1T/FDSAXXXX—202X外泌體提取與純化工藝規(guī)范本文件規(guī)定了外泌體提取與純化過程中的一般要求、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能、技術(shù)要求、試驗方法、質(zhì)量控制。本文件適用于來源于細胞培養(yǎng)上清液、體液（如血清、尿液、乳汁）等樣本的外泌體提取與純化，適用于科研、臨床前研究及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5009.5食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T38482動物源性I型膠原蛋白成分測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法GB/T39729細胞純度測定通用要求流式細胞測定法GB/T39730細胞計數(shù)通用要求流式細胞測定法GB/T42076.1生物技術(shù)細胞計數(shù)第1部分：細胞計數(shù)方法通則《中華人民共和國藥典（2025年版）》（以下簡稱《藥典》）3術(shù)語、定義和縮略語GB/T39729、GB/T39730、GB/T42076.1界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1超速離心法exosomeultracentrifugationmethod利用不同組分的沉降速率差異，在高速離心力作用下實現(xiàn)外泌體分離的技術(shù)。3.2納米顆粒跟蹤分析nanoparticletrackinganalysis（NTA）通過追蹤溶液中納米顆粒布朗運動軌跡，測定顆粒粒徑分布與濃度的技術(shù)。4一般要求4.1實驗室及生產(chǎn)環(huán)境4.1.1實驗室/生產(chǎn)場地應(yīng)滿足所在地生物安全管理要求，具備樣品前處理、分離純化、質(zhì)控檢測三大功能區(qū)，并實現(xiàn)適當?shù)娜藛T與流程分隔以降低交叉污染風險。4.1.2關(guān)鍵設(shè)備（超速離心機、超濾裝置、液相色譜/尺寸排阻色譜設(shè)備、免疫親和柱、納米顆粒跟蹤分析儀NTA、透射電鏡TEM或冷凍電鏡Cryo-EM、Westernblot/流式細胞儀等）應(yīng)建立校準與維護制度，校準周期及合格判定依據(jù)應(yīng)記錄并可追溯。4.2人員資格操作人員應(yīng)經(jīng)過外泌體生物學、無菌操作、儀器操作、安全與質(zhì)量體系培訓(xùn)，并具備獨立正確操作的能力。T/FDSAXXXX—202X24.3原材料與試劑4.3.1原材料（細胞系、培養(yǎng)基、血清/血漿樣品等）應(yīng)有來源可追溯性，細胞系應(yīng)通過細胞鑒定與無支原體檢測；若使用血清，應(yīng)說明是否去除外泌體并記錄批次證書。4.3.2使用的緩沖液、酶和試劑應(yīng)符合實驗室/產(chǎn)業(yè)質(zhì)量要求，關(guān)鍵緩沖液應(yīng)標注制備配方、pH、滲透壓和保存條件。4.4生物安全與處置樣品廢棄物應(yīng)按生物危害廢棄物管理要求處置，關(guān)鍵步驟應(yīng)有明確處置流程和記錄。5系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能5.1外泌體制備系統(tǒng)組成外泌體制備系統(tǒng)由表1模塊組成。表1制備系統(tǒng)模塊組成5.2系統(tǒng)功能要求外泌體制備系統(tǒng)功能應(yīng)包括下列要求。a）支持多種樣本類型（細胞上清、血清、尿液等）處理。b）實現(xiàn)外泌體的高效提?。ɑ厥章省?0%）與高純度（雜蛋白去除率≥80%）。c）具備可擴展性，支持從實驗室小試（10mL）到中試（1L～10L）規(guī)模。d）所有接觸樣本的部件應(yīng)為生物相容性材料，符合USPClassVI標準。6技術(shù)要求6.1外泌體基本屬性要求外泌體基本屬性要求應(yīng)符合表2規(guī)定。表2基本屬性要求NTA或FCM6.2提取與純化性能要求外泌體提取與純化性能要求應(yīng)符合表3規(guī)定。表3性能要求T/FDSAXXXX—202X36.3工藝過程要求提取與純化工藝流程圖見附錄A，過程應(yīng)符合下列要求。a）所有操作應(yīng)在符合GB19489的生物安全二級（BSL-2）實驗室進行。b）樣本處理應(yīng)在采集后4h內(nèi)完成，或于4℃保存不超過24h。c）提取與純化過程應(yīng)在4℃條件下進行，避免外泌體降解。d）使用緩沖液應(yīng)符合GB/T6682一級水標準，pH7.2～7.4，滲透壓280mOsm/kg～320mOsm/kg。7試驗方法外泌體提取與純化性試驗方法應(yīng)符合表4規(guī)定。表4試驗方法GB/T39730、GB/T4208質(zhì)量控制8.1批次一致性驗證每批次外泌體制品應(yīng)進行以下檢測并記錄。a）粒徑主峰偏移≤10nm。b）濃度CV≤10%。c）標志物表達一致性（WB條帶灰度差異≤15%）。8.2穩(wěn)定性驗證穩(wěn)定性驗證應(yīng)按照下列要求執(zhí)行。a）儲存條件：-80℃、-20℃、4℃,分別于0、7、14、30天取樣檢測。b）評價指標：粒徑變化≤10%，濃度下降≤20%，標志物表達無明顯減弱。T/FDSAXXXX—202X4（資料性）外泌體提取與純化流程A.1外泌體提取與純化流程示意圖外泌體提取與純化流程示意圖見圖A.1。圖A