納米材料生物活性測試試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共20分）1.以下哪項不屬于納米材料生物活性測試的核心指標？A.細胞增殖率B.活性氧（ROS）水平C.材料比表面積D.炎癥因子分泌量2.MTT法檢測細胞毒性時，關(guān)鍵顯色物質(zhì)是？A.甲臜（Formazan）晶體B.熒光素酶C.臺盼藍D.碘化丙啶（PI）3.評估納米材料血液相容性時，溶血率的安全閾值通常為？A.＜1%B.＜5%C.＜10%D.＜20%4.用于檢測納米材料誘導細胞凋亡的常用流式細胞術(shù)標記組合是？A.AnnexinV-FITC/PIB.DAPI/鬼筆環(huán)肽C.DCFH-DA/PID.臺盼藍/CCK-85.納米顆粒粒徑減小至100nm以下時，對生物活性的主要影響是？A.降低細胞攝取效率B.增加比表面積，增強與生物分子相互作用C.減少表面電荷密度D.減弱在體液中的分散穩(wěn)定性6.以下哪種方法可定量檢測納米材料誘導的氧化應(yīng)激水平？A.掃描電鏡（SEM）觀察細胞形態(tài)B.實時熒光定量PCR（qPCR）檢測炎癥基因C.二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光法D.免疫熒光染色觀察細胞骨架7.評價納米材料生物相容性時，體外實驗常用的成纖維細胞系是？A.HeLa（宮頸癌細胞）B.L929（小鼠成纖維細胞）C.RAW264.7（小鼠巨噬細胞）D.HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）8.納米材料表面修飾聚乙二醇（PEG）后，對生物活性的主要影響是？A.增強與血清蛋白的非特異性吸附B.降低在體內(nèi)的循環(huán)時間C.減少巨噬細胞的吞噬清除D.提高細胞對材料的主動攝取9.檢測納米材料對紅細胞的影響時，若離心后上清液吸光度與陽性對照（純水）吸光度比值為3%，則溶血率判定為？A.強溶血（不可接受）B.中度溶血（需進一步驗證）C.弱溶血（可接受）D.無溶血（安全）10.以下哪項不是納米材料生物活性體內(nèi)測試的常見模型？A.斑馬魚胚胎B.小鼠皮下植入C.大腸桿菌培養(yǎng)D.大鼠尾靜脈注射二、填空題（每空1分，共20分）1.納米材料生物活性測試的核心目的是評估其與_______的相互作用及潛在_______。2.細胞毒性測試中，CCK-8法的原理是通過檢測_______酶對試劑的還原反應(yīng)，生成_______物質(zhì)，其吸光度與活細胞數(shù)量成_______。3.活性氧（ROS）檢測常用探針為_______，其被ROS氧化后發(fā)出_______熒光。4.評價納米材料誘導炎癥反應(yīng)時，常用的檢測指標包括_______（如TNF-α）和_______（如IL-6）。5.體內(nèi)生物分布實驗中，常用_______（如放射性同位素標記）或_______（如熒光染料標記）追蹤納米材料在器官中的蓄積。6.納米材料的表面電荷會影響其與細胞膜的_______，正電荷材料易通過_______作用被細胞攝取。7.溶血試驗中，陰性對照通常使用_______，陽性對照使用_______。8.細胞攝取納米材料的主要途徑包括_______（如網(wǎng)格蛋白介導）和_______（如巨胞飲）。9.生物相容性評價需綜合考慮_______（如細胞存活）和_______（如免疫反應(yīng)）指標。10.納米材料的_______（如棒狀、球形）會影響其在生物體內(nèi)的滯留時間和細胞內(nèi)化效率。三、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述MTT法與CCK-8法檢測細胞毒性的主要區(qū)別及各自優(yōu)缺點。2.為什么納米材料的分散性是生物活性測試的關(guān)鍵前提？請從實驗設(shè)計角度說明。3.列舉3種檢測納米材料誘導細胞凋亡的方法，并簡述其原理。4.解釋“納米材料的尺寸效應(yīng)”對生物活性的影響，舉例說明。5.體內(nèi)外生物活性測試結(jié)果可能存在差異的原因有哪些？四、實驗設(shè)計題（20分）請設(shè)計一套完整的體外實驗方案，評估新型納米羥基磷灰石（nHA）的細胞毒性，要求包含材料預(yù)處理、細胞模型選擇、檢測方法、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及結(jié)果判定標準。五、論述題（10分）結(jié)合納米材料的物理化學特性（尺寸、形貌、表面修飾、表面電荷），論述其對生物活性（細胞攝取、毒性、靶向性）的影響機制。納米材料生物活性測試試題答案一、單項選擇題1.C（比表面積是材料物理特性，非生物活性直接指標）2.A（MTT被活細胞線粒體脫氫酶還原為甲臜晶體）3.B（國際標準通常規(guī)定溶血率＜5%為安全）4.A（AnnexinV標記早期凋亡細胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸，PI標記壞死細胞）5.B（粒徑減小導致比表面積增大，增強與蛋白質(zhì)、細胞膜的相互作用）6.C（DCFH-DA進入細胞后被ROS氧化為DCF，發(fā)出綠色熒光）7.B（L929是成纖維細胞標準模型，用于生物材料相容性測試）8.C（PEG修飾可形成“空間位阻”，減少血清蛋白吸附和巨噬細胞吞噬）9.D（溶血率=（樣品吸光度-陰性對照吸光度）/（陽性對照吸光度-陰性對照吸光度）×100%，3%＜5%為無溶血）10.C（大腸桿菌為原核生物，不用于哺乳動物生物活性測試）二、填空題1.生物系統(tǒng)；毒性/安全性2.脫氫；有色；正相關(guān)3.DCFH-DA；綠色4.促炎細胞因子；抗炎細胞因子5.放射性標記法；熒光標記法6.靜電相互作用；靜電吸引7.生理鹽水；去離子水（或純水）8.受體介導的內(nèi)吞；非受體介導的內(nèi)吞9.細胞水平；組織/器官水平10.形貌（或形態(tài)）三、簡答題1.區(qū)別及優(yōu)缺點：-MTT法：試劑為四唑鹽（MTT），需溶解甲臜晶體（DMSO或酸化異丙醇），操作步驟多；優(yōu)點是成本低，缺點是甲臜溶解性差，易產(chǎn)生誤差，且對懸浮細胞不敏感。-CCK-8法：試劑為WST-8，活細胞脫氫酶還原后直接生成水溶性甲臜，無需溶解步驟；優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高、對細胞毒性小，缺點是成本較高，需避免光照。2.分散性的重要性：納米材料易團聚，團聚體粒徑遠大于單分散顆粒，會改變其與細胞的接觸面積、攝取效率及毒性。實驗設(shè)計中需通過超聲分散、表面修飾（如PEG）或添加分散劑（如牛血清白蛋白）確保材料在培養(yǎng)基中穩(wěn)定分散；需用動態(tài)光散射（DLS）或透射電鏡（TEM）驗證分散狀態(tài)，避免因團聚導致實驗結(jié)果偏差（如假陽性毒性）。3.凋亡檢測方法及原理：-流式細胞術(shù)（AnnexinV/PI雙染）：AnnexinV與早期凋亡細胞外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合（熒光標記），PI進入壞死細胞染色DNA，區(qū)分早期凋亡（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡/壞死（AnnexinV+/PI+）。-TUNEL法（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記）：檢測凋亡細胞DNA斷裂產(chǎn)生的3'-OH末端，通過酶標記dUTP顯色或熒光標記，定量凋亡細胞比例。-Westernblot檢測凋亡蛋白：如檢測caspase-3（活化形式）、Bax/Bcl-2比值，通過蛋白表達水平變化反映凋亡通路激活。4.尺寸效應(yīng)的影響：納米材料粒徑減?。ㄈ鐝?00nm降至20nm）會顯著增加比表面積，增強與生物分子（如蛋白質(zhì)、細胞膜）的相互作用，提高細胞攝取效率（如通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞）；同時，小粒徑材料更易穿透生物屏障（如血腦屏障），可能導致器官蓄積毒性。例如，20nm的金納米顆粒比200nm的顆粒更易被巨噬細胞攝取，且在肝臟中的蓄積量更高。5.體內(nèi)外結(jié)果差異的原因：-體外實驗為單一細胞模型，缺乏體內(nèi)復雜微環(huán)境（如免疫細胞、血流剪切力、組織屏障）；-體內(nèi)納米材料會與血清蛋白結(jié)合形成“蛋白冠”，改變表面性質(zhì)和生物活性；-體內(nèi)代謝和排泄過程（如腎臟清除、肝臟代謝）可能降低材料濃度，而體外實驗為靜態(tài)培養(yǎng)；-體內(nèi)存在級聯(lián)反應(yīng)（如炎癥反應(yīng)、凝血反應(yīng)），可能放大或緩解體外觀察到的毒性。四、實驗設(shè)計題（示例）實驗方案：新型納米羥基磷灰石（nHA）的體外細胞毒性評估1.材料預(yù)處理：-稱取nHA粉末，用去離子水超聲分散（功率200W，10min），制備1mg/mL母液；-取母液用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM）稀釋為5、25、50、100、200μg/mL的測試濃度（設(shè)3個復孔）；-用動態(tài)光散射（DLS）檢測各濃度nHA的粒徑分布和Zeta電位，確保分散均勻（粒徑≤200nm，PDI≤0.3）。2.細胞模型選擇：選用L929小鼠成纖維細胞（生物材料相容性測試標準細胞），培養(yǎng)條件：37℃、5%CO?，培養(yǎng)基為DMEM（含10%FBS），傳代至對數(shù)生長期用于實驗。3.檢測方法：-CCK-8法檢測細胞增殖：接種細胞（5×103/孔）于96孔板，24h貼壁后更換含nHA的培養(yǎng)基，共培養(yǎng)24、48、72h；每孔加入10μLCCK-8試劑，孵育2h后測450nm吸光度（OD值），計算細胞存活率（%）=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。-LDH釋放實驗檢測膜損傷：收集培養(yǎng)上清，用LDH檢測試劑盒（比色法）測490nm吸光度，LDH釋放率（%）=（實驗組LDH-對照組LDH）/（最大釋放組LDH-對照組LDH）×100%（最大釋放組用1%TritonX-100裂解細胞）。-活/死細胞染色：培養(yǎng)48h后，用Calcein-AM（活細胞，綠色熒光）和PI（死細胞，紅色熒光）染色，熒光顯微鏡觀察細胞存活狀態(tài)。4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計：每組實驗重復3次（n=3），數(shù)據(jù)以“均值±標準差（Mean±SD）”表示，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組間差異（P＜0.05為顯著）。5.結(jié)果判定標準：-細胞存活率＞80%（各濃度）：無細胞毒性；-細胞存活率50%-80%：輕度毒性；-細胞存活率＜50%：中/重度毒性；-LDH釋放率＜10%：膜完整性良好；若＞20%提示明顯膜損傷。五、論述題納米材料的物理化學特性通過以下機制影響生物活性：1.尺寸：粒徑減?。ㄈ鐝?μm降至20nm）會顯著增加比表面積，增強與生物分子（如血清蛋白、細胞膜受體）的結(jié)合能力，提高細胞攝取效率（如通過網(wǎng)格蛋白/窖蛋白介導的內(nèi)吞）。小粒徑材料（＜100nm）更易穿透生物屏障（如血管內(nèi)皮、血腦屏障），可能導致器官蓄積（如肝臟、脾臟）；但過?。ǎ?0nm）可能被腎臟快速清除，降低靶向性。例如，50nm的脂質(zhì)體比200nm的更易被腫瘤細胞攝取，而10nm的金納米顆粒在腎臟中的排泄率是100nm顆粒的5倍。2.形貌：球形材料因表面能均勻，易被巨噬細胞識別和吞噬；棒狀或片狀材料（如石墨烯）因高長徑比，可能插入細胞膜導致物理損傷，誘導ROS產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)。例如，棒狀羥基磷灰石的細胞攝取率是球形的2倍，但也更易引發(fā)溶酶體破裂；片狀MoS?納米片比球形顆粒更易誘導RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α。3.表面修飾：修飾親水性分子（如PEG）可形成“空間位阻”，減少血清蛋白吸附（降低“蛋白冠”形成），延長體內(nèi)循環(huán)時間；修飾靶向配體（如抗體、葉酸）可通過受體介導的內(nèi)吞提高腫瘤細胞特異性攝取。例如，PEG修飾的納米顆粒在血液中的半衰期從30min延長至6h，而葉酸修飾的納米載體對FR陽性腫瘤細胞的攝取效