-5-1前言1.1植物簡介大戟科(Euphorbiaceae),屬于雙子葉植物,多數(shù)為草本植物,也有灌木或喬木,該植物種類達(dá)到了300多個(gè)屬、大約有5000種,遍布全球各地,但主要集中在熱帶和亞熱帶地區(qū),我國也引進(jìn)種植了大量的該科植物，目前共約有70多屬，約460種，在全國各地均有分布，主要生產(chǎn)地為西南地區(qū)至臺灣地區(qū)[1]。根據(jù)《新華本草綱要》的相關(guān)記載,有36屬134種植物被用作藥用植物,它們主要分布在我國沿海地區(qū)、華西及華南地區(qū)等區(qū)域。大多數(shù)植物都含有二萜脂化合物(巴豆烷)、生物堿類成分(如吡咯)等具有生理活性的化學(xué)成分。此外本科植物的根、葉、乳汁和莖中普遍存在四環(huán)三萜和五環(huán)三萜類化合物[2]，本科藥物在醫(yī)療領(lǐng)域中表現(xiàn)出很強(qiáng)的瀉下逐水的作用,對于胸水、腹水以及高度水腫具有顯著的治療效果，同時(shí)還能有效緩解大便不通、胃腸積滯等消化問題[3]，然而值得注意的是，本科中的許多藥用植物含有毒性成分，這些毒性物質(zhì)往往具有強(qiáng)烈的刺激性,一旦接觸皮膚,便可能會引發(fā)發(fā)泡、充血以及脫皮等不良反應(yīng);更為嚴(yán)重的是對腸胃的刺激性很強(qiáng),會引起十分強(qiáng)烈的腹瀉、腹痛和便血問題[2]。大戟科巴豆屬(Croton)植物在全球大約有800多種，巴豆屬(CrotonL.)植物多為灌木或喬木,少有草本。在熱帶、亞熱帶地區(qū)分布較為廣泛，我國有21種，主要分布于南方各省ADDINNE.Ref.{5C19C0B1-9DFB-456E-B1C7-318C58250AAA}[4]。巴豆屬中的許多植物在民間應(yīng)用廣泛，該屬植物具有抗癌保肝、降血脂血糖、降血壓、血管松弛等生理活性ADDINNE.Ref.{A80AC0FE-EFE8-4CE0-BE54-3D3D79CCA310}[5]。因其屬植物含有巴豆霜和巴豆油，具有致瀉、促腫瘤發(fā)生和致炎的作用，在臨床應(yīng)用需謹(jǐn)慎ADDINNE.Ref.{3C200565-6460-4D6F-B1B5-A232EF8C973F}[6]。大麻葉巴豆(Crotondamayeshu)為巴豆屬植物，小喬木，生長于海拔1000-1800米山地疏林中，高度可達(dá)7-10米，主要生長在云南南方地區(qū)。葉薄革質(zhì)，卵形至棉圓形，邊緣具細(xì)銀齒；枝條和葉兩面均無毛；總狀花序，頂生，直立或稍傾斜；蒴果和種子均為橢圓狀[7]。1.2化學(xué)成分1.2.1二萜類成分在過去的對天然產(chǎn)物的研究報(bào)告中，對巴豆屬的二萜類化合物研究占據(jù)主要部分。據(jù)查閱文獻(xiàn)，截止2018年共有399種新化合物從巴豆屬中被分離出來，其中二萜類化合物有339個(gè)，占總化合物的84.96%[8]。在2016年研究者在卵葉巴豆(C.caudatus)枝葉的甲醇提取物中分離得到3個(gè)新的巴豆烷型二萜類化合物[9]；2022年研究人員從大麻葉巴豆中分離得到35個(gè)巴豆烷型二萜和2個(gè)對映-貝殼杉烷型二萜,其中有10個(gè)化合物為新的巴豆烷型二萜[10]。在2023年研究人員深入探索了大麻葉巴豆全植株的化學(xué)特性，并從中成功分離出6個(gè)具有顯著細(xì)胞毒活性的巴豆烷型二萜類化合物，其中有2個(gè)化合物是全新發(fā)現(xiàn)的[11]。除了巴豆烷型二萜類化合物外，它們的結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，包括半日花烷型、貝殼杉烷型、多環(huán)二萜、新克羅烷型、和trachylobane型、大環(huán)二萜、無環(huán)二萜等。[5]。佛波醇(phorbol)作為典型的巴豆烷型二萜化合物，首次在巴豆(CrotontigliumL.)中被發(fā)現(xiàn)并分離出來[12]。江志勇等人對大麻葉巴豆(Crotondamayeshu)的樹葉提取物進(jìn)行分離純化，從中得到的10個(gè)佛波酯型巴豆烷二萜，均為全新的化合物[13]。1.2.2鞣質(zhì)類Y.cai等從C.lechleri中成功提取分離出了一系列的鞣質(zhì)類化合物,這些化合物主要是由兒茶素、培兒茶素、表兒茶素、表培兒茶素等關(guān)鍵成分組成的縮合鞣質(zhì),這些化合物通過特殊的C4～C8、C4～C6相互連接，形成了結(jié)構(gòu)獨(dú)特的二聚體、三聚體和四聚體等[14]。1.2.3生物堿類巴豆屬植物中富含多種生物堿，巴豆生物堿(AC)是巴豆中具有功效的成分里的一種[15]，但對巴豆屬中的生物堿類活性成分的研究較少，據(jù)查閱文獻(xiàn)并綜合分析可知：從巴豆中分離出的生物堿包括巴豆苷、異鳥嘌呤等，除此之外，研究者還從中發(fā)現(xiàn)并分離出了新的生物堿成分——木蘭花堿成分[16-17]；林文翰從巴西巴豆屬藥用植物分離得到12個(gè)生物堿,其中4個(gè)為新生物堿[18]。Caruzo等人從棘果巴豆的(Crotonechinocarpus)葉的含水酒精(70%EtOH)提取物中分離出具有體外抗HIV的活性，能夠抑制40%的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性的降異包爾定和紫董咖啡堿[19]。從巴豆枝葉的95%乙醇提取物中，孫欣等人成功分離得到全新的生物堿cordiarimideB[20]。1.2.4三萜類根據(jù)查閱綜述文獻(xiàn)得知Yi等人從雞骨香中成功分離出了一種名為化紫膠桐油酸(aleuritolicacid,簡稱AA)的三萜化合物，這種化合物具有顯著的特性，它能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞展現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性[21]；在1988年泰國研究人員首次從C.crassifolius首次分離得到acetylaleuritolicacid，β-amyrin[22]。在2010年Monica等人也從C.cajucara中分離得到acetylaleuritolicacid[23]。1.2.5有機(jī)酸類梁英等人使用石油醚、乙醇等溶對巴豆種子油進(jìn)行提取分離出26個(gè)組分，并對第22個(gè)組分用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)的測定，共分離出26種化學(xué)物質(zhì)，鑒定出23種為有機(jī)酸類，3種未知[24]。在查閱對巴豆油的研究文獻(xiàn)得知：在對巴豆屬植物的化學(xué)研究中，提取研究有機(jī)酸類化學(xué)物質(zhì)重點(diǎn)聚焦在巴豆種仁上，這種種仁中，脂肪油的含量占據(jù)了顯著的比例，大約在34%～57%之間[25],這些脂肪油并非是單一成分，而是有多種化合物構(gòu)成的甘油酯，其中包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、巴豆油酸以及巴豆酸等[16]。劉敬等人借助GC(氣相色譜法)對生巴豆和巴豆霜脂肪油展開分析研究，并從二者中一共檢測出22種脂肪酸[26]。胡靜等人巧妙的運(yùn)用了GC-MS對巴豆和巴豆霜的石油醚提取物進(jìn)行了深入的分析研究，通過這一方法，他們成功地識別并確認(rèn)了14個(gè)不同的化學(xué)組分，分別占巴豆和巴豆霜石油醚提取物總組分的量的98.17%和99.03%，在二者的石油醚提取物中提取出人體無法自行合必須從外界攝入以維持正常生理功能的脂肪酸——亞油酸，含量占比分別為：55.90%、64.28%[27]。鄒國安等人從毛葉巴豆中分離得到了硬脂酸、棕櫚酸和香草酸等11個(gè)化合物[28]。1.2.6黃酮類據(jù)查閱文獻(xiàn)，關(guān)于巴豆屬的文獻(xiàn)報(bào)道中對黃酮類的研究較少，在已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)中的黃酮類化合物主要是以槲皮素為母體,3、7、4′位羥基發(fā)生甲基化反應(yīng)的衍生物[29]，鄒國安等從光葉巴豆(CrotonlaevigatusVahl.)的甲醇提取物采用硅膠柱色譜、凝膠色譜等多種分離方法，一共從中分離出29個(gè)化合物，其中包括15個(gè)黃銅及其苷，占比約為52%[30]。1.2.7揮發(fā)油一直以來人們對巴豆屬植物的揮發(fā)性化學(xué)成分的研究較為重視，寧德生等人對石山巴豆與毛果巴豆中的揮發(fā)油成分采用GC-MS技術(shù)進(jìn)行分析，從石山巴豆中分離鑒定出39種組分，占揮發(fā)油總量的95,96%；從毛果巴豆葉中分離鑒定出55種成分,占揮發(fā)油總量的97.8%,本次研究發(fā)現(xiàn)了常作為香料合成原料的桉樹醇、橙花叔醇等活性成分[31]。鄧益嬡等采用水蒸氣蒸餾法對巴豆枝葉中的揮發(fā)油成分進(jìn)行提取,運(yùn)用GC-MS法對揮發(fā)油的化學(xué)組分測定和分析，總共確定了24個(gè)組分,占揮發(fā)油總成分的90%以上[32]。1.2.8其它成分巴豆屬植物還含有其它化學(xué)活性成分，陳偉等人首次從銀葉巴豆中提取分離出了β-谷甾醇、香草醛、胡蘿卜苷等成分[33]，也有研究人員從巴豆屬植物中分離出氨基酸、精油、酶等化合物[34-35]。,張少梅采用ICP-AES技術(shù)(電感耦合等離子體原子發(fā)射儀)對巴豆全株植物進(jìn)行微量元素的測定，并從中發(fā)現(xiàn)Cu、Zn、K、Na、Fe、Mn、Ca、Sr、Mg、Al等10種含量豐富的微量[36]。1.3藥理作用1.3.1細(xì)胞毒性Fan等從越南巴豆提取物中分離出了化合物crokonoidA，其對HL-60(急性白血病)、A-549(肺癌)等腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性[37]。巴豆屬植物中分離出的化合物顯示出對人體腫瘤細(xì)胞(肺癌A-549、白血病HL-60、乳腺癌MCF-7、肝癌SMMC-7721、以及結(jié)腸癌SW480)等具有顯著的細(xì)胞毒活性[8]。潘爭紅等從石山巴豆(Crotoneuryphyllus)枝葉提取物中分離得到的1個(gè)二萜成分和1個(gè)黃酮類成分對肝癌SMMC-7721、肺癌A-549、乳腺癌MCF-7和結(jié)腸癌SW480等四種腫瘤細(xì)胞株均有明顯的抑制活性，從毛果巴豆(CrotonlachnocarpusBenth)根提取物中分離得到1個(gè)三萜成分對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721具有明顯的細(xì)胞毒活性[38]。林翠英等從巴豆屬植物Crotonmongue種子提取物中，分離出具有抗腫瘤的功能的新的糖蛋白monguin[39]。王瑩從巴豆屬植物Crotoncajucara的樹皮中分離出了二萜類成分(trans-dehydrocrotonin)具有明顯的抗基因毒活性[40]。S.Bloch等從C.zambesicus分到一種二萜類物質(zhì)Ent-trachyloban-3β-ol對人的子宮癌細(xì)胞具有毒性[41]。徐冬青等人采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC-7901Fas(胃腺癌細(xì)胞)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示巴豆生物堿有誘導(dǎo)人胃腺細(xì)胞SGC-7901分化的能力,因此可對抗腫瘤的發(fā)生[42]。吳新安等從巴豆屬植物中分離提取出來了二萜類化合物，經(jīng)過研究得知分離出來的化合物多數(shù)具備細(xì)胞毒活性,這些化合物能夠促使乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序,不過對正常細(xì)胞毒性較小或無毒性[6]。Jia等對大麻葉巴豆全植株浸取物進(jìn)行分離提取,最終得到6個(gè)巴豆烷二萜類化合物,并對分離得到的所有化合物進(jìn)行了5株人癌細(xì)胞系(HL-60、A-549、SMMC-7721、MDA-MB-231和SW-480)進(jìn)行細(xì)胞毒性活性評價(jià)，其中新化合物2對以上五種腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞毒性；化合物4對A-549極具選擇性的細(xì)胞毒性[11]。Su等從云南巴豆(Crotonyunnanensis)中分離出9個(gè)二萜類化合物并進(jìn)行了細(xì)胞毒性評價(jià)，最終發(fā)現(xiàn)了化合物5對HL-60、SMMC-7721、A-549三種腫瘤細(xì)胞系較為明顯的細(xì)胞毒性[43]。1.3.2抗菌作用Li等在對雞骨香的根部提取物進(jìn)行深入研究時(shí)，成功分離出了一種名為crotonpyronesB的化合物，該化合物歸類于吡喃-2-酮衍生物，為了探究其抗菌活性，研究人員選取了糞腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌開展了抗菌活性評估實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：crotonpyronesB對金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出中等程度的抗菌效果[44]。彭帥對巴豆乙酸乙酯萃取物進(jìn)行分離并對分離得到的單體化合物對結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株(M.tuberculosis)進(jìn)行測試，結(jié)果表明化合物1(14-deoxy-20-oxophorbol-12-tiglyl-13-acetate)、化合物6(12-O-tiglyl-4-deoxy-4a-phorbol-13-acetate)、化合物2(7-oxo-5-ene-phorbol-13-(2-methylbutyrate)和化合物7(CrotignoidE)對結(jié)核杠菌桿菌體現(xiàn)出較顯著的生物活性[45]。胡林峰等采用生長速率法對巴豆果殼、巴豆種子的提取物進(jìn)行10種病原菌的離體抑菌活性測試，結(jié)果表明提取物都具有一定的抑菌活性[46]。趙中夫等在巴豆油的各分離成分對結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究(在體外的條件下)發(fā)現(xiàn)巴豆油對多藥耐藥菌株、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長具有顯著的抑制作用[47]。也有文獻(xiàn)顯示：巴豆煎劑對于白喉?xiàng)U菌、流感桿菌等具備一定的防止細(xì)菌繁殖的功效[25]。吳新安對巴豆葉95%乙醇提取物進(jìn)行金大腸桿菌、黃色葡萄球菌綠和膿桿菌的抑菌作用評價(jià)?結(jié)果發(fā)現(xiàn)?巴豆葉提取物對大腸桿菌具有一定的抗菌活性[48]。1.3.3抗炎作用黃文娟發(fā)現(xiàn)從巴豆屬植物中提取得到的花生酸和微量元素(Mg、Fe、Ca)是可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛和抗炎效果的成分[49]。Wang等從巴豆枝葉的乙醇提取物中成功分離出了一種名為12-O-苯甲?；鸩ù?13-(2-甲基)丁酯的化合物，它屬于佛波酯類化合物，該化合物在研究中顯示出對誘發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶——COX-1和COX-2呈現(xiàn)出中等程度的抑制效果[50]。孫頌三等發(fā)現(xiàn)巴豆霜對小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性具有明顯的抑制作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了巴豆霜對由巴豆油誘發(fā)導(dǎo)致的小鼠耳腫脹有明顯的抑制效果[51]。1.3.4毒性作用巴豆屬植物多數(shù)具有巴豆油的成分，食用巴豆油會帶來嚴(yán)重的口腔刺激狀況，甚至引發(fā)胃腸炎，將巴豆油外用對皮膚產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激影響,會出現(xiàn)皮膚發(fā)紅,嚴(yán)重可能導(dǎo)致膿皰甚至造成皮膚壞死[6]。巴豆具有殺滅田螺的作用,其中種仁效力尤為突出，相比之下，外殼則沒有任何效果；另外值得注意的是，巴豆的丙酮提取物對金魚有顯著的的毒副影響；巴豆水劑能夠影響家兔的膽汁和胰液分泌量，使其分泌增多,對兔子的離體子宮有輕微的抑制效果[52]。陳慧芳從越南巴豆CrotontonkinensisGagnep的葉的干粉甲醇提取物中分離得到的二萜類組分ent-11α-乙酸基貝殼杉-16-烯-18-酸、ent-11α,18-二乙酸基-7β-羥基貝殼杉-16-烯-15-酮導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的海幼蝦全部死亡，表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性[53]。1.3.5其它作用巴豆屬植物除具有以上作用外，還有研究表明具有抗利什曼原蟲活性、抗?jié)兓钚?、免疫調(diào)節(jié)、止瀉[54,5,55]。巴豆屬植物木蘭花堿成分具有抗糖尿病、抗氧化、降壓等多種藥理活性[56]。巴豆屬植物甾醇類化合物還具有調(diào)血脂、預(yù)防心血管疾病等藥理活性[57]。巴豆豆仁的乙醇提取物有成分毒殺印鼠客蚤的藥理作用[15]。光葉巴豆具有通經(jīng)活血、退熱止痛等藥理作用[58]。1.4研究目的與意義我國的巴豆屬植物分布廣泛，部分被用于民間醫(yī)藥。在對巴豆屬植物的化學(xué)成分及藥理活性的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有良好的抗癌、抗菌、抗炎等生理活性，成為突破各種嚴(yán)重的疾病的重要藥材來源，并在臨床療效中取得理想的效果。這些良好的生理活性與其二萜類、黃酮類、生物堿類等化學(xué)成分密切相關(guān)。根據(jù)報(bào)道的文獻(xiàn)對二萜類化合物的研究頗多，并在國外的報(bào)道中，巴豆烷型二萜在抗腫瘤方面的研究取得了可觀的成果，部分巴豆烷型二萜臨床療效較為可觀，發(fā)現(xiàn)了臨床療效信號。在國內(nèi)對巴豆烷型二萜類化合物的抗菌活性測試實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了部分化合物表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。但到現(xiàn)在為止僅有三篇關(guān)于大麻葉巴豆的化學(xué)成分研究以及生物活性分析報(bào)道的文章，并且主要針對抗癌活性的研究，對其抗菌活性的研究較少。因此我們對大麻葉巴豆的化學(xué)成分進(jìn)行提取分析研究有助于深入探究大麻葉巴豆中豐富且新穎的成分，尤其是活性較好的巴豆烷型二萜類成分，對其抗菌等生物活性有更全面的認(rèn)識。有望在研究過程中發(fā)現(xiàn)生物活性更好且療效更高的新二萜類化合物。本次研究采用正相(反相)硅膠色譜法、凝膠法、高效液相色譜儀分離等方法對大麻葉巴豆的乙酸乙酯層萃取物進(jìn)行了分離提純，并對分離提純后的化合物進(jìn)行波普數(shù)據(jù)分析，結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定，最后對分離得到的單體化合物采用瓊脂稀釋法進(jìn)行抗菌活性評價(jià)。本次研究豐富了本屬植物的抗菌活性研究內(nèi)容，為以后繼續(xù)研究該屬植物的生物活性提供了重要依據(jù)。2材料與方法2.1材料、試劑、用具、儀器及供試病原菌2.1.1植物材料2020年4月份在云南省勐?？h采集的大麻葉巴豆，經(jīng)過林學(xué)院杜凡教授鑒定為大麻葉巴豆(CrotondamayeshuY.T.Chang)，歸屬大戟科巴豆屬，將其陰干、粉碎后得到粉末樣品11㎏。2.1.2實(shí)驗(yàn)材料表1.1實(shí)驗(yàn)材料序號材料名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家1薄層層析硅膠柱GF254青島海洋化工廠2反相材料C1840-63德國Merck3SephadexLH-2040-70μmAmershamPharmaciaBiotech4MCI-gelCHP2070-150μm日本三菱公司5柱層析硅膠80-100目、200-300目青島海洋化工廠2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑表1.2實(shí)驗(yàn)試劑序號試劑名稱純度生產(chǎn)廠家1甲醇工業(yè)級云南利研科技有限公司色譜純上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?石油醚分析純云南利研科技有限公司3二氯甲烷分析純云南利研科技有限公司4乙酸乙酯分析純云南利研科技有限公司5丙酮分析純開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司云南楊林工業(yè)6氯仿分析純開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司云南楊林工業(yè)7濃硫酸98%開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司云南楊林工業(yè)8純凈水-娃哈哈2.1.4實(shí)驗(yàn)用具表1.3實(shí)驗(yàn)用具序號用具名稱規(guī)格1圓底燒瓶250mL、500mL、1000mL、2000mL2移液槍20-200μL、100-1000μL、1-5mL3量筒2000mL、100mL、10mL4燒杯1000mL、500mL、250mL、50mL5錐形瓶50mL、250mL、500mL、1000mL6注射器5mL7玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管0.3×100mm8移液管200mL2.1.5實(shí)驗(yàn)儀器表1.4實(shí)驗(yàn)儀器序號儀器設(shè)備型號生產(chǎn)廠家1臺式超聲波清洗器KQ-500DE天津恒奧科技發(fā)展有限公司2電子天平BT244S北京賽多利斯有限公司3循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司4高效液相色譜儀1260安捷倫5EYELA油浴鍋OSB-2200上海愛朗儀器有限公司6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-300上海愛朗儀器有限公司7紫外分析儀R-3步琪8雙檔恒溫?zé)犸L(fēng)槍KMS-520德國科麥斯有限公司2.1.6供試病原菌供試病原細(xì)菌：番茄青枯病菌(Ralstoniasolanaceance)供試病原真菌：大豆炭疽病菌(Colletotrichumglycines)

2.2大麻葉巴豆化學(xué)成分研究步驟2.2.1樣品準(zhǔn)備將鑒定好的大麻葉巴豆全株陰干、粉碎，得到大麻葉巴豆粉末樣品11㎏。2.2.2浸膏制備在常溫下，用30L95%乙醇對大麻葉巴豆粉末樣品進(jìn)行連續(xù)3次浸提，每次浸提時(shí)間為72h，浸提液在經(jīng)過濾、減壓濃縮后得到大麻葉巴豆浸膏865g。2.2.3乙酸乙酯層萃取物的制備將浸膏和3L水分別加入分液漏斗中，再連續(xù)3次加入石油醚溶液進(jìn)行萃取(每次加石油醚量均為6.2L)，收集萃取液；再向分液漏斗中連續(xù)3次加入乙酸乙酯溶液(每次加乙酸乙酯的量均為6.2L)，收集合并萃取液，進(jìn)行減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至貼好標(biāo)簽及已稱重的錐形瓶中，待干燥后進(jìn)行稱重，最終得到乙酸乙酯層萃取物138.8g。標(biāo)好標(biāo)簽后置入冰箱，備用。2.2.4大麻葉巴豆的乙酸乙酯層正相硅膠柱層析拌樣。用溶劑(乙酸乙酯：甲醇=3:1)溶解乙酸乙酯層萃取物，邊溶解邊轉(zhuǎn)移至干凈、干燥的燒杯中(共用130ml溶劑)，待樣品完全溶解后加入適量80-100拌樣硅膠(一般情況拌樣硅膠質(zhì)量/樣品質(zhì)量不超過1：1)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁蛊涑浞只旌?，并將拌好樣后的樣品轉(zhuǎn)移并平鋪至干凈干燥的托盤中，放置陰涼、通風(fēng)處晾干。將完全干燥后的樣品研磨呈細(xì)粉備用。裝柱。根據(jù)乙酸乙酯層萃取物的質(zhì)量選擇合適的柱子類型及尺寸大小(一般情況下硅膠層的厚度至少是樣品層厚度的3倍高度)并保證柱子干凈、無損壞，然后將色譜柱固定在鐵支架上的合適位置(要求：色譜柱與地面垂直病在夾具與色譜柱的接觸位置加塞棉花以增大摩擦力，防止柱子掉落)，并在色譜柱的下端接口放置一個(gè)三角瓶，關(guān)閉柱塞，往柱子內(nèi)加入乙酸乙酯試劑，觀察柱子是否漏液，若漏液則更換新的色譜柱重復(fù)上述操作，若無漏液繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。稱取合適質(zhì)量的100-200目裝柱硅膠(一般稱上樣量的30-70倍，如極難分，也可用100倍以上的硅膠)置于500ml燒杯中，加入適量的乙酸乙酯，邊加邊攪拌，使其充分混勻，進(jìn)行超聲振蕩，排除氣泡。將處理好的硅膠填料緩慢均勻的裝入柱子中，避免出現(xiàn)氣泡和斷層，在裝填過程可輕輕敲擊柱子，幫助填料裝填密實(shí)，標(biāo)注硅膠柱床上表面位置便于檢查是否沉降完成，打開柱塞，用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，控制合適流速，并隨時(shí)注意是否有硅膠漏出，若有則更換色譜柱重復(fù)上述操作，若無漏出，則關(guān)閉柱塞，沉降一段時(shí)間后，檢查柱床是否平整，待平整后將有機(jī)溶劑下降至柱床上表面的2-3cm處，關(guān)閉柱塞，裝柱完成。上樣。本實(shí)驗(yàn)采用干法上樣。將專用的上樣漏斗放置于色譜柱的上頂端，將已精細(xì)研磨的樣品緩慢的速度加入至已檢查好的色譜柱內(nèi)(旋轉(zhuǎn)加入，避免樣品在同一位置堆積，應(yīng)使樣品平鋪于柱床上)，在此過程中注意洗耳球輕敲柱子，及時(shí)排除氣泡，避免氣泡進(jìn)入色譜柱。上樣完成后，用膠頭滴管沿色譜柱壁緩慢加入洗脫劑，將附著于柱壁上的樣品沖入色譜柱內(nèi)(注意保持樣品的平整性)，打開硅膠柱柱塞，使洗脫劑下流至樣品層的上表面，關(guān)閉柱塞，沿壁緩慢加入少量的洗脫劑，再放出溶液，重復(fù)上述過程，至洗脫劑在色譜柱內(nèi)的上清液澄清。安裝加液球，加入適量的第一個(gè)梯度洗脫劑進(jìn)行洗脫過程操作。梯度洗脫。在進(jìn)行洗脫過程中，用按順序編號的250ml三角瓶進(jìn)行接樣，每次接樣量為200ml，并將接好的溶液分別進(jìn)行減壓濃縮并轉(zhuǎn)入對于應(yīng)編號的10ml小瓶子中，依次置于樣品收納架，備用。洗脫梯度為：純二氯甲烷(2600mL)，二氯甲烷：甲醇20:1(7350mL)、14:1(6000mL)、9:1(5042mL)、6:1(5600mL)、3:1(4538mL),純甲醇(3000mL)。薄層層析檢測。在進(jìn)行梯度洗脫過程中及時(shí)對減壓濃縮后的樣品進(jìn)行薄層層析檢測，便于及時(shí)掌握梯度洗脫情況和準(zhǔn)確更換洗脫梯度體系和能夠?qū)酉聛淼奶幚碜龀鐾茢?。在進(jìn)行TLC板(薄層層析板)點(diǎn)樣過程首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，找到合適的點(diǎn)樣濃度和展開劑的極性，使樣品中主要化合物的點(diǎn)的Rf值(溶質(zhì)斑點(diǎn)在波層板上的移動距離與溶劑前沿移動距離的比值)控制在0.3-0.7之間；再進(jìn)行全面點(diǎn)樣，經(jīng)過展開后的TLC板在紫外分析儀254nm波長下觀察，并用鉛筆進(jìn)行標(biāo)記；然后浸泡濃硫酸乙醇溶液，再用熱風(fēng)槍烘干顯色并用透明膠帶粘貼并及時(shí)拍照，最后將TLC板進(jìn)行分類保存并標(biāo)注好標(biāo)簽。餾分合并。通過觀察TLC板上的點(diǎn)的顯色狀況和Rf值的比對，對樣品進(jìn)行分段合并，最后得到9個(gè)餾分，對其進(jìn)行編號Fr.1-Fr.9。對Fr.4餾分進(jìn)一步分離。

2.2.5大麻葉巴豆組分Fr.4的MCI脫色用小孔樹脂MCI對溶解后的樣品Fr.4進(jìn)行拌樣后，陰干，研磨成細(xì)粉備用。采用干法上樣的方法上樣，通過90%甲醇-水洗脫，將洗脫液收集起來，再使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮處理，最終得到脫色后的樣品。樣品Fr.4的質(zhì)量：21.6g；拌樣MCI質(zhì)量:9.6g；洗脫劑：90%甲醇-水(3500mL);脫色后的樣品質(zhì)量：14.3g。2.2.6大麻葉巴豆組分Fr.4的反相柱層析分離將脫色后的樣品進(jìn)行溶解后用C18硅膠(10.6g)進(jìn)行拌樣，充分?jǐn)嚢杌旌?，陰?研磨成細(xì)粉，放置備用；根據(jù)脫色后Fr.4樣品的質(zhì)量選擇尺寸為43mm×420mm的C18硅膠柱進(jìn)行裝柱并用干法上樣，用甲醇-水體系洗脫[洗脫梯度:45%(2200mL)、50%(2300mL)、55%(2200mL)、60%(2000mL)、70%(1500mL)、80%(1000mL)、90%(800mL)]。用按續(xù)編號的100mL三角瓶進(jìn)行接樣，每次接樣100mL，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和恒溫水浴鍋進(jìn)行減壓濃縮，并轉(zhuǎn)移至對應(yīng)編號的小瓶子中。由于洗脫劑中含有極性較大的水分，流速較慢，可通過適當(dāng)?shù)募訅簛砜刂坪线m的流速。Fr.4樣品通過反相柱層析分離后共得到17個(gè)餾分，編號為：Fr.4.1-Fr.4.17；對編號為Fr.4.15的餾分進(jìn)行進(jìn)一步分離。2.2.7大麻葉巴豆組分Fr.4.15組分的正相柱層析分離樣品Fr.4.15經(jīng)陰干后質(zhì)量為495.3mg,經(jīng)有機(jī)溶劑溶解后用60-100目的拌樣硅膠(400mg)進(jìn)行拌樣，陰干，研磨成細(xì)粉備用；根據(jù)樣品的質(zhì)量選擇尺寸為20mm×320mm的柱子，用20.4g裝柱硅膠(200-300目)進(jìn)行裝裝柱。用二氯甲烷：甲醇體系[49:1(520mL、40:1(600mL)、純甲醇(200mL)]進(jìn)行梯度洗脫。樣品Fr.4.15經(jīng)過正相柱層析后共得到7個(gè)餾分，編號為Fr.4.15.1-Fr.4.15.7,將其中編號為Fr.4.15.3組分進(jìn)一步進(jìn)行高效液相色譜法分離。2.2.8大麻葉巴豆Fr.4.15.3組分高效液相色譜法分離半制備型高效液相色譜儀：Aglient1260。高效液相色譜儀具有高靈敏度的特點(diǎn)，能夠檢測到微量成分。所以對流動相的處理較為嚴(yán)格，在進(jìn)液相之前應(yīng)對純凈水(娃哈哈)用真空泵進(jìn)行過濾除雜；并將過濾好的純凈水和色譜甲醇進(jìn)行30mim超聲震蕩。用色譜甲醇和丙酮的混合試劑溶解樣品，使用帶有濾網(wǎng)的注射器(過濾不溶解的物質(zhì))將樣品注入安捷倫液體進(jìn)樣瓶中。根據(jù)反相色譜柱層析記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行多次進(jìn)樣量的測試后，最終采用67%甲醇-水進(jìn)行組分的分離，每一針的進(jìn)樣量為35μL,在收集過程中，對比前面少量多次的測試圖片和樣本峰位進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，保證接樣的準(zhǔn)確性和反復(fù)性。經(jīng)過高效液相色譜洗脫收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到兩個(gè)單體化合物(化合物1、化合物2)?；衔?：保留時(shí)間為34.352min、質(zhì)量為3.7mg;化合物2：保留時(shí)間為41.181min、質(zhì)量為17.3mg。

2.3大麻葉巴豆化學(xué)成分抗菌活性的研究2.3.1實(shí)驗(yàn)原理為了探究化合物1和化合物2的抗菌活性，本次實(shí)驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，在瓊脂培養(yǎng)基中通過加入不同劑量的化合物創(chuàng)造出不同濃度的抗菌藥物菌株，在一定的溫度、濕度的條件下把提前準(zhǔn)備好的細(xì)菌菌懸液和真菌菌懸液點(diǎn)種到瓊脂培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。通過計(jì)算MIC(最低抑菌濃度)測定化合物的抗菌活性。2.3.2實(shí)驗(yàn)步驟首先將化合物1、2溶解在陰性對照DMSO里，然后將它們各自稀釋到以下濃度：32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL,接著分別接種番茄青枯病菌和大豆炭疽病菌這兩種病菌，之后，把接種好后的M-H瓊脂培養(yǎng)基放在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)24h,檢測抑菌效果，并且找出抑制微生物生長的最小的抑菌濃度(MIC)值。以大麻葉巴豆分離出來的化合物1和化合物2所選菌種生長率下降至其原始生長速率的80%時(shí)，該濃度作為判斷的界限，并依照參考文獻(xiàn)抗菌實(shí)驗(yàn)方法[59]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4實(shí)驗(yàn)流程大麻葉巴豆植株大麻葉巴豆植株(11kg)陰干、粉碎大麻葉巴豆粉末95%乙醇浸提、減壓濃縮大麻葉巴豆浸膏(865g)乙酸乙酯乙酸乙酯層萃取物(138.8g)水正相硅膠柱層析二氯甲烷：甲醇(20:1-0:1)Fr.1-Fr.9(共9個(gè)餾分)水層萃取物石油醚層萃取物石油醚Fr.4(21.6g)MCI脫色(90%甲醇-水)Fr.4(14.3g)反相硅膠柱層析甲醇-水(45%-90%)Fr.4.15(495.3㎎)正相硅膠柱層析[二氯甲烷：甲醇(49:1-0:1]Fr.4.15.3(119.6㎎)HPLC67%甲醇-水洗脫波長：210nm化合物1(3.7mg)保留時(shí)間：34.352min化合物2(17.3mg)保留時(shí)間：41.18min抗菌活性實(shí)驗(yàn)抗菌活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1大麻葉巴豆化學(xué)成分本實(shí)驗(yàn)采用正相(反相)硅膠柱色譜法、凝膠法等方法對大麻葉巴豆全株的乙酸乙酯層萃取物進(jìn)行分離提純，從該植物中首次分離得到兩個(gè)巴豆烷型單體化合物，結(jié)果如下：化合物1：易溶于氯仿的淡黃色固體，重量為3.7mg，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)和相關(guān)參考文獻(xiàn)[60]確定該化合物為：crotignoidA。其分子式:C30H42O10；分子量:562；化合物結(jié)構(gòu)類型：巴豆烷型二萜?；衔?的結(jié)構(gòu)如圖1、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)見表1.5?；衔?：易溶于氯仿的淡黃色固體，重量為17.3mg，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)和相關(guān)參考文獻(xiàn)[61]確定該化合物為：12-O-Tiglylphorbol-13-(2-methyl)butyrate。其分子式：分子式:C30H42O8；分子量:530；化合物結(jié)構(gòu)類型：巴豆烷型二萜?；衔?的結(jié)構(gòu)如圖2、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)見表1.6。圖1化合物1的結(jié)構(gòu)式及編號圖2化合物2的結(jié)構(gòu)式及編號表1.5化合物11H-NMR、13C-NMR的數(shù)據(jù)表(13C(120MHz)and1H(500MHz),CDCl3)Positionδc,typeδH(JinHz)1160.7CH7.63,s,1H2134.2C-3206.7C-472.7C-5134.2CH6.37,s,1H6150.9C-783.3CH4.76,t,1H846.1CH2.86,dd,1H975.2C-1057.5CH2.97,s,1H1145.0CH2.19,s,1H1277.0CH5.51,s,1H1365.9C-1432.0CH1.63,m,1H1526.3C-1617.0CH31.27,s,3H1724.0CH31.27,s,3H1814.9CH30.92,s,3H1910.5CH31.78,s,3H2066.6CH24.43-α,4.22-β,d,2H1’167.9C-2’128.8C-3’137.7CH6.81,m,1H4’12.5CH31.81,s,3H5’14.7CH31.81,s,3H1’’179.7C-2’’41.5CH2.38,m,1H3’’26.3CH21.45,dd,2H4’’16.4CH31.13,d,3H5’’11.8CH30.92,m,3H9-OH-6.14,s,1H表1.6化合物2的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)表(13C(120MHz)and1H(500MHz),CDCl3)Positionδc,typeδH(JinHz)1161.2CH7.57,s,1H2133.0C-3209.4C-473.9C-538.8CH22.48-α,2.58β,s,2H6140.6C-7128.7CH5.69,m,1H839.2CH3.26,m,1H978.5C-1056.3CH3.22,s,1H1143.6CH2.16,m,1H1277.4CH5.45,s,1H1365.5C-1436.8CH1.02,d,1H1526.3C-1624.0CH31.26,s,3H1717.2CH31.26,s,3H1814.6CH30.92,d,3H1910.3CH31.76,s,3H2068.3CH24.01-a,4.04-b,s,2H1’167.8C-2’129.5C-3’137.6CH6.81,m,1H4’14.6CH31.80,m,3H5’12.5CH31.80,m,3H1’’179.4C-2’’41.5CH2.36,m,1H3’’26.3CH21.44-α,1.72-β,m,2H4’’11.8CH30.92,d,3H5’’16.4CH31.11,d,3H9-OH-5.85,s,1H3.2化合物抗菌活性測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析化合物1、2的抗菌活性數(shù)據(jù)如下：表1.7化合物1、2的抗菌活性結(jié)果數(shù)據(jù)MIC(μg/mL)抗病源細(xì)菌抗病源真菌化合物/病原菌番茄青枯病菌大豆炭疽病菌化合物19.9212.85化合物215.7416.89從上表數(shù)據(jù)分析可知，化合物1和化合物2對番茄青枯病菌和大豆炭疽病菌均有明顯的抑制作用，化合物1對兩種病菌的MIC(最小抑菌濃度)值為：番茄青枯病菌9.92μg/mL，大豆炭疽病菌12.85μg/mL；化合物2對兩種病菌的MIC值為：番茄青枯病菌15.74,μg/mL，大豆炭疽病菌16.89μg/mL。結(jié)果表明：根據(jù)抗菌活性結(jié)果數(shù)據(jù)得知：化合物1和化合物2對番茄青枯病菌和大豆炭疽病菌均有抑制作用，且化合物1對兩種病菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于化合物2。通過數(shù)據(jù)比較分析可知：化合物1可作為抗番茄青枯病和大豆炭疽病菌的藥物繼續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)更好的抑菌劑，在農(nóng)業(yè)病害防治過程中發(fā)揮更為重要的作用。

4.結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)采用正相(反相)硅膠柱色譜法、凝膠法等方法對大麻葉巴豆全株的乙酸乙酯層萃取物進(jìn)行分離提純，從該植物中分離得到兩個(gè)巴豆烷型單體化合物，并對分離得到的化合物進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)分析，再結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的鑒定，最終得到的化學(xué)信息如下：化合物1：crotignoidA，易溶于氯仿的淡黃色固體，重量為3.7mg，分子式:C30H42O10，分子量:562；化合物2：12-O-Tiglylphorbol-13-(2-methyl)butyrate，易溶于氯仿的淡黃色固體，重量為17.3mg，分子式:C30H42O8，分子量:530。這兩個(gè)化合物經(jīng)由瓊脂稀釋法進(jìn)來行抗菌活性評估，結(jié)果顯示：化合物1和化合物2對番茄青枯病菌和大豆炭疽病菌均有抑制作用，且化合物1對兩種病菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于化合物2。

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