測酶活方法建立酶是生物體維持各種生命活動的重要物質(zhì)，它是生物體內(nèi)各種代謝反應(yīng)的催化劑，在所有生物體的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。酶能夠在十分溫和的條件下，快速高效率地催化各種生化反應(yīng)，維持機體的正常生命活動。生物體中存在許多種的酶，每一種酶都有它特異的作用對象，即具有專一性，這是由于各種酶的反應(yīng)條件及作用機理都不相同?！?/p>

建立背景01該如何對某種酶活力的測定進行具體細節(jié)的設(shè)計與分析呢？02除去反應(yīng)條件的控制外，具體材料的選擇及具體操作步驟的設(shè)計上是否要遵循同一準則呢？03在進行同一種酶在不同的材料中、不同發(fā)育時期的活力測定時，測定方法是否可以生搬硬套呢？04如果不是，又該如何把握具體細節(jié)的設(shè)計與修正呢？05這些具體細節(jié)的把握又是以何為依據(jù)的呢？提出問題測定對象

淀粉酶了解及準備淀粉酶性質(zhì)最適反應(yīng)條件作用機理分類（α-淀粉酶、β-淀粉酶等）α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下易發(fā)生鈍化β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化1.首先從理論上對兩種淀粉酶的性質(zhì)及催化原理進行了解、對比，找到兩種酶催化的最適條件，并通過對兩種酶性質(zhì)的探討，明確如何在兩種酶同時存在的前提下只測定其中一種酶活力的控制方法，以及如何通過實驗測定結(jié)果反映出酶催化活力的大小。催化機理產(chǎn)物鈍化條件α-淀粉酶內(nèi)切酶，可以水解淀粉內(nèi)部任何部位的α-1,4-糖苷鍵α-極限糊精、麥芽糖、葡萄糖pH3.6以下β-淀粉酶外切酶，從淀粉的非還原末端依次水解一個個麥芽二糖，但不能越過已經(jīng)存在的α-1,6-糖苷鍵繼續(xù)切割β-極限糊精、麥芽糖高溫（70℃下維持15min）1.吸收波長2.底物濃度3.pH4.線性反應(yīng)時間與線性范圍最適條件的確定1.吸收波長的確定在紫外分光光度計上掃描顯色液,得吸收光譜，選擇最適波長。2.底物濃度的確定在最適波長下，固定其他條件，每次只改變底物濃度，隔15s讀一次吸光度值，繪制底物濃度與酶反應(yīng)速率曲線。再繪制Linewear-Burk圖。根據(jù)數(shù)據(jù)得回歸方程為Y=kx+b,得出底物的酶的Km值。據(jù)此,選用最適底物濃度。3.pH的確定酶對底物的催化作用主要取決于酶的活性中心及必需基團的解離狀態(tài)，因此緩沖液的pH對于酶促反應(yīng)有很大影響。用pH為4.6、5.0、5.4、5.8、6.2的檸檬酸緩沖液配制基質(zhì)液,最適波長下測定酶活性,結(jié)果作圖。根據(jù)圖表得最適pH。4.線性反應(yīng)時間與線性范圍的確定取樣本，在半自動生化分析儀上測定，得反應(yīng)時間曲線，作圖。取樣本經(jīng)超聲粉碎機處理后,將勻漿液離心取上清，進行1.5、2、4、8、16倍稀釋，分別測酶活力,結(jié)果作圖。由圖可知，線性反應(yīng)時間與線性范圍。2.在明確α-淀粉酶與β-淀粉酶特性的基礎(chǔ)上，選擇β-淀粉酶進行鈍化，測定α-淀粉酶的活力及兩種酶總的催化活力。3.設(shè)計具體的實驗操作方案，通過比色法對共同產(chǎn)物（麥芽糖）含量的測定衡量酶催化活力的大小。

4.記錄實驗數(shù)據(jù)，計算分析兩種淀粉酶的活力。具體實驗設(shè)計所需的主要材料、試劑、儀器實驗材料萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右）實驗儀器電子天平、722-光柵分光光度計、恒溫水浴箱、離心機實驗試劑1%淀粉溶液3,5-二硝基水楊酸溶液0.4MNaOH溶液麥芽糖標準液（1mg/ml）pH5.6的檸檬酸緩沖液（A液、B液）操作步驟1.酶液的制備少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液研磨成勻漿少量多次用蒸餾水轉(zhuǎn)至50ml容量瓶約至40ml顛倒浸提15～20min定容3500r/min離心20min取上清液（即初始酶液）α-淀粉酶活性的測定管號對照管測定管1212酶提取液（ml）各1ml，70℃恒溫水浴15min，取出后立即冰浴冷卻（使β-淀粉酶鈍化）pH5.6檸檬酸緩沖液（ml）各1ml，40℃恒溫水浴15min（保持環(huán)境溫度為酶的最適反應(yīng)溫度）0.4MNaOH（ml）各4ml（使對照中酶失活）40℃預(yù)熱淀粉溶液（ml）各2ml，搖勻，40℃恒溫水浴5min0.4MNaOH（ml）各4ml，搖勻（使酶失活，終止反應(yīng)）α-及β-淀粉酶總活性的測定管號

對照管測定管3434稀釋后的酶提取液（ml）各1mlpH5.6檸檬酸緩沖液（ml）各1ml，40℃恒溫水浴15min（保持環(huán)境溫度為酶的最適反應(yīng)溫度）0.4MNaOH（ml）各4ml（使對照中酶失活）

40℃預(yù)熱淀粉溶液（ml）各2ml，搖勻，40℃恒溫水浴5min0.4MNaOH（ml）

各4ml，搖勻（使酶失活，終止反應(yīng)）麥芽糖的測定管號12345671mg/ml麥芽糖標準液(ml)00.10.30.50.70.91.0dH2O(ml)1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水楊酸（ml）各1ml，混勻，沸水浴5min，冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，混勻（使還原糖與之反應(yīng)生成紅棕色產(chǎn)物，用于測定吸光度）OD520①標準曲線的制作麥芽糖的測定管號對照管測定管

12341234處理后溶液（ml）各1ml3,5-二硝基水楊酸（ml）各1ml，混勻，沸水浴5min，冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，混勻（使還原糖與之反應(yīng)生成紅棕色產(chǎn)物，用于測定吸光度）OD520

②樣品的測定結(jié)