2025年大學(xué)《分子科學(xué)與工程》專業(yè)題庫——膜蛋白分子生物學(xué)的新探索考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡答題（每題5分，共25分）1.簡述I型、II型、III型膜蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其區(qū)別。2.簡述在原核細(xì)胞中表達(dá)異源膜蛋白時，常用的融合標(biāo)簽有哪些及其作用。3.簡述冷凍電鏡（Cryo-EM）技術(shù)相比傳統(tǒng)X射線晶體學(xué)在解析膜蛋白結(jié)構(gòu)方面的主要優(yōu)勢。4.簡述膜蛋白功能研究中，突變分析（如定點(diǎn)突變）的基本原理及其應(yīng)用目的。5.簡述膜蛋白參與的一種重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，并說明膜蛋白在其中扮演的角色。二、論述題（每題10分，共30分）6.論述近年來單顆粒冷凍電鏡技術(shù)如何推動了難表達(dá)、不穩(wěn)定膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展。7.論述開發(fā)新型膜蛋白純化方法所面臨的挑戰(zhàn)，并舉例說明一種創(chuàng)新性的純化策略及其原理。8.論述膜蛋白作為藥物靶點(diǎn)的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)，并舉例說明一種針對膜蛋白的藥物研發(fā)策略。三、分析題（15分）9.某研究團(tuán)隊(duì)旨在探究一種新型電壓門控鉀離子通道（Kv通道）的激活機(jī)制。他們通過基因工程手段表達(dá)了該通道的重組蛋白，并利用電生理技術(shù)記錄了其在不同電壓條件下的離子電流。隨后，他們對該通道進(jìn)行了部分氨基酸序列的置換突變，并分析了突變蛋白的功能變化。請分析該研究可能采用了哪些關(guān)鍵技術(shù)步驟，并闡述如何通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷通道的激活機(jī)制。試卷答案一、簡答題（每題5分，共25分）1.答案：I型膜蛋白通常具有一個跨膜螺旋，N端在胞外，C端在胞內(nèi)，可部分或完全嵌入脂雙層。II型膜蛋白通常具有一個或兩個跨膜螺旋，N端在胞內(nèi)，C端可能暴露在胞外或嵌入脂雙層，常與脂質(zhì)錨定。III型膜蛋白由多個跨膜螺旋組成，部分錨定在膜中，部分伸出胞外或胞內(nèi)。區(qū)別主要在于跨膜單元的數(shù)量、N/C端的定位以及與脂雙層的結(jié)合方式。解析思路：考察對膜蛋白基本分類的掌握。需要區(qū)分不同類型膜蛋白典型的跨膜結(jié)構(gòu)、N/C端位置以及脂質(zhì)錨定的差異。I型最簡單，一個螺旋，N端外C端內(nèi)或嵌入。II型常見于胞質(zhì)膜，N端內(nèi)，C端可外露或嵌入。III型多見于細(xì)胞器膜，伸出很長。2.答案：常用的融合標(biāo)簽有：①辛硫糖昔蛋白（GST）標(biāo)簽：易于純化，有酶活性但可能影響蛋白功能；②谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽：同上，應(yīng)用廣泛；③六氫苯并噻唑（His）標(biāo)簽：無酶活性，通過金屬離子親和層析純化，不影響蛋白功能；④蛋白A/G標(biāo)簽：結(jié)合免疫球蛋白Fc片段，用于免疫親和純化；⑤親水膠體蛋白標(biāo)簽（如MBP）：分子量大，可增加蛋白水溶性，通過親和層析純化。作用是便于膜蛋白的體外表達(dá)、純化和檢測。解析思路：考察膜蛋白表達(dá)常用標(biāo)簽及其功能。需要知道幾種主流標(biāo)簽的名稱、是否帶酶活性、純化原理（親和層析、免疫親和）以及它們對膜蛋白表達(dá)的影響（如增加溶解度）。3.答案：主要優(yōu)勢在于：①無需結(jié)晶：適用于難以結(jié)晶或易變性的膜蛋白；②高分辨率結(jié)構(gòu)：單顆粒Cryo-EM技術(shù)已能解析近原子分辨率的結(jié)構(gòu)；③研究生物大分子復(fù)合物：能解析包含膜蛋白及其配體、通道開放/關(guān)閉不同構(gòu)象狀態(tài)的復(fù)合物；④樣本制備相對簡單：避免了復(fù)雜的結(jié)晶過程。解析思路：考察Cryo-EM技術(shù)的核心優(yōu)勢，特別是對比傳統(tǒng)晶體學(xué)在處理膜蛋白這類“難搞”樣品時的優(yōu)越性。要點(diǎn)包括無需結(jié)晶、高分辨率、能研究復(fù)合物和動態(tài)狀態(tài)、樣本制備相對簡單。4.答案：基本原理是通過將編碼膜蛋白的基因引入宿主細(xì)胞，引入特定密碼子或氨基酸替換，構(gòu)建突變體庫，然后篩選或鑒定表達(dá)特定表型（如功能改變、酶活性變化）的突變體，從而確定關(guān)鍵氨基酸殘基的功能或結(jié)構(gòu)作用。應(yīng)用目的是定位膜蛋白功能位點(diǎn)（活性位點(diǎn)、調(diào)控位點(diǎn)、與其他蛋白相互作用位點(diǎn)）、揭示結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、研究蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性。解析思路：考察突變分析的基本邏輯。需要理解通過改變氨基酸序列（定點(diǎn)突變）來研究功能，核心是“基因改造-表達(dá)-篩選/分析表型-推斷功能/結(jié)構(gòu)位點(diǎn)”的流程。強(qiáng)調(diào)其揭示結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、定位關(guān)鍵位點(diǎn)的應(yīng)用。5.答案：以G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）信號通路為例：GPCR作為膜蛋白，位于細(xì)胞膜上，其胞外部分感知信號分子（如激素、神經(jīng)遞質(zhì)）結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化，激活下游的G蛋白。G蛋白再激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），產(chǎn)生第二信使cAMP，cAMP進(jìn)一步激活蛋白激酶A（PKA），導(dǎo)致下游效應(yīng)蛋白磷酸化，最終引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答。膜蛋白在此通路中扮演信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵樞紐角色。解析思路：考察對膜蛋白在信號傳導(dǎo)中作用的理解。選擇一個經(jīng)典的通路（如GPCR通路）進(jìn)行闡述，關(guān)鍵在于清晰描述膜蛋白（GPCR）如何接收信號、如何傳遞信息到下游，并明確其在通路中的核心地位。二、論述題（每題10分，共30分）6.答案：單顆粒冷凍電鏡技術(shù)通過收集大量隨機(jī)取向的膜蛋白冷凍樣品顆粒，無需結(jié)晶，克服了膜蛋白難以結(jié)晶的難題。其高分辨率能力（可達(dá)近原子級）使得解析原本難以獲得的高精度結(jié)構(gòu)成為可能。結(jié)合計(jì)算機(jī)算法（如機(jī)器學(xué)習(xí)、AI）進(jìn)行分類和重構(gòu)，可以解析不同狀態(tài)（如開放/關(guān)閉構(gòu)象）的結(jié)構(gòu)，極大地推動了我們對膜蛋白功能機(jī)制的理解，尤其是在離子通道、受體等關(guān)鍵蛋白的研究上取得了革命性進(jìn)展。解析思路：論述題需要更全面和深入。首先點(diǎn)明單顆粒Cryo-EM的核心優(yōu)勢（無需結(jié)晶、適用于不規(guī)則/動態(tài)蛋白）。然后闡述其如何實(shí)現(xiàn)高分辨率，并強(qiáng)調(diào)結(jié)合計(jì)算方法的重要性。最后，要指出其對膜蛋白研究（特別是功能機(jī)制）帶來的具體貢獻(xiàn)和意義。7.答案：開發(fā)新型膜蛋白純化方法面臨的挑戰(zhàn)主要包括：①蛋白表達(dá)量低；②溶解性差、易聚集或變性；③與膜成分（脂質(zhì)、其他蛋白）緊密結(jié)合；④存在多個可利用的表位有限；⑤純化過程可能影響蛋白功能。創(chuàng)新性的純化策略示例：親和純化策略，利用工程改造的宿主細(xì)胞（如display技術(shù)）或化學(xué)方法在膜蛋白上引入特異性識別元件（如特定抗體結(jié)合域、金屬離子結(jié)合域或適配體），使蛋白在細(xì)胞內(nèi)或裂解物中即被特異性捕獲，簡化了后續(xù)純化步驟，同時可能減少對蛋白的變性和功能影響。解析思路：論述題需要分析問題并提出解決方案。先準(zhǔn)確列出純化膜蛋白的主要難點(diǎn)。然后，針對這些難點(diǎn)，提出一種或多種創(chuàng)新策略（如親和純化、Display技術(shù)、基于特定相互作用的純化等），并簡述其原理和優(yōu)勢。關(guān)鍵是理解挑戰(zhàn)所在，并能提出有針對性的解決方案。8.答案：膜蛋白作為藥物靶點(diǎn)的優(yōu)勢在于：①位于細(xì)胞表面，易于接觸和接近，藥物分子可直接作用于其功能位點(diǎn)；②參與多種生理病理過程，是許多疾?。ㄈ绺哐獕?、心律失常、癌癥、感染性疾?。┑陌悬c(diǎn)；③具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，為設(shè)計(jì)特異性藥物提供了基礎(chǔ)。挑戰(zhàn)在于：①結(jié)構(gòu)異質(zhì)性大，導(dǎo)致藥物作用位點(diǎn)不明確；②通常位于細(xì)胞膜，藥物穿膜通透性差；③易受膜環(huán)境（脂質(zhì)、pH、溫度）影響，導(dǎo)致藥物靶向性和穩(wěn)定性問題；④膜蛋白構(gòu)象動態(tài)變化，可能影響藥物結(jié)合口袋的可及性。針對這些挑戰(zhàn)，一種藥物研發(fā)策略是：基于高分辨膜蛋白結(jié)構(gòu)（如通過Cryo-EM獲得），利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（如分子對接）篩選候選藥物分子，并通過虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化藥物與靶點(diǎn)相互作用，設(shè)計(jì)出高親和力、高選擇性且能穿過細(xì)胞膜的先導(dǎo)化合物。解析思路：論述題需要辯證地分析利弊并提出具體方法。先充分論述膜蛋白作為靶點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)（易接近、功能關(guān)鍵）。再深入分析其作為靶點(diǎn)的難點(diǎn)（結(jié)構(gòu)、通透性、環(huán)境依賴性、動態(tài)性）。最后，針對這些難點(diǎn)，提出一個系統(tǒng)的藥物研發(fā)策略，結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)手段（結(jié)構(gòu)解析、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)），體現(xiàn)策略的針對性和科學(xué)性。三、分析題（15分）9.答案：該研究可能采用的關(guān)鍵技術(shù)步驟包括：①重組表達(dá)：構(gòu)建目標(biāo)Kv通道的cDNA表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞（如昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞）中表達(dá)重組通道蛋白。②電生理記錄：利用全細(xì)胞或細(xì)胞貼附式電壓鉗技術(shù)，記錄膜片上重組Kv通道的電流，在不同電壓下刺激，測量電流幅度、激活/失活時間常數(shù)等。③定點(diǎn)突變：對Kv通道的關(guān)鍵區(qū)域（如S4螺旋、跨膜環(huán)區(qū)、調(diào)控環(huán)區(qū)）進(jìn)行定點(diǎn)氨基酸替換（如保守替換、疏水/親水替換、引入突變）。④功能分析：對表達(dá)突變體的細(xì)胞進(jìn)行電生理記錄，比較野生型與突變體在相同電壓下的電流大小、電壓依賴性、激活/失活特性等變化。⑤結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系推斷：根據(jù)突變對功能的具體影響（如電流幅度變化、電壓門控特性改變），推斷被替換氨基酸殘基在通道結(jié)構(gòu)中的位置、是否參與電荷跨膜、是否為關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)、對通道開放/關(guān)閉構(gòu)象的影響等，從而解析通道的激活機(jī)制。