食品中大腸菌群的檢驗(yàn)與分析參考GB4789．3-20101、

了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的意義。

2、練習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗(yàn)方法

。

一、

目的二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37℃、24小時(shí)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時(shí)間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN（the

most

probable

number-簡稱MPN）表示2、測定的意義3大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。三

、

材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點(diǎn)、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、1mol/L鹽酸（HCI)。

4、培養(yǎng)基和試劑試驗(yàn)流程（2）液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10的樣品勻液。（3）樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5-7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。（4）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

（5）、根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。

2、初發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。

3、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B)，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。注意：當(dāng)檢樣的量與表中的量有增加或減少時(shí)，表內(nèi)的數(shù)也應(yīng)相應(yīng)減少或增加。

4、大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告大腸桿菌0157顯色培養(yǎng)基上的菌落在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征

典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型特征

1、樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進(jìn)行。（1）選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)分別取1mL生理鹽水加入兩個(gè)無菌平皿作空白對照。（2）及時(shí)將15mL-20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃培養(yǎng)18h-24h。2、平板計(jì)數(shù)

（3）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。

2、平板計(jì)數(shù)

（4）、證實(shí)試驗(yàn)

從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h-48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

2、平板計(jì)數(shù)

（5）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。2、平板計(jì)數(shù)例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取

其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。國標(biāo)4789.3的08版與03版主要不同1、名稱更改以大腸菌群計(jì)數(shù)代替原來的大腸菌群測定。2、增加了大腸菌群的平板計(jì)數(shù)法和紙片檢測法。3、大腸菌群的MPN法以乳糖為主改為以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯為主的要培養(yǎng)基的MPN法。4、大腸菌群的MPN法中原“報(bào)告每100ml（或g）大腸菌群的MPN值”改為“報(bào)告每1ml（或1g）大腸菌群的MPN值”。比較區(qū)別GB/T4789.38--2008大腸桿菌的計(jì)數(shù)03版

流程

一、

步驟

取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法相同，做成1:10的均勻稀釋液為檢樣。同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時(shí)接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照。

1、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，同時(shí)用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種混合接種于1支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵管對照。置36±1℃溫箱培養(yǎng)24±2小時(shí)，如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則與對照的混合菌種一起按下列程序進(jìn)行。

2

、分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24小時(shí)后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。

可疑菌落特點(diǎn)：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。3

、證實(shí)試驗(yàn)

在上述平板上挑取可疑大腸菌落1～2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱培養(yǎng)24±2小時(shí),觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

4

、報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。

二、結(jié)果

根據(jù)證實(shí)大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表(見附錄)報(bào)告每100ml(克)大腸菌群的最可能數(shù)。三、注意事項(xiàng)1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn)，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會(huì)有相當(dāng)多的合格樣品作為不合格處理，應(yīng)注意。

2、膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。

3、接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。

4、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應(yīng)取典型菌落，如無應(yīng)多取幾個(gè)菌落，以免出現(xiàn)假陽性。一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且革蘭氏染色為陰性，可做出判定。

5、對初發(fā)酵時(shí)未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時(shí)，可用手輕輕敲動(dòng)或搖動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上升，應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)生，做進(jìn)一步試驗(yàn)。

6、MPN檢索表是采用三個(gè)稀釋度九管法，較理想的結(jié)果是最低3管為陽性，最高3管為陰性。如無法估測樣品中的菌數(shù)時(shí)，應(yīng)做一定范圍的稀釋度。

7、MPN檢索表只提供了3個(gè)稀釋度，若改用其它濃度時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加或減少。醬油（GB/T2717-2003）細(xì)菌菌落總數(shù)：≤30000cfu/ml大腸菌群：≤30MPN/100ml腸道致病菌：不得檢出全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999）特級一級二級細(xì)菌菌落總數(shù)：≤20000≤30000≤50000（cfu/ml）大腸菌群≤40≤90≤90（MPN/100g）腸道致病菌：不得檢出不得檢出不得檢出巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999）細(xì)菌菌落總數(shù)：≤30000cfu/ml大腸菌群：≤90MPN/100ml腸道致病菌：不得檢出生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）菌落總數(shù)cfu/ml：≤100總大腸菌群c