6-2,5-己二酮對(duì)小鼠卵巢Caspase信號(hào)途徑的影響Effectof2，5-HexadioneontheCaspasesignalingpathwayinovaryofmice摘要目的2，5-己二酮（2，5-HD）對(duì)小鼠卵巢Caspase信號(hào)途徑的影響。方法①取6日齡ICR雌性小鼠卵巢體外培養(yǎng)1天，第二天加入2，5-HD，連續(xù)染毒4天。染毒劑量分別為：0、10、30、90、150μM2，5-己二酮;染毒結(jié)束后，每組隨機(jī)取5個(gè)卵巢進(jìn)行Caspase-8基因表達(dá)蛋白的測(cè)定，其余卵巢用于測(cè)定mRNA表達(dá)水平；②利用免疫組織化學(xué)染色法的方法測(cè)定Caspase凋亡路徑中Caspase-8基因蛋白的表達(dá)水平；③Caspase相關(guān)基因表達(dá)水平：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠卵巢中Caspase3、Caspase8、Caspase9基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果Caspase-8蛋白表達(dá)水平在30、90μM劑量組呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Caspase-3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在10、90μM劑量組呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Caspase-9基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在10、90μM劑量組呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論2，5-己二酮引起Caspase-3和Caspase-9基因mRNA水平升高，可能參與影響了卵巢Caspase信號(hào)途徑。關(guān)鍵詞：2，5-己二酮原始卵泡生殖毒性凋亡AbstractObjective:Toobservetheeffectof2,5-hexanedioneonCaspaseapoptosisinmouseovarianprimitivefollicles.Methods：Ovarieswerecollectedfrom25female6daysold

ICRmiceandincubatedinvitroforoneday.TheOvarieswererandomlydividedintofivegroupsandexposedto0,10,30,90and150μM2,5-HDforanother4days.TheexpressionlevelofCaspase-8wasdeterminedusingimmunohistochemistryandq-RTPCRwasusedformRNAexpressionsofCaspase-3,Caspase-8andCaspase-9gene..Results:Comparedwiththecontrolgroup,Caspase-8proteinexpressionleveldecreasedinthe10and30μMsignificantly(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,therelativeexpressionofbothCaspase-3andCaspase-9increasedsignificantlyinthe10and90μM2,5-HDdosegroups(P<0.05).conclusion:2,5-HDexposureincreasestheexpressionofcaspase-3andcaspase-9genesitmaybeinvolvedintheapoptosispathwayofCaspaseinprimitivefolliculardevelopment.KeyWords：2，5-Hexadione；primordialfollicles；reproductivetoxicity；apoptosis前言2，5-己二酮(2，5-Hexadione，2，5-HD)是正己烷的主要代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是正己烷發(fā)揮毒性的關(guān)鍵物質(zhì)。正己烷屬飽和脂肪烴類，常溫下為微有異臭的液體。易揮發(fā)，蒸汽比重為2.97。幾乎不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇等［1］，因此其廣泛應(yīng)用于黏膠、電子器件清洗、印刷、干洗、家具、運(yùn)動(dòng)器材及制鞋等行業(yè)中。正己烷主要通過(guò)呼吸道、皮膚、消化道等進(jìn)入人體,長(zhǎng)期接觸能夠引起多發(fā)性周圍神經(jīng)病變,神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢,甚至肌肉萎縮,嚴(yán)重者可引起肝腎損害［2］。近幾十年來(lái)，因?yàn)槲覈?guó)工業(yè)發(fā)展迅速，接觸正己烷工人的數(shù)量逐漸上升，正己烷慢性中毒事件常有發(fā)生，是我國(guó)職業(yè)中毒事件的重要組成部分［3,4］?，F(xiàn)有有研究表明，正己烷除對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有明確損害外，其還對(duì)生殖系統(tǒng)具有毒性，例如導(dǎo)致男性性欲下降、精原細(xì)胞受損、精子數(shù)目減少、活動(dòng)能力下降及睪丸萎縮等［5，6,7］。還有接觸正己烷的女工會(huì)出現(xiàn)出現(xiàn)停經(jīng)，月經(jīng)失調(diào)，生育能力降低等情況[8]。哺乳動(dòng)物的卵巢中,卵母細(xì)胞發(fā)生與發(fā)育的基本功能單位為卵泡。卵泡由卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞組成,在其發(fā)育過(guò)程先后經(jīng)歷了原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡四個(gè)階層[9]。雌性哺乳動(dòng)物的卵泡儲(chǔ)備是有限并且在成年期不可更新的。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中,出生前后會(huì)建立一個(gè)被稱為原始卵泡庫(kù)的生殖儲(chǔ)備庫(kù),是哺乳動(dòng)物一生唯一的生殖資源。所以原始卵泡的最初形成數(shù)量直接決定著雌性哺乳動(dòng)物的生育力。同時(shí),原始卵泡休眠與激活之間的平衡更直接決定了雌性哺乳動(dòng)物的生育壽命[10]。Caspase的激活在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)caspase激活最深入研究的兩種途徑是:細(xì)胞表面死亡受體途徑和線粒體啟動(dòng)途徑。在細(xì)胞表面死亡受體通路中，Caspase-8招募到死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)后的活化是傳遞死亡信號(hào)的關(guān)鍵事件。這一事件在不同的水平上受到不同的病毒和哺乳動(dòng)物蛋白的調(diào)控?；罨腃aspase-8可通過(guò)直接裂解或間接裂解途徑激活下游Caspase，并誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C。在線粒體啟動(dòng)的通路中，Caspase的激活是由多聚體Apaf-1/細(xì)胞色素c復(fù)合物的形成觸發(fā)的，該復(fù)合物在招募和激活procaspase-9中具有完全的功能。激活Caspase-9將裂解并激活下游caspase，如Caspase-3、Caspase-6等[11]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，Caspases信號(hào)途徑可能與原始卵泡的凋亡有關(guān)[12,13]。ABOLAJI等的研究發(fā)現(xiàn)2,5-HD暴露可以破壞激素穩(wěn)態(tài)，并誘導(dǎo)大鼠卵巢和子宮的氧化應(yīng)激[14]。有研究表明正己烷可能通過(guò)改變激素分泌直接介導(dǎo)，促進(jìn)粒細(xì)胞凋亡，這可能是正己烷誘導(dǎo)小鼠卵巢損傷的重要機(jī)制之一[15]。ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)，隨著2，5-己二酮?jiǎng)┝康脑黾?，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率明顯增加［16］。有研究發(fā)現(xiàn)2,5-HD引起人卵巢顆粒細(xì)胞凋亡增加的機(jī)制可能是通過(guò)BCL-2、BAX和CASPASE-3信號(hào)通路［17］。本實(shí)驗(yàn)在體外組織水平上探究2，5-己二酮是否會(huì)導(dǎo)致卵巢原始卵泡凋亡及其引起凋亡的機(jī)制，并探討Caspase信號(hào)途徑在其中發(fā)揮的作用。目前已有部分體內(nèi)試驗(yàn)研究正己烷的生殖毒性，而體外實(shí)驗(yàn)卻不多見，對(duì)2，5-己二酮是否會(huì)引起原始卵泡凋亡進(jìn)行探究可為進(jìn)一步研究正己烷的卵巢毒性奠定了基礎(chǔ)，另一方面，清楚了解這一機(jī)制對(duì)保護(hù)正己烷職業(yè)接觸人群的生殖健康，預(yù)防控制正己烷的生殖毒性，具有重要意義。

1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)采用6日齡雌性ICR小鼠50只，來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。1.1.2耗材Tip頭Axygen公司0.5ml、1.5ml、15mlEP管Axygen公司96孔板Costar公司1.1.3實(shí)驗(yàn)的儀器與設(shè)備EASYpurell超純水系統(tǒng)美國(guó)Barnsyeaed公司DK-8D電熱恒溫水槽上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠低速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司4℃低溫冰箱中國(guó)海爾集團(tuán)-80℃超低溫冰箱中國(guó)海爾集團(tuán)-80℃超低溫冰箱美國(guó)Thermo公司GZX-907MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司ABI7500型熒光定量PCR儀美國(guó)APPlied

Biosysterm公司熒光正置顯微鏡德國(guó)LEICA徠卡公司SERIAL000582型制冰機(jī)廈門精藝興業(yè)科技有限公司紫外分光光度計(jì)ND-1000型英國(guó)SYNGENE公司包埋機(jī)、脫水機(jī)、半自動(dòng)石蠟切片機(jī)德國(guó)LEICA徠卡公司1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑2，5-己二酮美國(guó)SIGMA公司二甲苯分析純天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司無(wú)水乙醇分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司異丙醇分析純上海三鷹化學(xué)試劑有限公司甲醇分析純西隴科學(xué)股份有限公司100X檸檬酸鈉抗原修復(fù)液BBILifeSciences曲拉通X-100西隴化工股份有限公司30%過(guò)氧化氫分析純西隴科學(xué)股份有限公司PBS磷酸鹽粉劑Webcan公司BSAPhygene公司TRIZOL美國(guó)Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本TaKaRa公司SYBRPremixExTaq熒光定量試劑盒日本TaKaRa公司DAPIStainSolutionBBILifeSciencesAnti-ProCaspase-8抗體[EPR162]Abcam公司GoatAnti-RabbitIgG(H+L)(FITCconjugated)Elabscience公司1.2實(shí)驗(yàn)步驟與方法1.2.1主要試劑配制（1）1×PBS：取一包PBS粉末溶于2L的蒸餾水中，混勻，室溫保存。（2）20%TritonX-100：20ml曲拉通X-100+80mlPBS（3）PBST：將2.5ml的20%TritonX加入500ml的1×PBS中（4）BSA：稱取60mg的BSA粉末，溶于1ml的PBST中（5）封閉液：取800ul的BSA溶液，在其中加入200ul的山羊血清（6）抗體稀釋液：800ulBSA+100ul山羊血清+100ulPBST（7）檸檬酸鹽緩沖液：取100*檸檬酸鈉緩沖液4ml溶于400ml的蒸餾水中（8）DAPI：10ulDAPI+90ulPBS1.2.2體外卵巢培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中打開24孔培養(yǎng)板，每孔加入1mLAlpha-MEM培養(yǎng)液，用滅菌處理后的鑷子夾取聚碳酸酯膜，放置于培養(yǎng)液上，將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱（37℃,5%CO2）中預(yù)孵育1h。取6日齡ICR小鼠，皮膚酒精消毒處理，采用頸椎脫臼處死。在無(wú)菌條件下打開腹部皮膚和組織，快速取下卵巢-輸卵管復(fù)合物，放入已37℃預(yù)熱的L-15培養(yǎng)液中。在體視顯微鏡下，用顯微鑷小心快速地剝離輸卵管和其他粘連組織，分離出卵巢。用顯微鑷輕輕取出卵巢，轉(zhuǎn)移至預(yù)孵育的加有BSA的Alpha-MEM培養(yǎng)液中，置聚碳酸酯膜上。培養(yǎng)1天，第二天加入2,5-HD，染毒劑量分別為0、10、30、90、150μM，連續(xù)染毒4天。1.2.3免疫組化（1）10%甲醛固定，脫水，切片，烘干。放入4度冰箱；（2）脫蠟：二甲苯30min，二甲苯30min,100%乙醇5min，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇2min，70%乙醇2min；（3）放入PBS水化1min；（4）刻上記號(hào)；（5）放入檸檬酸鹽緩沖液，使其PH=6，室溫下平衡5-10min；（6）在檸檬酸鹽緩沖液中加入吐溫-20，放入微波爐，高火，5次，每次5min，每次結(jié)束后加蒸餾水；（7）冷卻至室溫，PBS洗3次，每次5min。放入甲醇（50ml）和30%過(guò)氧化氫（0.5ml）的混合液中震蕩30min；（8）PBS洗2次，每次5min。PBST洗一次，10min；（9）用PAP筆在組織周圍畫圈；（10）潮濕環(huán)境下，室溫，封閉45min；（11）PBS洗2次，每次5min.PBST洗1次，5min；（12）孵一抗，放入4度冰箱，過(guò)夜；（13）復(fù)溫30min，PBST洗2次，第一次5min，第二次10min；（14）潮濕室溫，避光下孵二抗1小時(shí)；（15）PBST洗滌3次，每次10min；（16）滴DAPI，顯影。1.2.4熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)及合成查閱文獻(xiàn)中目的基因Caspase3、Caspase8、Caspase9的基因序列，由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。如下表表1-小鼠目的基因引物序列基因上游引物（5'-3')下游引物（5’-3')Caspase3ACTGATGAGGAGATGGCTTGCGGACTGGATGAACCACGACCCaspase8GGACTACATCCCACACAAGAAGCAGGTTGCAGTCTAGGAAGTTGACCAGCCaspase9AGTTCCCGGGTGCTGTCTATGCCATGGTCTTTCTGCTCAC卵巢組織總RNA提取(1)卵巢研磨：取染毒結(jié)束的卵巢放入玻璃勻漿器中，按50-100mg/ml加入TRizol裂解液，室溫放置10min；(2)每使用1mlTRizol，加入0.2ml氯仿，手動(dòng)搖勻15s，室溫放置3min；(3)4℃，12000rpm，離心10min；(4)吸取上層水相，至另一離心管中；(5)按0.5ml異丙醇/1mlTRizol加入異丙醇(沉淀RNA)，搖勻，室溫放置10min；(6)4℃，12000rpm，離心10min，棄上清，RNA沉于管底；(7)按1ml75％乙醇/1mlTRizol加入75％乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；(8)4℃，8000g，離心5min，盡量棄上清；(9)室溫晾干；(10)5-10ulDEPC水溶解，槍頭吸打，-20℃保存。RNA濃度測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，取2ul儲(chǔ)存液加入另一個(gè)離心管中，以DEPC水作為空白對(duì)照，測(cè)OD260/280值。(1OD=400ugRNA。OD260/280值在1.8-2.0視為純度很高）一般濃度在1000ng/ml較準(zhǔn)，濃度太高需稀釋后在測(cè)定。cDNA的合成(1)去除基因組DNA:將保存的RNA溶液于4℃復(fù)溫后，短暫離心后置于冰上：PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說(shuō)明書依次加入以下試劑見表2:表格2去除基因組DNA反應(yīng)體系試劑使用量5×gDNAEraserBuffer2.0ulgDNAEraser1.0ulTotalRNA1μgRNase-FreedH2OUpto10ul加入2ul總RNA提取液，8ul去除基因組DNA反應(yīng)體系,室溫下反應(yīng)5分鐘。（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和步驟：依照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說(shuō)明書依次加入以下試劑見表3：表格3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑使用量步驟2.4.1的反應(yīng)液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMix11.0ulRTPrimerMix1.0ul5×PrimeScriptBuffer24.0ulRNaseFreedH2O4.0ulTotal20.0μl將反應(yīng)體系于37℃15min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，于85℃5sec滅活反轉(zhuǎn)錄酶。合成好的cDNA存放于-20℃?zhèn)溆?。熒光定量PCR法測(cè)定Caspase3、Caspase8、Caspase9表達(dá)情況擴(kuò)增體系（試劑見表4）：按照SYBR?PremixExTaq?說(shuō)明書操作將樣品，依次加入96孔板1000rpm離心半徑12.5cm室溫離心2min，設(shè)置擴(kuò)增條件，7500Real-TimePCRSystem擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參校正各樣本的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性15min；95℃變性10sec，60℃退火并延伸34sec，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行溶解反應(yīng)。溶解反應(yīng)條件：95℃,15sec，60℃,1min，95℃,15sec,一個(gè)循環(huán)數(shù)。其后溶解曲線為平滑單峰能夠說(shuō)明引物特異性強(qiáng)。表4定時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)總體系20ul組成成分量（ul)SYBR?PremixExTaq10上游引物（10uM)0.8下游引物（10uM)0.8CDNA2.0dH2O6.4總量20數(shù)據(jù)處理：反應(yīng)結(jié)束后，所有反應(yīng)信息資料通過(guò)LightCycler7500RealTimePCRSystem擴(kuò)增儀上收集并儲(chǔ)存，2-△△CT法獲得表達(dá)情況，并用

SPSS19.0

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)對(duì)所獲得的溶解曲線進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性分析。有文獻(xiàn)表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。但是，CT值是一個(gè)指數(shù)而非線性概念。因此，很少用原始的CT值來(lái)表示擴(kuò)增結(jié)果?！鰿t=Ct目的基因一Ct管家基因,△△Ct=(Ct目的基因一Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組一(Ct目的基因一Ct管家基因)對(duì)照組=△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△Ct(對(duì)照組）。1.2.5資料及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，根據(jù)各組數(shù)據(jù)所符合的分析條件，分別采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，后再進(jìn)行兩兩比較。利用線性相關(guān)分析方法分析劑量反應(yīng)關(guān)系。定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。2結(jié)果2.12,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢中Caspase-8蛋白表達(dá)水平的影響運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)小鼠卵巢組織的Caspase-8蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。計(jì)算各組的蛋白相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行定量分析，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各劑量組之間,只有10μM劑量組與對(duì)照組相比Caspase-8蛋白表達(dá)水平有差異且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余劑量組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。圖1圖12,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢中Caspase-8蛋白表達(dá)水平的影響貼上免疫組化圖片2.22,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢中Caspase相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)小鼠卵巢中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。如圖2、3、4所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系穩(wěn)定，溶解曲線峰值均較高，無(wú)非特異性產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)生，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性，說(shuō)明可以使用該方法進(jìn)行測(cè)定這三個(gè)基因的表達(dá)水平。使用單因素方差檢驗(yàn)檢測(cè)卵巢組織中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖8所示，在卵巢組織中，對(duì)于Caspase-3基因而言，與對(duì)照組相比，10、90μM劑量組中Caspase-3基因mRNA表達(dá)水平都明顯升高(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)于Caspase-8基因來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組相比，各劑量組中Caspase-8基因mRNA表達(dá)水平差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)于Caspase-9基因來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組相比，10、90μM劑量組中Caspase-9基因mRNA表達(dá)水平都明顯升高(P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖2Caspase-3擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖2Caspase-3擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖3Caspase-8擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖3Caspase-8擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖4Caspase-9擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖4Caspase-9擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖52,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-3基因mRNA表達(dá)水平的影響圖52,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-3基因mRNA表達(dá)水平的影響圖62,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-圖62,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-8基因mRNA表達(dá)水平的影響圖72,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-9基因mRNA表達(dá)水平的影響圖72,5-己二酮染毒對(duì)小鼠卵巢組織中Caspase-9基因mRNA表達(dá)水平的影響3討論原始卵泡的形成和發(fā)育決定哺乳動(dòng)物的繁殖性能和繁殖壽命，原始卵泡被激活進(jìn)人生長(zhǎng)卵泡池的數(shù)量與原始卵泡池中卵泡的衰竭率密切相關(guān)［18］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的生理性死亡,是器官生理性衰老的主要原因,細(xì)胞凋亡總體受Caspase依賴