ICS67.100.01

CCSX16

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/RBXXXX—20XX

內(nèi)分泌干擾物檢測轉(zhuǎn)基因斑馬魚法

DetectionofEndocrineActiveSubstances,ActingThrough

EstrogenReceptors,UsingTransgenicZebrafish

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實(shí)施

中國乳制品工業(yè)協(xié)會發(fā)布

T/RBXXXX—20XX

內(nèi)分泌干擾物檢測轉(zhuǎn)基因斑馬魚法

1范圍

本文件規(guī)定了利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚檢測內(nèi)分泌干擾物的方法。

本文件不適用于檢測不能溶解、乳化或制備成均勻分散的懸浮液的受試樣品。

本文件不適用于自身產(chǎn)生綠色熒光的受試樣品。

2規(guī)范性引用文件

GB/T39649實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)魚質(zhì)量控制

GB/T21807化學(xué)品魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗(yàn)術(shù)語和定義試驗(yàn)溶液

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1斑馬魚Zebrafish

脊椎動物，生物分類學(xué)上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉魚目、鯉科、斑馬魚

屬、斑馬魚種，可用于教學(xué)和科研的模式動物。

3.2受精后天數(shù)Day(s)Post-fertilization，dpf

受精卵受精后的天數(shù)。

3.3無可觀察效應(yīng)濃度NoObservedToxicEffectConcentration，NOEC

與對照組相比，對試驗(yàn)生物未產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng)的最高受試樣品濃度。

4方法原理

在雌激素作用下，雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）ERs的基因在肝臟中的表達(dá)會

明顯上調(diào)。因此，ERs的基因可以作為生物體內(nèi)雌激素活性檢測的典型生物標(biāo)志物。本方

法使用的雌激素斑馬魚的構(gòu)建是以UAS-GFF基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用優(yōu)化重組的雌

激素響應(yīng)元件（ERE）驅(qū)動上游質(zhì)粒GFF的表達(dá)，進(jìn)而對下游UAS質(zhì)粒中熒光基因eGFP表

達(dá)進(jìn)行調(diào)控。類雌激素物質(zhì)能刺激5×ERE響應(yīng)，激活GFF的表達(dá)，而GFF蛋白可與UAS結(jié)

合，進(jìn)而驅(qū)動綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)，從而達(dá)到方便、直觀、動態(tài)檢測環(huán)境類雌激

素物質(zhì)是否存在及其濃度的目的。

5試劑和材料

5.13-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽（C9H11NO2.CH4O3S，簡稱MESAB）

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將MESAB與Na2HPO4·12H2O以1:5的總質(zhì)量比混合，配制成4mg/mL溶液，放

置在4℃儲存。使用時用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水進(jìn)行稀釋，終濃度為0.16mg/mL。

5.2甲基纖維素

甲基纖維素用超純水配制成體積分?jǐn)?shù)為3%的液體膠狀物：將甲基纖維素緩慢加入

沸水中，邊加邊攪拌，甲基纖維素完全溶解后，繼續(xù)攪拌至冷卻到室溫；用錫箔紙密

封燒杯口，放置在4℃儲存。

5.3標(biāo)準(zhǔn)稀釋水

配制方法見附錄A。

5.4陽性對照藥

雌二醇用二甲基亞砜配制成1.00mg/mL溶液，振蕩混勻，使用時終濃度為5.00

ng/mL。

6儀器設(shè)備

6.1生化培養(yǎng)箱

帶有溫控和進(jìn)風(fēng)裝置，溫度控制范圍5℃~50℃，精度±0.1℃。

6.2電子天平

分度值為0.0001g。

6.3水質(zhì)檢測設(shè)備

鹽度計(jì)（電導(dǎo)率測定儀）、硬度計(jì)、pH計(jì)、溶解氧測定儀。

6.4體視顯微鏡

6.5體視熒光顯微鏡

需配有綠色熒光通道。

7試驗(yàn)準(zhǔn)備

7.1斑馬魚準(zhǔn)備

按照GB/T39649的規(guī)定執(zhí)行斑馬魚質(zhì)量控制。

使用轉(zhuǎn)基因雌激素Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）熒光斑馬魚品系。

在體視顯微鏡下挑選每孔30尾發(fā)育正常且發(fā)育階段一致的4dpf斑馬魚，置于3mL燒杯

中進(jìn)行孵育，水溫控制在26-28.5℃。斑馬魚典型圖見附錄B。

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7.2受試樣品信息確認(rèn)

應(yīng)從受試樣品提供方獲得如下樣品信息：

受試樣品的名稱、批號、規(guī)格、數(shù)量、包裝、顏色性狀、主要質(zhì)量標(biāo)志物及含量（如

有）、保存條件、有效期、申請單位名稱、理化性質(zhì)、功能主治等信息。

a）受試樣品為單體成分時，還應(yīng)提供相應(yīng)的化學(xué)信息，包括：結(jié)構(gòu)式、分子量、純

度等。

b）受試樣品的助溶劑信息，在助溶劑中的溶解度，在水中、光中、實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)

定性，pH。

c）整個周期所用受試樣品批號應(yīng)一致。

7.3受試樣品前處理

7.3.1參考表1的方法對不同類型受試樣品進(jìn)行前處理。

表1不同類型受試樣品前處理方法

樣品類型前處理方法

固體類依次經(jīng)過粉碎、提取、超聲、均質(zhì)、化學(xué)提取后氮吹制備受試樣品

液體類冷凍干燥或化學(xué)提取后氮吹制備受試樣品

油類依次經(jīng)過去除軟膠囊殼、內(nèi)容物減壓干燥制備受試樣品

化學(xué)提取具體方法如下：1）取10g奶粉置于50mL離心管中，共4管；2）分別向每個

離心管中加入15mL超純水，渦旋1min，混勻，（水浴鍋預(yù)熱至35~40℃）超聲5min，之后

分別在每個離心管中加入22.5mL乙腈，渦旋1min，混勻，超聲5min；3）分別向每個離心

管中加入6.0g氯化鈉，渦旋1min,混勻1000rpm，離心10min，將離心完的上清液裝入離心

管中；4）將含有上清液的離心管，放置到氮吹儀中，氮吹至干燥，加入4mL甲醇復(fù)溶，

隨后將液體移入裝有300mgC18的5mL離心管，渦旋30s，于4000rpm，離心1min，取凈化

過的上清液過0.22μm濾膜，進(jìn)行過濾，收集液體。

7.3.2受試樣品儲備液宜用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制，受試樣品難以用水溶解時可考慮使用低毒的助

助溶劑或分散劑。推薦的助溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、三甘

醇。適合的分散劑：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯

化氫化蓖麻油。

7.3.3儲備液配制完成的受試樣品應(yīng)做標(biāo)識，包括受試樣品名稱、受試樣品濃度、助溶劑名

稱、配制日期、有效期、儲存條件、配制人。

7.3.4經(jīng)前處理且做好標(biāo)識的受試樣品準(zhǔn)備完成后，進(jìn)入斑馬魚準(zhǔn)備階段。

8試驗(yàn)程序

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8.1暴露條件

8.1.1給藥

在斑馬魚4dpf下午在六孔板中給予受試樣品，以每組3mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋水30尾斑馬

魚的實(shí)驗(yàn)體系孵育。斑馬魚5dpf下午，在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中用篩網(wǎng)將斑馬魚洗脫3次，結(jié)

束暴露。給藥持續(xù)時間為24小時。

8.1.2光照

暴露期間避光處理，避免光照對受試樣品穩(wěn)定性的影響。

8.1.3溫度

26~28.5℃。

8.1.4溶解氧

6mg/L飽和溶解氧。

8.1.5pH

6.8~7.5。

8.2預(yù)實(shí)驗(yàn)

8.2.1試驗(yàn)分組

a）正常對照組：用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水處理的正常斑馬魚。

b）溶劑對照組：用溶劑處理的斑馬魚。如果受試樣品配制過程中使用了本文件以

外的助溶劑或分散劑，則應(yīng)設(shè)置該組。

c）受試樣品處理組：含有受試樣品斑馬魚，受試樣品根據(jù)需要設(shè)置多個不同濃度

組。

8.2.2受試樣品組別設(shè)置

將受試樣品儲備液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水以幾何級數(shù)稀釋成一組適宜的濃度系列，備用。

宜設(shè)置3～5個濃度組，以幾何級數(shù)濃度系列設(shè)置受試樣品濃度梯度，濃度的間隔系數(shù)

≤3.2，宜設(shè)為2。

8.2.3確定NOEC

a）死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：靜止不動、無心臟跳動、軀干呈不透明顏色、對機(jī)械刺激無反

應(yīng)。

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b）異常表型：心包水腫、靜脈瘀血、血流缺失/減少、出血、腦變性/萎縮/水腫、

下頜畸形、眼畸形/水腫、肝臟變性/腫大/萎縮、卵黃囊吸收延遲、腸道發(fā)育異常、軀

干彎曲/縮短/水腫、肌肉變性、鰾未充氣。異常表型的典型圖見附錄B。

c）異常行為學(xué)指標(biāo)：身體側(cè)翻、游動不協(xié)調(diào)、游動劇烈和反常的靜止。

8.3正式試驗(yàn)

8.3.1試驗(yàn)分組

a）正常對照組：用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水處理的正常斑馬魚。

b）溶劑對照組：含有溶劑的斑馬魚。如果受試樣品配制過程中使用了本文件以外

的助溶劑或分散劑，則應(yīng)設(shè)置該組。

c）陽性對照組：用雌二醇處理的斑馬魚，每次試驗(yàn)設(shè)置一個陽性對照組即可。

d）受試樣品處理組：含有受試樣品斑馬魚，受試樣品根據(jù)需要設(shè)置多個不同濃度

組。

注：如果使用了溶劑，所有組別中的溶劑濃度應(yīng)保持相同，且濃度不大于1%（W/V或V/V）。

8.3.2受試樣品濃度設(shè)置

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，確定正式試驗(yàn)的濃度范圍，試驗(yàn)最高濃度組不得高于NOEC

值或該類受試樣品的最大溶解度。以幾何級數(shù)濃度系列設(shè)置至少3個不同的受試樣品

濃度組，濃度的間隔系數(shù)不大于3.2。濃度設(shè)置少于3個時需說明理由。

8.3.3數(shù)據(jù)采集

孵育結(jié)束后，從表型正常的斑馬魚中隨機(jī)選取至少10尾斑馬魚，用三卡因麻醉后，將

斑馬魚用3%甲基纖維素固定（甲基纖維素應(yīng)提前在室溫放置至少30分鐘），在體視熒光

顯微鏡下觀察、拍照并保存。所有試驗(yàn)組斑馬魚拍照應(yīng)在相同的儀器和環(huán)境條件下完成，

且斑馬魚體位保持一致。利用圖像處理軟件測量肝臟熒光強(qiáng)度（代表雌激素的相對含量），

每組的有效數(shù)據(jù)量不低于10個。

9數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

9.1統(tǒng)計(jì)分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)圖表制作與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算各組試驗(yàn)的平均值

（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（StandardError，SE），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用Mean±SE表示。宜

采用方差分析，按方差分析的程序先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P值）和方差齊性檢驗(yàn)（F

值）。當(dāng)F<0.05，P<0.05時，各組均數(shù)間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參

數(shù)檢驗(yàn)。當(dāng)F≥0.05，P≥0.05時，采用單因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結(jié)果進(jìn)行

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統(tǒng)計(jì)。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求

后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩

和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

9.2結(jié)果判定

9.2.1試驗(yàn)質(zhì)量評價

a）正常對照組（如果使用了助溶劑，也包括溶劑對照組）斑馬魚的死亡率或異常

率不得超過10%，超過10%則該次試驗(yàn)視為失敗。

b）正式試驗(yàn)中，如果使用了助溶劑，溶劑對照組與正常對照組之間不能存在統(tǒng)計(jì)

學(xué)上的顯著性差異，如果溶劑對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，

則該次試驗(yàn)視為無效。

c）正式試驗(yàn)中，陽性對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，否則

該次試驗(yàn)結(jié)果視為無效。

9.2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

使用統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較受試樣品各濃度組與正常對照組原始數(shù)

據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，判定為受試樣品具有雌激素效應(yīng)。

注1：由于受試樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中的溶解度受限，可能導(dǎo)致結(jié)果判定為不具有雌激素效應(yīng)。

注2：由于斑馬魚毒性敏感性，導(dǎo)致受試樣品濃度設(shè)置受限，可能導(dǎo)致結(jié)果判定為不具有雌激素效應(yīng)。

10試驗(yàn)報告

試驗(yàn)報告至少應(yīng)給出以下幾個方面的內(nèi)容：

a）檢測依據(jù)；

b）樣品和陽性對照的信息，包括與試驗(yàn)操作相關(guān)的理化性狀；

c）斑馬魚來源和品系等相關(guān)信息；

d）試驗(yàn)條件和方法；

e）數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法；

f）試驗(yàn)開始和完成的日期；

g）試驗(yàn)結(jié)果

h）結(jié)論。

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附錄A

(規(guī)范性)

1×標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制方法

A.1分別稱取以下試劑

a）碳酸氫鈉：稱取2.52gNaHCO3；

b）氯化鉀：稱取0.22gKCl；

c）氯化鈣：稱取11.76gCaCl2?2H2O；

d）硫酸鎂：稱取4.932gMgSO4?7H2O。

A.2定容

將A.1稱取的試劑混合后用去離子水定容至1L。用于配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的試劑均為分析

純試劑，去離子水電導(dǎo)率應(yīng)小于或等于10μS/cm。

A.3將A.2用去離子水稀釋40倍得到標(biāo)準(zhǔn)稀釋水。

最終濃度為：63.0mg/LNaHCO3，5.5mg/LKCl，294.0mg/LCaCl2·2H2O，123.3mg/L

MgSO4·7H2O。

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附錄B

(規(guī)范性)

斑馬魚典型圖

B.1斑馬魚整體特征見圖B.1。

圖B.1斑馬魚整體圖

注：圖A為正常斑馬魚，圖B的斑馬魚出現(xiàn)軀干縮短和彎曲。

B.2斑馬魚主要器官特征見圖B.2。

圖B.2斑馬魚主要組織器官示意圖

圖A為正常斑馬魚，圖B為表型異常斑馬魚。白色虛線所示為下頜，藍(lán)色虛線所示為

心臟，淺綠色虛線所示為肝臟，深綠色虛線所示為卵黃囊，紅色虛線所示為腸道，黃色虛

線所示為魚鰾。

B.3斑馬魚肝臟特征見圖B.3。

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圖B.3斑馬魚肝臟局部圖

圖A為正常斑馬魚，圖B斑馬魚出現(xiàn)肝臟發(fā)黑（變性）和卵黃囊吸收延遲。綠色虛線

所示為肝臟，紅色虛線所示為卵黃囊。

B.4斑馬魚肌肉特征見圖B.4。

圖B.4斑馬魚肌肉變性典型圖

圖A為正常斑馬魚，圖B斑馬魚出現(xiàn)肌肉變性（肌肉紋理不清晰、表面不平整、顏色偏暗）

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附錄C

(規(guī)范性)

斑馬魚雌激素效應(yīng)典型圖

C.1斑馬魚整體特征見圖C.1。

圖C.1六孔板中斑馬魚整體圖

注：圖A為正常斑馬魚，圖B為出現(xiàn)雌激素效應(yīng)的斑馬魚。

C.2斑馬魚肝臟特征見圖C.2。

圖C.2斑馬魚肝臟局部圖

圖A為正常對照組斑馬魚，圖B為溶劑對照組斑馬魚，圖C為雌二醇5.00ng/mL處理

后的斑馬魚。

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《內(nèi)分泌干擾物檢測轉(zhuǎn)基因斑馬魚法》

編制說明

一、任務(wù)來源及起草單位

1.任務(wù)來源

斑馬魚作為一種小型脊椎類模式生物，在全球范圍內(nèi)已有90多年的研究歷史，在藥品、保健食品及食

品等領(lǐng)域的應(yīng)用已得到大量相關(guān)領(lǐng)域企業(yè)的認(rèn)可。斑馬魚試驗(yàn)既有體外試驗(yàn)快速、高效的特點(diǎn)，又具備哺

乳動物試驗(yàn)相關(guān)性好、預(yù)測性高的特點(diǎn)，并且符合國際動物福利保護(hù)趨勢，當(dāng)下已經(jīng)取得了顯著的科研和

產(chǎn)業(yè)化成果。

在此背景下，環(huán)特生物向中國乳制品工業(yè)協(xié)會提交了《內(nèi)分泌干擾物檢測斑馬魚法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)申

請。中國乳制品工業(yè)協(xié)會組織專家召開的標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)審核論證會通過了該團(tuán)標(biāo)的立項(xiàng)申請，并確定由杭州環(huán)

特生物科技股份有限公司牽頭承擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)。該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)旨在建立類雌激素物質(zhì)檢測的新標(biāo)準(zhǔn)，彌補(bǔ)現(xiàn)

有檢測方法在檢測敏感性和操作便捷性方面的不足。

2.起草單位及人員名單

起草單位：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）日用品有限公

司、樸誠乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司、云南云科特色植物提取實(shí)驗(yàn)室有限公司、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、

國家食品安全風(fēng)險評估中心、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢

測技術(shù)研究所、寧波海關(guān)技術(shù)中心、君樂寶乳業(yè)集團(tuán)、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司。

起草人名單：徐懿喬、朱曉宇、曹兵兵、解慶剛、毛新亮、高業(yè)成、張迎春、王飛飛、代榮波、賈旭

東、劉姍、梁晶晶、趙超群、逯剛、董立雅、邱靜、劉漢偉、黃亞芳、周佳麗、黃燕烽、繆文鈺。

3.起草組分工

標(biāo)準(zhǔn)制訂工作的組織、方法開發(fā)、方法驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)文本起草：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司。

提供方法驗(yàn)證的樣品、提供相關(guān)樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法測試數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容審核與修訂：浙江省食品藥品檢

驗(yàn)研究院、國家食品安全風(fēng)險評估中心、寧波海關(guān)技術(shù)中心、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容審核與修訂：黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）日用品有限公司、樸誠乳業(yè)（集團(tuán)）

有限公司、云南云科特色植物提取實(shí)驗(yàn)室有限公司、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司、中國農(nóng)業(yè)科

學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、君樂寶乳業(yè)集團(tuán)。

二、標(biāo)準(zhǔn)編制的目的和意義

環(huán)境雌激素（EnvironmentalEstrogens，EEs）是一類環(huán)境中存在的能干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常生理和生

化功能的化學(xué)物質(zhì)，三大主要的EEs有1、生物來源雌激素，2、人工合成雌激素，3、環(huán)境化學(xué)污染物。乳

制品中天然存在內(nèi)源性雌激素，主要包括雌酮、β-雌二醇、雌三醇，其中β-雌二醇的活性最強(qiáng)，在正常情

1

況下含量很低，并不會擾亂人體的生理機(jī)能和激素代謝；另外還可能有人為添加的，屬于人工合成的外源

性雌激素，最具代表性的是二苯乙烯類合成雌激素，主要有己烯雌酚，己二烯雌酚，己烷雌酚等，它們可

以進(jìn)入動物體內(nèi)，通過干擾動物體內(nèi)源性雌激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解或產(chǎn)

生類似生物體內(nèi)源性雌激素的作用。而己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚都屬于人工合成的雌性激素，是

1，2-二苯乙烯類化合物，具有促進(jìn)動物生長的特性，作為生長促進(jìn)劑用在牛羊等家畜的飼養(yǎng)過程中長期使

用。多種可促進(jìn)動物生長的代用物的效力都遠(yuǎn)不如己烯雌酚，以致使己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚特別

是己烯雌酚等人工合成的雌性激素在動物生產(chǎn)過程中的使用禁而不止?，F(xiàn)已證實(shí)這些人工合成的雌性激素

可在動物的肝臟、肌肉中殘留。如果人們長期食用這種激素含量較高的動物產(chǎn)品，會導(dǎo)致產(chǎn)生諸如兒童性

早熟、成年人癌癥等負(fù)面影響，因此應(yīng)嚴(yán)格控制食品中雌激素的含量。

可檢測有雌激素活性的物質(zhì)的存在方法很多。理化檢測通常檢測的是結(jié)構(gòu)已知的物質(zhì)，但雌激素種類

繁多，結(jié)構(gòu)差異大，化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的相關(guān)性難以預(yù)測。生物學(xué)檢測可以很好模擬人病理吸收代謝機(jī)

制，因此，在這種差異性大的檢測指標(biāo)中，生物學(xué)檢測體現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。

斑馬魚（Zebrafish）具有個體小、繁殖率高、生長周期短、胚胎透明、與人類基因的同源性高、易于

進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作并得到基因突變體，成為研究脊椎動物環(huán)境毒理學(xué)的理想模式生物。斑馬魚已被歐美和中

國監(jiān)管部門廣泛認(rèn)可，歐洲經(jīng)濟(jì)與合作發(fā)展組織（OECD）已經(jīng)頒布了10余項(xiàng)斑馬魚環(huán)境毒理學(xué)評價指

南。OECD和日本的生殖毒理學(xué)家采用斑馬魚作為檢測水環(huán)境內(nèi)分泌干擾物濃度的早期敏感對象。斑馬魚

中有三個基因與哺乳動物雌激素受體（ERs）同源：erα（在斑馬魚中也稱為nr3a1或esr1）、erβ1（nr3a2a

或esr2a）和erβ2（nr3a2b或esr2b）。三種雌激素受體均可與雌激素響應(yīng)元件（ERE）DNA序列結(jié)合，并以

劑量依賴的方式激活胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。

本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因雌激素斑馬魚，建立類雌激素生物學(xué)檢測新方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測方法在檢測敏感性

和操作便捷性方面的不足，達(dá)到快速、高效、低成本的篩查品中潛在風(fēng)險物質(zhì)的目的，是對現(xiàn)行理化檢測

體系的重要補(bǔ)充與提升。

三、主要工作過程

1.立項(xiàng)前調(diào)研工作（2022年04-06月）：

在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了立項(xiàng)前的行業(yè)調(diào)研工作、召開了溝通會議，廣泛聽取行業(yè)意見和

建議。杭州環(huán)特生物科技股份有限公司向中國乳制品工業(yè)協(xié)會提交了《內(nèi)分泌干擾物檢測斑馬魚法》的團(tuán)

體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目申請書。

2.項(xiàng)目啟動階段（2022年07月）：

在與行業(yè)專家和相關(guān)企業(yè)充分溝通的基礎(chǔ)上，2022年07月21日召開了標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)審評會，提案單位進(jìn)行

了立項(xiàng)答辯。標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)通過專家審核并在中國乳制品工業(yè)協(xié)會官網(wǎng)發(fā)布立項(xiàng)公告。隨后成立了標(biāo)準(zhǔn)工作

組。工作組由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、完美（廣東）日用品有限公

司、樸誠乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司、云南云科特色植物提取實(shí)驗(yàn)室有限公司、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、

2

國家食品安全風(fēng)險評估中心、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢

測技術(shù)研究所、寧波海關(guān)技術(shù)中心、君樂寶乳業(yè)集團(tuán)、南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司的多位專家組成，正式

啟動標(biāo)準(zhǔn)制訂工作。

3.形成標(biāo)準(zhǔn)草案（2022年08月-2024年02月）：

杭州環(huán)特生物科技股份有限公司等12家單位對加標(biāo)奶粉的化學(xué)提取方法驗(yàn)證，斑馬魚對內(nèi)分泌干擾物

陽性和陰性化合物試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果，形成標(biāo)準(zhǔn)草稿。

4.形成征求意見稿和編制說明（2024年03月-2024年05月）：

各標(biāo)準(zhǔn)制定參與單位對標(biāo)準(zhǔn)草稿進(jìn)行了充分討論，同時也多次向行業(yè)專家征求意見。標(biāo)準(zhǔn)編制小組

在聽取專家建議和意見的基礎(chǔ)上，對標(biāo)準(zhǔn)草稿做了進(jìn)一步的修改和完善，形成本標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。

四、編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)的編制遵循下列原則：

1.保證標(biāo)準(zhǔn)修訂過程的科學(xué)性。

2.保證標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行過程的可操作性。

3.充分考慮行業(yè)現(xiàn)狀，符合我國保健食品行業(yè)發(fā)展需求和行業(yè)從業(yè)者的技術(shù)水平。

五、編制內(nèi)容說明

1.方法原理

在雌激素作用下，雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）ERs的基因在肝臟中的表達(dá)會明顯上調(diào)。因

此，ERs的基因可以作為生物體內(nèi)雌激素活性檢測的典型生物標(biāo)志物。本方法中使用的雌激素斑馬魚構(gòu)建

是以UAS-GFF基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用優(yōu)化重組的雌激素響應(yīng)元件（ERE）驅(qū)動上游質(zhì)粒GFF的表

達(dá)，進(jìn)而對下游UAS質(zhì)粒中熒光基因eGFP表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。類雌激素物質(zhì)能刺激5×ERE響應(yīng)，激活GFF的表

達(dá)，而GFF蛋白可與UAS結(jié)合，進(jìn)而驅(qū)動綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)，從而達(dá)到方便、直觀、動態(tài)檢測

環(huán)境類雌激素物質(zhì)是否存在及其濃度的目的。

2.魚種的選擇

Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）品系。

3.斑馬魚幼魚的孵育

根據(jù)國內(nèi)外斑馬魚相關(guān)試驗(yàn)的指南和標(biāo)準(zhǔn)，推薦將斑馬魚幼魚的孵育水溫控制在26-28.5℃。溫度偏離

這個范圍的話，斑馬魚的發(fā)育會出現(xiàn)明顯的延遲或加快，需要相應(yīng)地調(diào)整試驗(yàn)方案。

在收集親魚新繁殖的胚胎時，需要用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水將胚胎清洗3遍左右，將胚胎卵膜上可能粘連的食物

殘?jiān)?、糞便清洗干凈，盡量減少食物殘?jiān)图S便中攜帶的微生物特別是真菌對胚胎發(fā)育和生長的影響。除

了在收集胚胎時會發(fā)現(xiàn)部分死亡胚胎之外，有部分胚胎會因?yàn)榇嬖谧陨淼娜毕荻诎l(fā)育過程中死亡。因?yàn)?/p>

3

斑馬魚孵育的溫度較高，所以死亡的胚胎很容易腐爛變質(zhì)，如果清理不及時，就會導(dǎo)致水質(zhì)惡化，同時影

響其它胚胎的發(fā)育。根據(jù)斑馬魚的胚胎發(fā)育階段特點(diǎn)，大部分先天因素導(dǎo)致的胚胎死亡發(fā)生在受精后6小

時以內(nèi)，因此，在胚胎受精后6小時左右或當(dāng)天下班前進(jìn)行清理；在胚胎受精后24小時再清理一次死胚

胎，后續(xù)胚胎基本上很少會出現(xiàn)死亡。

在胚胎發(fā)育的過程中，隨著胚胎植物極營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物如果

在水體中積累過多，也會導(dǎo)致水質(zhì)惡化。因此，至少應(yīng)該每天更換一次胚胎養(yǎng)殖水，每次更換不少于2/3的

水體。

斑馬魚胚胎和幼魚的孵育可以根據(jù)實(shí)際情況選擇不同的容器，比如培養(yǎng)皿、廣口罐、細(xì)胞培養(yǎng)板、燒

杯等。在選擇容器時，建議選擇用惰性材料制成的容器。孵育時要注意培養(yǎng)皿中的斑馬魚胚胎和幼魚的密

度，通常建議每尾斑馬魚最少100μL液體，液體過少會導(dǎo)致斑馬魚生長空間不足，影響發(fā)育。對于斑馬魚

幼魚培養(yǎng)密度，建議6孔培養(yǎng)板每個孔不超過30尾，12孔培養(yǎng)板每個孔不超過20尾，24孔培養(yǎng)板每個孔不

超過10尾，10cm培養(yǎng)皿不超過150尾；對于廣口罐和燒杯等大體積容器，建議斑馬魚胚胎和幼魚的數(shù)量控

制在500以內(nèi)，避免密度過高導(dǎo)致水質(zhì)迅速惡化、溶解氧過低。

4.試驗(yàn)用水

成魚的抵抗力和適應(yīng)能力強(qiáng)，因此對水質(zhì)的要求不是很嚴(yán)格，可用去離子水加入適量的人工海鹽和

碳酸氫鈉（NaHCO3），使水體的重要參數(shù)保持在斑馬魚的適宜范圍內(nèi)即可（電導(dǎo)率維持在480~510

μS/cm，pH維持在6.9~7.2，總硬度（以CaCO3計(jì)）維持在50~100mg/L）。

胚胎和幼魚對水質(zhì)的要求比成魚嚴(yán)格，此外，為了減少水質(zhì)波動對試驗(yàn)結(jié)果的影響，培養(yǎng)液的成分

應(yīng)盡量清晰。因此，胚胎和幼魚的孵育建議使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（40×標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制方法：NaHCO3：2.52

g，KCl：0.22g，CaCl2·2H2O：11.76g，MgSO4·7H2O：4.932g用去離子水定容至1L）。

5.試驗(yàn)溶液

（1）樣品的前處理。首先，考慮到斑馬魚實(shí)驗(yàn)體系對水質(zhì)有嚴(yán)格的要求，一些營養(yǎng)豐富的樣品在斑

馬魚適宜生長的溫度28.5℃容易引起水質(zhì)污染，造成斑馬魚缺氧死亡。其次，內(nèi)分泌干擾物的生物效應(yīng)與

濃度呈正相關(guān)，一些樣品中內(nèi)分泌干擾物相對濃度較低，需要增加樣品中類雌激素的濃度。因此，建議樣

品通過化學(xué)提取進(jìn)行前處理。具體方法如下：1）取10g樣品置于50mL離心管中，共4管；2）分別向每個

離心管中加入15mL超純水，渦旋1min，混勻，（水浴鍋預(yù)熱至35~40℃）超聲5min，之后分別在每個離心

管中加入22.5mL乙腈，渦旋1min，混勻，超聲5min；3）分別向每個離心管中加入6.0g氯化鈉，渦旋1min,

混勻1000rpm，離心10min，將離心完的上清液裝入離心管中；4）將含有上清液的離心管，放置到氮吹儀

中，氮吹至干燥，加入4mL甲醇復(fù)溶，隨后將液體移入裝有300mgC18的5mL離心管，渦旋30s，于4000

rpm，離心1min，取凈化過的上清液過0.22μm濾膜，進(jìn)行過濾，收集液體。

（2）助溶劑的使用。食品的成分較為復(fù)雜，既含有水溶性成分，也含有脂溶性成分，還有一些不溶

性成分（如超微粉碎后直接使用的原料粉、益生菌等）。為了讓食品中的有效成分盡量溶解或均勻分散，

有時候不得不使用一些助溶劑，包括有機(jī)溶劑和分散劑。本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用的都是相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中推薦或者有相

4

關(guān)科研文獻(xiàn)證明其對斑馬魚安全性的助溶劑。推薦的溶劑：丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰

胺、三甘醇。推薦的分散劑：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐溫80、0.01%的纖維素甲醚、聚氧乙烯化氫化

蓖麻油。

對于助溶劑的使用限量，根據(jù)長期積累的數(shù)據(jù)以及本標(biāo)準(zhǔn)涉及到試驗(yàn)內(nèi)容的特點(diǎn)，本標(biāo)準(zhǔn)將助溶劑的

濃度上限定為1%（W/V或V/V）。1%的濃度上限并不意味著所有助溶劑的終濃度都可以用到1%（例如乙

醇不應(yīng)超過0.5%）。在試驗(yàn)溶液配制不受影響的情況下，助溶劑的使用量通常不應(yīng)超過0.1%。只有當(dāng)樣品

溶解性確實(shí)不好且助溶劑安全性非常好的的情況下，方可將助溶劑的終濃度最高增加到1%。如果樣品配制

過程中使用了本標(biāo)準(zhǔn)以外的的助溶劑或分散劑，則應(yīng)設(shè)置溶劑對照組。

如果樣品不能溶解、乳化或制備成均勻分散的懸浮液，則不適用于本標(biāo)準(zhǔn)的方法。

（3）試驗(yàn)溶液的pH。斑馬魚最適的pH是在6.8-7.5之間，pH6.0-8.5可以正常生長，短期內(nèi)pH5.0-9.0也

可以耐受。一旦pH值<5.0或者>9.0，即便是短期內(nèi)也會對斑馬魚產(chǎn)生嚴(yán)重傷害。因此，在試驗(yàn)中要盡量使

試驗(yàn)溶液的pH值維持在最適宜斑馬魚生長的范圍內(nèi)。如果加入樣品后試驗(yàn)溶液的pH值有明顯變化，不應(yīng)

該直接調(diào)節(jié)試驗(yàn)溶液的pH，因?yàn)闀淖冋麄€試驗(yàn)體系；應(yīng)該調(diào)節(jié)樣品貯備液的pH值，使其接近加入樣品

前試驗(yàn)用水的pH值。然后再重新配制試驗(yàn)溶液。

為了避免在調(diào)節(jié)pH的時候引入其它可能影響試驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)物質(zhì)，推薦使用HCl和NaOH來調(diào)節(jié)。為

了避免因?yàn)檎{(diào)節(jié)pH導(dǎo)致貯備液的成分和濃度發(fā)生變化，在調(diào)節(jié)pH的過程中，貯備液的顏色不應(yīng)發(fā)生變

化、不能有氣體或沉淀產(chǎn)生。

（4）在本標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法中，斑馬魚是直接暴露在樣品溶液中，為了減少滲透壓過高對斑馬魚正常

生理活動的影響，對樣品的測試濃度要設(shè)置一定的上限。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對于以小分子單體化合物為主要成分

的樣品（如維生素、礦物質(zhì)），測試濃度上限定為1000μg/mL；對于成分多樣混合物（如天然植物提取

物）或分子量＜3KD的大分子化合物的測試濃度上限為2000μg/mL；對于液體樣品，需要根據(jù)樣品中的有

效成分含量或者可溶性成分濃度來確定測試上限，通常用體積比表示。對于很難溶解或很難均勻分散的樣

品物質(zhì)，水溶暴露后很難保證斑馬魚的有效吸收，應(yīng)考慮對樣品必要的前處理或改用水溶暴露以外的其它

處理方式。根據(jù)OECD236指南的內(nèi)容，對于分子量≥3KD的大分子化合物，因?yàn)樯锢枚鹊南拗疲?/p>

適合采用水溶暴露方式，應(yīng)考慮對樣品必要的前處理或改用水溶暴露以外的其它處理方式。

（5）在日常的試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)有一些單體成分或者天然提取物自身會產(chǎn)生熒光信號。如果樣品產(chǎn)

生熒光的條件（激發(fā)波長和發(fā)射波長）與內(nèi)分泌干擾物誘發(fā)的綠色熒光相同，就會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的

干擾，不適用于本標(biāo)準(zhǔn)的測試方法。

（6）每次試驗(yàn)前需要測試一次樣品溶液的溶解氧和pH，以確保樣品溶液的溶解氧和pH在正常的范圍

內(nèi)，避免水體環(huán)境對試驗(yàn)結(jié)果的干擾。在本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的評價方法下，換液時進(jìn)行一次測試即可，試驗(yàn)終點(diǎn)

不需要再次測試。

6.斑馬魚發(fā)育階段和給藥階段的選擇

選擇的是早期發(fā)育過程中的斑馬魚，這個階段斑馬魚發(fā)育較快，受精后不同天數(shù)的斑馬魚生理狀態(tài)會

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有很大的差別。因此，斑馬魚發(fā)育階段的選擇就非常重要。

受精后3天的斑馬魚肝臟開始發(fā)育，受精后5天肝臟發(fā)育完全。當(dāng)Tg（5xERE:GFF;UAS:EGFP）品系接

觸到內(nèi)分泌干擾物，綠色熒光在肝臟表達(dá)，因此，發(fā)育階段必須選擇受精后3天及以后。通過大量試驗(yàn)發(fā)

現(xiàn)，斑馬魚暴露在內(nèi)分泌干擾物中24小時后（即給藥階段為24小時），肝臟即可表達(dá)綠色熒光?？紤]到受

精后5天肝臟發(fā)育完全，形態(tài)完整，便于數(shù)據(jù)分析，發(fā)育階段選擇受精后4天。

7.斑馬魚數(shù)量的選擇

為了避免因斑馬魚個體異?；蛩劳鰧?dǎo)致試驗(yàn)數(shù)據(jù)不滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的情況發(fā)生，在造模和樣品處理階

段，每組的斑馬魚數(shù)量應(yīng)不少于20尾，除特殊情況外，每組的斑馬魚數(shù)量不用超過30尾。

8.樣品濃度設(shè)計(jì)

在進(jìn)行正式試驗(yàn)之前，會通過預(yù)試驗(yàn)來確定正式試驗(yàn)的濃度設(shè)計(jì)。

對于一些已經(jīng)有其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)的樣品，可以從兩個維度來確定斑馬魚預(yù)試驗(yàn)的濃度設(shè)計(jì)：（1）根據(jù)

已有的其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)推算而來斑馬魚試驗(yàn)濃度，（2）樣品自身特性所決定的測試上限。當(dāng)推算得出的試

驗(yàn)濃度超出本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品的測試上限或樣品自身的溶解度上限時，以測試上限或溶解度上限為

預(yù)試驗(yàn)的最高濃度，然后向下設(shè)計(jì)一系列濃度，其中需要包含推算得出的試驗(yàn)濃度；當(dāng)推算得出的試驗(yàn)濃

度不高于本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品的測試上限和樣品自身的溶解度上限時，可以將推算得出的試驗(yàn)濃度作

為中間濃度來設(shè)計(jì)預(yù)試驗(yàn)一系列濃度。

對于沒有其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)的樣品，直接根據(jù)樣品自身特性所決定的測試上限（本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定該類別樣品

的測試上限或樣品自身的溶解度上限）來設(shè)計(jì)試驗(yàn)濃度。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)的樣品試驗(yàn)濃度范圍跨度不應(yīng)小于10，濃度范圍跨度過小，可能無法通過預(yù)試驗(yàn)確

定樣品的無可觀察毒性效應(yīng)濃度（NOEC）；同時，濃度的間隔系數(shù)不大于3.2，濃度的間隔系數(shù)過大，可

能導(dǎo)致試驗(yàn)確定的NOEC值遠(yuǎn)小于真實(shí)的最高安全濃度，導(dǎo)致后續(xù)正式試驗(yàn)的測試濃度偏低，可能影響試

驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。正式試驗(yàn)的樣品濃度的間隔系數(shù)同樣不能大于3.2，樣品的濃度組別數(shù)可以根據(jù)需要設(shè)

置，一般不應(yīng)少于3組。濃度間隔系數(shù)過大或者濃度組別過少，可能都會導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的偏差，無法充分

反映樣品的雌激素效應(yīng)強(qiáng)弱及其量效關(guān)系。

9.顯微鏡拍照

隨機(jī)選取至少10尾斑馬魚用甲基纖維素固定在體視（熒光）顯微鏡下觀察拍照，拍照部位為從斑馬魚

頭部至卵黃囊，通常需要采集完整的全身明場圖片用于制作示意圖。拍照時斑馬魚應(yīng)頭朝左、腹部朝下、

完全側(cè)躺，所有斑馬魚的體位應(yīng)該保持一致。

照片的拍攝效果主要取決于顯微鏡的放大倍數(shù)和光源條件等，要求背景干擾小、圖像清晰、定量區(qū)域

肝臟完全落在視野范圍之內(nèi)。實(shí)際工作中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室顯微鏡的配置情況適當(dāng)調(diào)整拍照參數(shù)，但同一

次試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在相同的條件下進(jìn)行拍照，通常要求體視顯微鏡的放大倍數(shù)不低于20倍，拍照系統(tǒng)的像素不低

于2000萬。

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10.圖像分析

拍照完成后，可以使用熒光顯微鏡廠家配備的圖像分析軟件或者其它的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析。

在分析時，將斑馬魚肝臟設(shè)置為感興趣區(qū)域（ROI，regionofinterest），分析ROI的熒光強(qiáng)度總和值（或其

它類似指標(biāo)）。有些圖像分析軟件可以直接計(jì)算ROI的光密度總和，有些圖像分析軟件只能通過分別計(jì)算

ROI總面積和光密度平均值來計(jì)算得到ROI的光密度總和（ROI光密度=ROI面積×ROI光密度平均值）。用

分析得到的ROI熒光總和值來表示斑馬魚肝臟類雌激素物質(zhì)的含量。

11.結(jié)果評價

（1）數(shù)據(jù)分析

將圖像分析得到的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算各組試驗(yàn)的平均值（Mean）及標(biāo)準(zhǔn)誤差（Standard

Error，SE），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用Mean±SE表示。與平均值相差2個SD以上的數(shù)據(jù)可以按照異常數(shù)據(jù)予以

剔除，每組數(shù)據(jù)最多只能剔除2個異常數(shù)據(jù)。剔除掉異常數(shù)據(jù)之后，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

宜采用方差分析，按方差分析的程序先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P值）和方差齊性檢驗(yàn)（F值）。當(dāng)F<0.05，

P<0.05時，各組均數(shù)間組間至少有一組有顯著性差異，宜采用非參數(shù)檢驗(yàn)。當(dāng)F≥0.05，P≥0.05時，采用單

因素方差分析，選擇事后兩兩比較的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待

滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊性的目的，改

用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。樣品處理組與溶劑對照組相比較，P<0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

（2）結(jié)果判定及說明

受試樣品各濃度組與溶劑對照組比較，任一濃度組肝臟熒光強(qiáng)度總和升高，差異有顯著性，可判定該

受試樣品具有雌激素效應(yīng)。

注1：由于受試樣品在標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中的溶解度受限，可能導(dǎo)致結(jié)果判定為不具有雌激素效應(yīng)。

注2：由于斑馬魚毒性敏感性，導(dǎo)致受試樣品濃度設(shè)置受限，可能導(dǎo)致結(jié)果判定為不具有雌激素效應(yīng)。

12.保證試驗(yàn)有效性的條件

根據(jù)前期積累的大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)且僅當(dāng)一個試驗(yàn)滿足如下的質(zhì)量控制要求時，試驗(yàn)結(jié)果的有效性才

會被認(rèn)可：

（1）正常對照組（如果使用了助溶劑，也包括溶劑對照組）斑馬魚的死亡率或異常率不得超過

10%，超過10%則該次試驗(yàn)視為失敗。

（2）正式試驗(yàn)中，如果使用了助溶劑，溶劑對照組與正常對照組之間不能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差

異，如果溶劑對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，則該次試驗(yàn)視為無效。

（3）正式試驗(yàn)中，陽性對照組與正常對照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，否則該次試驗(yàn)結(jié)果視

為無效。

六、主要試驗(yàn)驗(yàn)證情況和預(yù)期達(dá)到的效果

7

1.樣品前處理方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證

1.1樣品信息

愛他美2段奶粉，生產(chǎn)廠家MilupaGmbH。

乙腈中8種甾體激素混標(biāo)溶液（GB31658.9-2021&農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號-1-2020）和乙腈中8種甾體

激素內(nèi)標(biāo)混標(biāo)溶液（GB31658.9-2021內(nèi)標(biāo)&農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號-1-2020）具體信息見表1。

表1.混標(biāo)和內(nèi)標(biāo)信息匯總

濃度濃度

混標(biāo)內(nèi)標(biāo)生產(chǎn)廠家

（μg/mL）（μg/mL）

雌三醇100雌三醇-D310

雌酮100雌酮-D210

炔雌醇100炔雌醇-D410

17α-雌二醇10017α-雌二醇-D210

雌二醇雌二醇

100-D210

(E,Z)-己烯雌酚100E-己烯雌酚-D810天津阿爾塔科技有限公司

己烷雌酚-D4(非對

己烷雌酚10010

映異構(gòu)體混合物)

雙烯雌酚100Z,Z-雙烯雌酚-D610

1.2驗(yàn)證時間、單位及人員

表2.驗(yàn)證時間、單位及人員

驗(yàn)證時間驗(yàn)證單位驗(yàn)證人員

2023.11-2024.01浙江省食品藥品鑒定研究院梁晶晶、趙超群

1.3驗(yàn)證方法

1.3.1提取

（1）取10g奶粉置于50mL離心管中，共4管；

（2）分別向每個離心管中加入15mL超純水，渦旋1min,混勻，（水浴鍋預(yù)熱至35~40℃）超聲5

min之后分別在每個離心管中加入22.5mL乙腈，渦旋1min，混勻，超聲5min；

（3）分別向每個離心管中加入6.0g氯化鈉，渦旋1min,混勻1000rpm，離心10min，將離心完的上

清液裝入離心管中；

（4）將含有上清液的離心管，放置到氮吹儀中，氮吹至干燥，加入4mL甲醇復(fù)溶，隨后將液體移入

裝有300mgC18的5mL離心管，渦旋30s，于4000rpm，離心1min，取凈化過的上清液過0.22μm濾

膜，進(jìn)行過濾，收集液體。

1.3.2儀器參考條件

條件參考《GB31658.9-2021食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品及尿液中雌激素類藥物多殘留的測定液相

色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》和《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號-1-2020飼料中炔雌醇等8種雌激素類藥物的測定液相

8

色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。

1.4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

8種內(nèi)分泌干擾加標(biāo)回收結(jié)果顯示平均回收率在87.730~106.275%，精密度在1.616~7.852%，表明該方

法適用于奶粉的前處理。

2.樣品內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)轉(zhuǎn)基因斑馬魚法驗(yàn)證

2.1樣品信息

在標(biāo)準(zhǔn)文本確定后，本標(biāo)準(zhǔn)提出單位與各參與單位協(xié)商，確定了共計(jì)4種內(nèi)分泌干擾物陽性化合物和2

種內(nèi)分泌干擾物陰性化合物，這些化合物是否具有內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)均有文獻(xiàn)報道，用于對本標(biāo)準(zhǔn)所述試

驗(yàn)方法的測試和驗(yàn)證。樣品詳細(xì)信息見表3。

表3.樣品信息匯總

樣品編號樣品名稱樣品批號性狀生產(chǎn)廠家

1雌二醇H1901075白色晶狀粉末上海阿拉丁生化科技股份有限公司

24-叔辛基苯酚H2106184白色絮狀物上海麥克林生化科技股份有限公司

3雙酚AC2126102白色顆粒上海阿拉丁生化科技股份有限公司

4炔雌醇E2014109白色粉末上海阿拉丁生化科技股份有限公司

511-酮睪酮C12730415白色粉末上海阿拉丁生化科技股份有限公司

6地塞米松C2110208白色粉末上海阿拉丁生化科技股份有限公司

2.2驗(yàn)證時間、單位及人員

除本標(biāo)準(zhǔn)提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司之外，另有兩家從事斑馬魚生物技術(shù)的公司參與本

標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法的驗(yàn)證工作。驗(yàn)證單位和人員的詳細(xì)信息見表4。

表4.驗(yàn)證時間、單位及人員

驗(yàn)證時間驗(yàn)證單位驗(yàn)證人員

2023.02-2023.04杭州環(huán)特生物科技股份有限公司楊怡雯、徐懿喬

2023.04-2023.07寧波海關(guān)技術(shù)中心劉漢偉

2022.10-2022.12南京歆佳醫(yī)藥科技有限公司周錦錦

2.3驗(yàn)證方法

按《內(nèi)分泌干擾物檢測轉(zhuǎn)基因斑馬魚法》標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行測試及驗(yàn)證。

9

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試驗(yàn)方法的測試結(jié)果受多種因素的影響，如樣品處理方式、斑馬魚胚胎的質(zhì)量狀況、拍

照技術(shù)、定量方法等。因此，為了驗(yàn)證方法的一致性，我們組織了協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)，由三家具有斑馬魚試驗(yàn)

能力的實(shí)驗(yàn)室單位，在相同的試驗(yàn)條件下對同一樣品進(jìn)行測試，以測試結(jié)果的重復(fù)性反映方法的一致性。

標(biāo)準(zhǔn)提出單位杭州環(huán)特生物科技股份有限公司、驗(yàn)證單位1寧波海關(guān)技術(shù)中心、驗(yàn)證單位2南京歆佳醫(yī)

藥科技股份有限公司分別按照本標(biāo)準(zhǔn)文本中的方法對表1中所列的全部6種樣品進(jìn)行內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)評

價。3家驗(yàn)證單位的試驗(yàn)結(jié)果表明，上述4種內(nèi)分泌干擾物陽性化合物（雌二醇、4-叔辛基苯酚、雙酚A和

炔雌醇）在斑馬魚評價試驗(yàn)中均呈陽性反應(yīng)，2種內(nèi)分泌干擾物陰性化合物（11-酮睪酮和地塞米松）均

呈陰性反應(yīng)。

三家驗(yàn)證單位用同樣的方法測試同一個樣品，結(jié)果顯示不同實(shí)驗(yàn)室之間斑馬魚內(nèi)分泌干擾物陽性化合

物和陰性化合物含量非常接近，測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到20%以內(nèi)，說明不同實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性較

好。

七、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)情況及與國際同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對比說明

本標(biāo)準(zhǔn)沒有采用國際標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中查到同類國際標(biāo)準(zhǔn)：OECDTG250EASZYassay:DetectionofEndocrineActive

Substances,actingthroughestrogenreceptors,usingtransgenictg(cyp19a1b:GFP)Zebrafishembryos.

八、標(biāo)