧化氫酶）的測(cè)定酶液提取稱取0.2g樣品（不同植株最好取同一部位的新鮮葉片）洗凈后置于研缽中（研缽置于冰上預(yù)冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8），之后在冰上研磨得到勻漿，然后轉(zhuǎn)到離心管，在4℃、12000g下離心20min，得到的上清夜即為酶的粗提液。酶活性測(cè)定①反應(yīng)混合液的配制：將100mlPBS（0.15M，pH7.0）與0.1546ml30%的H2O2混合均勻。②取2.9ml的反應(yīng)液加入0.1ml的酶溶液，用PBS為調(diào)零，測(cè)定40s內(nèi)OD240值的變化。結(jié)果計(jì)算酶活性的計(jì)算：以每minOD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。CAT=ΔA240：表示反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W是樣品鮮重（g）；t是反應(yīng)時(shí)間（min）；Vt表示總的提取酶液體積（ml）；Vs表示測(cè)定時(shí)取用的酶溶液體積（ml）。2.1.6LA3553植株與對(duì)照野生型葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察在出苗后30d對(duì)突變體LA3553及野生型AC進(jìn)行取樣，通過透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，方法參照程謨楨[36]。取樣以及前固定：將用于掃描電鏡的番茄葉片切割成1×3mm的長(zhǎng)方形小塊，加入2.5%戊二醛（PH=7.2）進(jìn)行前固定，然后置于4℃冰箱中存放：漂洗：用0.1M磷酸緩沖液（PH=6.8）沖洗3次，每次15min；后固定：用1%鋨酸固定液固定2h；漂洗：用0.1M磷酸緩沖液（PH=6.8）沖洗3次，每次15min；脫水：分別用濃度為50%、70%、90%、100%的乙醇進(jìn)行脫水，每次20min，100%的三次，其它濃度各一次。100%乙醇中要加入吸水劑；置換：100%乙醇：丙酮=1：1處理一次10min，純丙酮處理一次10min；浸透：純丙酮：環(huán)氧樹脂812包埋劑1：1處理1h，1：2處理2h，1：3處理過夜：包埋：每天加入環(huán)氧樹脂812包埋劑早晚各一次，連續(xù)包埋7d：聚合：將樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中，40℃，17d：45℃，24d；60℃，17d；修塊及切片：使用ULTRACUTE型超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度約為50到60nm，將切片用帶有支持膜的樣品載網(wǎng)撈起，放入培養(yǎng)皿中；染色：用醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，25℃下分別對(duì)樣品進(jìn)行染色15-20min，用雙蒸水沖洗干凈后放入培養(yǎng)皿中待檢：透射電鏡觀察，拍片留圖。2.2結(jié)果與分析2.2.1LA3553植株的主要園藝性狀特點(diǎn)將番茄突變體LA3553和野生型AC種子浸種催芽后，置于溫周期25℃/20℃，光周期16h/8h的環(huán)境下培養(yǎng)。發(fā)芽后觀察到突變體子葉、真葉均表現(xiàn)為黃綠色，野生型則為正常的綠色（圖2.1）。在大棚中種植，發(fā)現(xiàn)突變體在整個(gè)生長(zhǎng)周期中葉片都表現(xiàn)為黃綠色。在不同生長(zhǎng)時(shí)期測(cè)量突變體與野生型的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)突變體的長(zhǎng)勢(shì)偏弱，株高降低。相同生長(zhǎng)天數(shù)時(shí)，突變體在株高、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度等方面均明顯小于比野生型（圖2.2）。5cm5cm5cm5cmLA3553AC圖2.1突變型LA3553和野生型AC植株葉色表型Fig.2.1LeafcolorphenotypesofmutanttypeLA3553andwildtypeACCBACBA5cm5cm圖2.2突變型LA3553與野生型AC植株在播種45d天后的株高、葉長(zhǎng)、葉寬對(duì)比注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.2Comparisonofplantheight,leaflength,

andleafwidthbetweenLA3553andACplants

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thesameperiodNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）2.2.2LA3553植株葉片的光合色素含量分析葉色差異主要由葉片中的色素種類和含量所導(dǎo)致，因此首先研究突變體和野生型中光合色素含量差異。在30d和40d時(shí)，選取突變體LA3553和野生型AC植株生長(zhǎng)點(diǎn)下充分展開的第二片真葉，利用丙酮和乙醇浸提法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，總?cè)~綠素含量則為葉綠素a和葉綠素b之和。結(jié)果顯示，30d時(shí)突變體LA3553葉片中的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均顯著低于野生型，而在類胡蘿卜素含量方面無明顯差異；40d時(shí)，突變體LA3553的葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著低于野生型，而葉綠素b和類胡蘿卜素含量沒有表現(xiàn)出明顯差異（圖2.3）。AABB圖2.3突變型與野生型植株的光合色素含量。（A）30d時(shí)葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及總?cè)~綠素含量。（B）40d時(shí)葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及總?cè)~綠素含量注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.3Photosyntheticpigmentcontentinleavesofmutantandwildtypeplants.(A)At30days,leafchlorophylla,chlorophyllb,carotenoidandtotalchlorophyllcontent.(B)At40days,leafchlorophylla,chlorophyllb,carotenoidandtotalchlorophyllcontentNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.3LA3553植株葉片及野生型AC的光合特性分析在子葉長(zhǎng)出后第45d，選取突變型和野生型生長(zhǎng)點(diǎn)下第二片完全展開的真葉，使用LI-6400便攜式光合儀，測(cè)定其凈光合速率（Pn）及蒸騰速率（Tr）。結(jié)果表明（圖2.4），在生長(zhǎng)45d時(shí)，野生型AC的凈光合速率為3.16μmolCO2m-2s-1，突變體LA3553僅為0.43μmolCO2m-2s-1，突變體LA35553的凈光合速率與野生型AC相比顯著降低；而蒸騰速率相比沒有明顯差異。圖2.4突變體與野生型植株光合參數(shù)測(cè)定注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.4Photosyntheticparametersofmutantandwild-typeplantsNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.4LA3553植株葉片及野生型AC的酶活性分析葉綠體作為參與光合作用的主要細(xì)胞器，在植物的逆境響應(yīng)中扮演著重要角色[37]，因此我們分別測(cè)定了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，來反映植物所受到的逆境影響程度。分別于子葉長(zhǎng)出后的第30d和第40d選取生長(zhǎng)在相同條件下、長(zhǎng)勢(shì)大小相近的兩種材料生長(zhǎng)點(diǎn)下第二片嫩葉進(jìn)行取樣測(cè)定。將1g新鮮組織葉片進(jìn)行勻漿處理，加入提取液共同勻漿處理，最終定容在10mL后進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)處理。所有指標(biāo)的測(cè)定均達(dá)到三次生物學(xué)重復(fù)。突變體和野生型在SOD和POD活性并無較明顯差異，但在CAT活性上出現(xiàn)了顯著差異（圖2.5）。圖2.5突變體與野生型植株酶活性參數(shù)測(cè)定注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.5Determinationofenzymeactivityparametersofmutantsandwild-typeplantsNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.5LA3553植株葉片及野生型AC的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察葉綠體是綠色植物和藻類等真核自養(yǎng)生物細(xì)胞中專業(yè)化亞單元的細(xì)胞器，是進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所。葉綠體由葉綠體外被、類囊體和基質(zhì)三部分組成。突變體LA3553的葉綠素含量明顯下降，為了進(jìn)一步確定突變體葉綠體結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，利用透射電鏡對(duì)植株葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。根據(jù)圖2.6，野生型AC植株葉片的葉綠體形狀規(guī)則且飽滿，為球形、橢圓形或卵圓形，葉綠體中具有高度分化的類囊體系統(tǒng)，具有典型的類囊體膜和結(jié)構(gòu)，基粒片層和基質(zhì)片層的分層非常清晰，排列整齊規(guī)律且無斷層出現(xiàn)。而突變體LA3553葉片中類囊體沒有正常的基粒堆疊，出現(xiàn)明顯斷層。LA3553LA3553AC圖2.6野生型AC與突變體LA3553葉片葉綠體透射電鏡觀察Fig.2.6Chloroplastobservationofwild-typeandmutantLA3553leavesbytransmissionelectronmicroscopy2.3討論植物通過葉綠體來進(jìn)行有機(jī)物質(zhì)的合成，同時(shí)可以將太陽能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能，儲(chǔ)存在有機(jī)物質(zhì)中，維持植物的生命活動(dòng)所需。通過對(duì)突變體LA3553和野生型AC植株的葉長(zhǎng)、葉寬、株高等進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)突變體的各項(xiàng)數(shù)據(jù)都顯著低于野生型，可以推測(cè)不僅僅是葉片顏色這一表觀性狀發(fā)生了改變，葉綠體結(jié)構(gòu)及色素含量也必定發(fā)生了系列變化。研究發(fā)現(xiàn)，葉色突變體植株相對(duì)于野生型葉綠素的含量一般都會(huì)變化。研究發(fā)現(xiàn)在小麥斑點(diǎn)葉突變體中，葉片的黃斑數(shù)量越多，葉片的光合色素含量下降越多[38]。在光合色素含量方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與AC相比，突變體LA3553葉片中葉綠素a及葉綠素總的含量含量均顯著降低，而在類胡蘿卜素的含量上沒有表現(xiàn)出明顯差異。葉色的變化與測(cè)定葉綠素含量的結(jié)果相符，本實(shí)驗(yàn)證明了葉綠素含量的減少是造成突變體LA3553葉色黃化的主要原因。在凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）等指標(biāo)方面，生長(zhǎng)45d時(shí)，突變體僅為0.43μmolCO2m-2s-1，野生型的凈光合速率高達(dá)3.16μmolCO2m-2s-1，突變體LA3553的凈光合速率顯著低于野生型AC；此外，突變體的蒸騰速率與野生型相比沒有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)突變體葉綠素含量的變化與凈光合速率的變化相一致，進(jìn)一步佐證了突變體植株LA3553葉色黃化主要是由于葉綠素含量減少造成的。葉綠素含量降低往往是由于葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，葉綠體結(jié)構(gòu)的異常進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致葉片顏色性狀的改變[39]。通過透射電鏡觀察，突變體LA3553中的葉綠體結(jié)構(gòu)確實(shí)發(fā)生了顯著改變，類囊體沒有正常的基粒堆疊，出現(xiàn)明顯的斷層?？梢酝茰y(cè)是葉綠體結(jié)構(gòu)、功能的改變導(dǎo)致了葉綠素含量的下降，進(jìn)而降低了單位葉面積吸收的光能，從而導(dǎo)致植株葉片凈光合速率的下降。

第3章番茄苗期黃化突變體LA3553的關(guān)鍵基因定位BSA即混合分組分析，也稱集團(tuán)分離分析法，是一種選擇合適的親本構(gòu)建遺傳群體，選取極端表型的個(gè)體組成混池進(jìn)行分析的方法。調(diào)查群體表型，選取極端表型的個(gè)體進(jìn)行DNA混池的構(gòu)建，對(duì)兩個(gè)極端表型混池及親本進(jìn)行高通量測(cè)序，并進(jìn)行SNP的關(guān)聯(lián)分析，最后結(jié)合物種的參考基因序列，對(duì)定位區(qū)間的基因做功能注釋。相較于傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究方法，BSA克服了許多常規(guī)遺傳學(xué)技術(shù)的局限性，如：降低了非靶基因?qū)z測(cè)的干擾，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性；突破了在農(nóng)作物中很難獲得近等基因系的局限；最后，該方法無需進(jìn)行大規(guī)模的多態(tài)標(biāo)記篩選，節(jié)省了時(shí)間。在本研究中，利用雜交的方法構(gòu)建遺傳群體，以黃化突變體LA3553和野生型AC番茄雜交，構(gòu)建子二代分離群體，隨后利用群體分離分析的方法（BSA-Seq）對(duì)調(diào)控黃葉性狀關(guān)鍵基因進(jìn)行定位，利用生物信息學(xué)分析得到控制該性狀的關(guān)鍵基因。3.1材料與方法3.1.1番茄材料和種植條件本研究所用材料番茄葉色黃化突變體LA3553株系以及野生型自交系A(chǔ)C雜交得到F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體。首先將番茄種子浸泡在55℃水浴鍋20min，熱激活后靜置在室溫下5h，黑暗條件下置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中待3-4d后種子露白，隨后將其播種于混合基質(zhì)（草炭：蛭石：珍珠巖=3:1:1）中，在隆平樓702房間中種植，種植的環(huán)境指標(biāo)為：光照強(qiáng)度300μmol·m-2·s-1、16h光照（25℃）/8h黑暗（22℃）、空氣相對(duì)濕度控制在65-80%，按照正常地栽培管理措施進(jìn)行管理。3.1.2植物DNA的提取正式開始前先配CTAB：2%CTAB提取緩沖液中加入其體積2%的β-巰基乙醇,放在65℃水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱;期間間隔15-20min，輕搖一次；同時(shí)將異丙醇放入-20℃?zhèn)溆?；?.1g左右幼嫩葉片于1.5mL圓底離心管（內(nèi)置兩顆鋼珠）中，暫放液氮中備用；將取好的樣品放至用液氮預(yù)冷的8×12的板上，快速震蕩，重復(fù)幾次，直至成粉末狀，常溫靜置片刻；每個(gè)離心管中加入CTAB提取液600μl，CTAB需提前預(yù)熱，震蕩混勻3-5min;再加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）抽提液以破壞蛋白質(zhì)，上下輕輕顛倒混勻5min左右，于離心機(jī)上12000rpm室溫離心10min；取體積2/3的上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入0.6-0.8體積的預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒2次，輕輕混勻，-20℃沉淀20-30min，12000rpm離心10min；用移液槍吸取上清液體（注意不要吸到底部的沉淀），用預(yù)冷的75%的乙醇洗滌兩次，每次3-5min，預(yù)冷的無水乙醇洗滌一次，8000rpm，2min；真空干燥機(jī)干燥10min，加入50-100μl滅過菌的雙蒸水進(jìn)行溶解，充分溶解后所得的溶液可直接用于PCR檢測(cè)，剩余的可于-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.3黃化突變體植株BSA性狀定位分析將突變體LA3553、野生型AC和F2代種子播種于穴盤中，種植方法與條件同3.1.1。待幼苗長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，取幼嫩葉片用于植物DNA的提取，提取方法同3.1.2提取DNA，每個(gè)基因型至少取30株的樣品DNA。取每份≧2μg總量的DNA，OD260/280需介于1.8~2.0，樣品DNA基因組重測(cè)序在上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行。完成構(gòu)建整個(gè)文庫，需進(jìn)行以下步驟：末端修復(fù)DNA片段→加ployA尾→加測(cè)序接頭并進(jìn)行純化→PCR擴(kuò)增。樣品經(jīng)過上機(jī)測(cè)序，得到圖像文件，由測(cè)序平臺(tái)自帶軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成FASTQ的原始數(shù)據(jù)（RawData），即下機(jī)原始數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)樣品的下機(jī)數(shù)據(jù)（RawData）分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，包括樣品名、GC含量、模糊堿基所占百分比以及Q20（%）和Q30（%）。測(cè)序數(shù)據(jù)包含一些帶接頭、低質(zhì)量的Reads，這些序列會(huì)對(duì)后續(xù)的信息分析造成很大的干擾，采用FastQC（\o"http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc"http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，檢測(cè)SNP并完成注釋。通過分析SNP頻率的差異，計(jì)算ΔSNP-index，定位到目標(biāo)性狀區(qū)域，候選基因可通過對(duì)候選位點(diǎn)進(jìn)行注釋得到。3.2結(jié)果分析3.2.1番茄葉色黃化突變體的遺傳分析將黃化突變體LA3553、野生型AC進(jìn)行雜交，得到F1，收種后獲得F2代分離群體。所有的材料均種植于隆平樓702，觀察不同編號(hào)植株葉片顏色并記錄。對(duì)F1代和F2代群體葉片顏色與親本進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在F1代中，植株葉色全部表現(xiàn)為綠色，和野生型AC表型一致；對(duì)F2代群分離群體的葉色性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3.1），統(tǒng)計(jì)親本兩種葉色性狀在群體中的分離比例。5cm5cm圖3.1部分F2代表型觀察Fig.3.1PartofF2representsobservation共統(tǒng)計(jì)155棵F2代個(gè)體的葉片顏色，據(jù)觀察統(tǒng)計(jì)葉片綠色與葉片黃色的植株數(shù)量分別為120和35，經(jīng)計(jì)算（卡方檢驗(yàn)）χ2=0.665<χ20.05，1=3.84，符合3:1的分離比（表3-1），確定該突變性狀為單基因隱形突變。表3-1F2代分離群體葉片顏色數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab.3-1Leafcolortraitstatisticsinsecondgenerationisolatedpopulation葉片顏色黃色綠色總計(jì)P實(shí)際數(shù)35120155理論數(shù)38.75116.25155總計(jì)73.75236.25310χ20.18790.6647χ20.05，1=3.843.2.2利用BSA-Seq分析對(duì)葉色突變性狀進(jìn)行定位分析在155株F2代分離群體中選取40株葉片顏色明顯為黃色和40株葉片顏色明顯為綠色的個(gè)體，提取共80個(gè)樣品的DNA分別構(gòu)建兩個(gè)DNA混池，以AC為親本，F(xiàn)2代葉色黃色池（H）、葉色綠色池（L）進(jìn)行BSA測(cè)序。測(cè)序比對(duì)并利用ANNOVAR[40]軟件結(jié)合本項(xiàng)目的參考基因組注釋信息，對(duì)檢測(cè)到的InDel進(jìn)行功能注釋和統(tǒng)計(jì)。使用參考序列為對(duì)象，把子代混合池的數(shù)據(jù)與參照序列進(jìn)行比對(duì)，將某一位點(diǎn)上與參考序列基因型的不同的堿基深度與總深度定義為SNP-index，在進(jìn)行序列測(cè)定前，由于選取極端性狀的混池進(jìn)行測(cè)序，即SNP-index值越大，該位點(diǎn)的SNP與突變性狀的關(guān)聯(lián)程度越高。默認(rèn)選取超過95%閾值線的區(qū)域作為性狀相關(guān)的候選區(qū)域，使用1Mb大小的窗口進(jìn)滑窗分析，每次移動(dòng)100Kb，Physicaldistance做橫坐標(biāo)，SNP-index做縱坐標(biāo)，可以得到SNP-index在基因組上的分布曲線。

圖3.2SNP-index分析Fig.3.2SNP-indexanalysis注：進(jìn)行10000次置換檢驗(yàn)，選取95%（綠色）、99%（橙色）置信水平作為篩選的閾值，圖中的紅色折線即為以窗口形式展現(xiàn)的△(SNP-index)分布，置信水平以上的窗口作為候選區(qū)間。為直觀反映子代ED值在染色體上的分布情況，對(duì)SNP和InDel的ED值的N次方在染色體上的分布分別進(jìn)行作圖。ED算法通過計(jì)算不同混池之間各突變型的頻率距離，采用距離差異來反映標(biāo)記與目標(biāo)區(qū)域的連鎖強(qiáng)度，公式見3-1。以參考基因組的位置為橫坐標(biāo)，ED值的N次方作為縱坐標(biāo)作圖，分析結(jié)果見3-3。ED=3?1圖3.3SNP&InDel在不同染色體上的ED值的N次方分布圖Fig.3.3N-powerdistributionofEDValuesofSNP&InDelondifferentchromosomes綜合SNP-index分析、ED分析、GPS分析和MutMap分析多種分析手段，可以確定潛在的候選區(qū)域初步定位在一個(gè)區(qū)域見表3-2。表3-2潛在候選區(qū)域Table3-2PotentialcandidateareaChrStartEndLengthSL4.0ch03240000140000001600000進(jìn)一步結(jié)合候選區(qū)間見表3-3，在3號(hào)染色體上篩選出1個(gè)候選基因——Solyc03g025700，該基因編碼一個(gè)PPR蛋白，其CDS序列發(fā)生了5個(gè)氨基酸的缺失。表3-3候選區(qū)間Table3-3Candidateintervals染色體SNP位點(diǎn)正常堿基突變堿基數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)SL4.0ch032589765CCGSolyc03g025160.4SL4.0ch032885145CCTSolyc03g025520.4SL4.0ch033101732GTGGGTTTGGAAGTAAGSolyc03g025700.2SL4.0ch033188057GGASolyc03g025800.3SL4.0ch033429845CCASolyc03g026040.4SL4.0ch033753971TTCSolyc03g026320.4SL4.0ch033852141CCASolyc03g026411.1SL4.0ch033853714CCASolyc03g026411.1SL4.0ch034015792AAGSolyc03g031640.23.3討論隨著2012年番茄基因組全測(cè)序完成，對(duì)番茄的研究愈發(fā)深入，關(guān)于番茄葉色顏色突變體早在20世紀(jì)90年代就有研究，在這里對(duì)已定位到的與葉色有關(guān)的基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（見表3-4），便于后續(xù)進(jìn)行對(duì)比分析，可以看出，葉片顏色的變化主要與葉綠素的合成與降解、類囊體數(shù)量與結(jié)構(gòu)、葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。表3-4部分番茄葉色調(diào)控相關(guān)基因Table3-4Partialleafcolorregulationrelatedgenesintomato突變體基因ID突變表型作用機(jī)理參考文獻(xiàn)vgSolyc07g054820新長(zhǎng)出的幼葉白化，出現(xiàn)兩種不同程度的白化表型：白化和黃化堿基缺失導(dǎo)致類囊體的數(shù)量減少，進(jìn)而造成葉片出現(xiàn)白斑或黃斑[41]wvSolyc02g07973016℃時(shí)突變體表現(xiàn)為黃化/白化（但低光照時(shí)表現(xiàn)為綠色），隨著溫度的升高，葉片逐漸變綠，在30℃時(shí)，突變體和野生型顏色一致單核苷酸突變導(dǎo)致基因表達(dá)量降低，抑制葉綠體的分化和葉綠素合成，造成葉片白化[42]slym1Solyc08g005930葉片黃化，果實(shí)成熟延遲單核苷酸位點(diǎn)突變，葉綠體受損，影響光響應(yīng)和色素合成，導(dǎo)致葉片黃化[34,36]lutescent2Solyc10g081470葉片黃化，成熟果實(shí)也表現(xiàn)為白黃色，雌蕊中也出現(xiàn)葉綠素缺失發(fā)生了堿基替換，尚不確定具體通經(jīng)，推測(cè)一是類囊體膜受損，二是突變體對(duì)黑暗和高光脅迫敏感[43]ymSolyc03g122310.3Solyc05g053100.3Solyc01g111630.3Solyc11g007000.2Solyc08g066360.3葉片黃化，果實(shí)晚熟且早期表現(xiàn)為白色，后期變?yōu)辄S色五個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，造成葉綠體膜結(jié)構(gòu)破壞、乙烯過度積累、REDOX失衡導(dǎo)致突變體ym出現(xiàn)葉片黃化[44]gene-editedlinesdefectiveinPSY1andPSY2Solyc03g031860Solyc02g081330葉片白化兩個(gè)基因共同控制葉綠體中類胡蘿卜素合成，活性缺失時(shí)，病毒誘導(dǎo)只沉默兩個(gè)基因的同源基因會(huì)導(dǎo)致葉片褪色、類胡蘿卜素水平降低和光合參數(shù)降低[45]au11號(hào)染色體上小葉基部褪為白色，并逐漸變暗，到葉片邊緣為淺綠色缺乏PΦB合成酶活性，葉綠體發(fā)育受阻，葉綠素和花青素水平降低，導(dǎo)致表型為淡黃綠色[46]yg-212號(hào)染色體上葉片黃化抑制PΦB合成酶活性，葉綠體發(fā)育受阻[47]WAX-7葉片黃化，株高葉寬葉長(zhǎng)顯著降低葉綠素合成受阻，葉綠素分解速度變快[48]mu從真葉開始變黃，植株矮小，光合作用減弱葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)發(fā)生了畸形[49]nv預(yù)測(cè)的七個(gè)可能基因都位于9號(hào)染色體上生長(zhǎng)緩慢且矮小,葉片窄小,葉色淡黃，果實(shí)偏小葉綠素含量的大幅度減少、葉綠體結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重受損影響了葉片的光合功能,致使凈光合速率降低[50]688311號(hào)染色體上兩個(gè)標(biāo)記位于LEaat006、LEtat002之間子葉展開后15d變?yōu)辄S色,真葉于四葉一心期開始轉(zhuǎn)色,死亡時(shí)葉片顏色幾乎為白色，果實(shí)也呈白色，成熟后表現(xiàn)紅色通過降低光能吸收和提高抗氧化能力來避免過剩光能導(dǎo)致光氧化脅迫的產(chǎn)生[51]將突變體LA3553與野生型AC雜交獲得F1代，將F1代進(jìn)一步自交得到F2代，播種F2代，共統(tǒng)計(jì)155棵植株的葉色，其中葉片表現(xiàn)為綠色與黃色的植株數(shù)量分別為35和120，經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合3:1的分離比，表明該突變?yōu)閱位螂[性突變，這符合大多數(shù)葉色突變體的遺傳方式。從F2代中隨機(jī)挑選40個(gè)葉色綠色植株和40個(gè)葉色黃化植株，構(gòu)建DNA混池，對(duì)兩個(gè)混池進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，利用ANNOVAR對(duì)SNP進(jìn)行功能注釋，檢測(cè)兩個(gè)親本間純合差異的標(biāo)記。結(jié)果顯示，SNP主要集中分布在3號(hào)染色體上，在其他染色體上只存在少部分的SNP差異，將3號(hào)染色體上超過閾值的區(qū)域確定為首要候選區(qū)間。進(jìn)一步結(jié)合候選區(qū)間，在3號(hào)染色體上篩選得到1個(gè)候選基因——Solyc03g025700。Solyc03g025700基因編碼一個(gè)PPR蛋白，PPR蛋白作為序列特異性RNA結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞器mRNA轉(zhuǎn)錄后加工，以保證葉綠體、線粒體等的形態(tài)和功能正常，PPR蛋白家族被發(fā)現(xiàn)后即被廣泛研究，在此對(duì)近三年的部分研究結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)，見表3-5。表3-5參與葉綠體調(diào)控的部分PPR蛋白Table3-5PartialPPRproteinsinvolvedinchloroplastregulation蛋白名稱來源PPR類型作用方式參考文獻(xiàn)YLWSOryzasativaPatpF、ndhA、rpl2和rps12的剪接缺陷及ndhA、ndhB和rps14轉(zhuǎn)錄本的編輯缺陷，幼葉表現(xiàn)出白條[52]OsPPR9OryzasativaDYW影響rps8-C182、rpoC2-C4106、rps14-C80和ndhB-C611等的編輯，表現(xiàn)為葉片黃化和致死[53]OsPPR11OryzasativaP調(diào)控ndhA和ycf3-1內(nèi)含子剪接的剪接，表現(xiàn)為葉片黃化和致死[54]GhCTSF1GossypiumhirsutumP參與rpoC1和ycf3-2轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子剪接，超表達(dá)葉片黃化[55]QED1Arabidopsisthaliana在十字花科中編輯RNA位點(diǎn)ndhB-291[56]OsTHA8OryzasativaPycf3異常剪接，葉片呈現(xiàn)淡綠色且幼苗致死[57]DG409ArabidopsisthalianaDYW通過蛋白質(zhì)復(fù)合物參與RNA編輯，幼葉呈淡綠色，成熟時(shí)變綠，葉綠體和線粒體的發(fā)育受到嚴(yán)重破壞[58]PpPPR_32PhyscomitriumpatensP降低psaC基因的轉(zhuǎn)錄水平，突變體原生質(zhì)體小，光合作用活性低[59]OsPGL3AOryzasativaDYWrps8-182和rpoC2-4106的RNA編輯效率及ycf3-1的剪接效率降低，突變體葉色表現(xiàn)為淡綠色且葉綠體發(fā)育異常[60]WAL3OryzasativaPLS調(diào)控16SrRNA和23SrRNA過程影響質(zhì)體核糖體生物系統(tǒng)，突變體出現(xiàn)白化致死[61]AESArabidopsisthalianaPpsbB操作子、ycf3和ndhA的剪接效率降低，突變體表現(xiàn)為葉綠體膜系統(tǒng)塌陷、色素含量降低和光合作用減弱[25]NbIPI1NicotianabenthamianaDYWndhB-5和-6的編輯效率降低，葉片表現(xiàn)出嚴(yán)重的萎黃表型[62]在本課題中，該基因在突變體中在關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生了堿基缺失，進(jìn)一步導(dǎo)致缺失GFGSN五個(gè)氨基酸，氨基酸的缺失可能會(huì)導(dǎo)致某些基因無法正常表達(dá)，可能造成PPR蛋白無法正常合成，從而使葉綠體中RNA編輯無法正常進(jìn)行，產(chǎn)生黃化表型。

第4章結(jié)論1.研究發(fā)現(xiàn)番茄葉色黃化突變體LA3553在幼苗期表現(xiàn)為子葉黃化，且該突變體在開花坐果期和結(jié)果期仍表現(xiàn)為植株變矮黃化。2.生理指標(biāo)特征方面研究顯示，番茄葉色黃化突變體LA3553葉片中葉綠素a、總?cè)~綠素含量顯著低于野生型；突變體的葉綠體中類囊體沒有正常的基粒堆疊，分化受阻；突變體的凈光合速率明顯低于野生型。3.將番茄葉色黃化突變體LA3553與野生型AC雜交獲得F1代，F(xiàn)1代葉色全部表現(xiàn)為綠色，進(jìn)一步自交F1代獲得F2代，葉色綠色與葉色黃化植株數(shù)量符合3:1的分離比，這證明該番茄葉色黃化突變?yōu)閱蝹€(gè)核基因控制的隱性突變。4.利用群體分離分析技術(shù)（BSA），對(duì)番茄葉色黃化突變體LA3553進(jìn)行基因定位的結(jié)果顯示，SNP主要集中分布在3號(hào)染色體，將3號(hào)染色體上超過閾值的區(qū)域確定為首要候選區(qū)間。進(jìn)一步結(jié)合候選區(qū)間，在3號(hào)染色體上篩選得到候選基因Solyc03g025700。

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