酶促反應(yīng)動力學(xué)

KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

酶促反應(yīng)動力學(xué)研究酶促反應(yīng)的速度規(guī)律及各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。※研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。

※初速度(v)：在酶促反應(yīng)過程中，初始底物濃度消耗在5%以內(nèi)的速度一、酶濃度的影響酶最適反應(yīng)適條件下

當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V=K[E]0V[E]二、底物濃度對反應(yīng)速度的影響1.單底物酶促反應(yīng)動力學(xué)中間復(fù)合物學(xué)說

E：enzyme；S：substrate；P：product1903年，Henri以蔗糖酶研究底物與反應(yīng)速率關(guān)系，與Wurtz提出酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。[S]VVmax隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)。

vVmax[S]Km+[S]＝──1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

米氏方程的推導(dǎo)前提:中間復(fù)合物學(xué)說:E+SES→E+P反應(yīng)方程式:假設(shè)：產(chǎn)物濃度很底時，忽略E+P→EPE+Sk1k2k3ESE+PTotalenzyme：[Et]=[E]+[ES]，[E]=[Et]-[ES]∵[S]>>[E] ∴[St]－[ES]≈[S]K1[E][S]＝K2[ES]+K3[ES]，即：K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]

K1整理得：K2+K3＝

KmK1令：＝Km([Et]－[ES])[S][ES]

則：[ES]＝───[Et][S]Km+[S]整理得:∵ES分解為限速步驟，∴v=K3[ES]即：K3[Et][S]Km+[S]v＝────當(dāng)?shù)孜餄舛取?，酶活性中心全部飽和，即[Et]＝[ES]，反應(yīng)達(dá)最大速度：Vmax＝K3[ES]＝K3[Et]Vmax[S]

Km+[S]

v＝────

米氏常數(shù)

：Km

當(dāng)：v=1/2Vmax

[S]=Km(摩爾/升)

K2+K3＝

KmK1Vmax[S]

Km+[S]

v＝────

VmaxV[S]KmVmax/2米氏常數(shù)的意義

Km值是酶的特征常數(shù)，只與酶性質(zhì)反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。（鑒定酶）判斷酶的最適底物，如蔗糖酶：水解蔗糖Km=28；水解綿子糖Km=350可近似地表示酶對底物親和力的大小Km值可用來表示酶對底物的親和力K2+K3＝

Km

，當(dāng)K2＞＞K3

時，K1＝[E][S]

K2[ES]

K1Km

＝＝Ks（解離常數(shù)）Km和酶與底物的親和力成反比

E+Sk1k2k3ESE+P米氏常數(shù)的求法v—[S]作圖法

雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，

又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法

Y=aX+b2.雙底物酶促反應(yīng)機(jī)制

雙底物反應(yīng)

序列反應(yīng)乒乓反應(yīng)有序順序反應(yīng)

隨機(jī)順序反應(yīng)①有序順序機(jī)制（compulsoryorderreactions）

（1）順序(序列)機(jī)制（sequentialreactions）Leadingsubstrate乙醇脫氫酶的作用

②隨機(jī)順序機(jī)制（randomorderreactions）肌酸激酶催化的反應(yīng)

Cr：creatine肌酸；CrP：creatinephosphate磷酸肌酸可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)

（2）乒乓機(jī)制（pingpongreactions）

修飾酶形式氨基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)磷酸吡哆醛磷酸吡哆胺草酰乙酸α-酮戊二酸三、溫度對酶促反應(yīng)的影響雙重影響

最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時的境溫度。植物酶：40-50?C

動物酶：35-40?C非固定常數(shù)←底物的種類、濃度,溶液的離子強(qiáng)度,pH,反應(yīng)時間等四、pH對酶促反應(yīng)的影響最適pH：植物、微生物酶：pH4.5-6.5動物酶:pH6.5-8.0非固定常數(shù)膽堿酯酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶過氧化氫酶延胡索酸酶RNase精氨酸酶pH影響反應(yīng)速度的原因

pH影響了酶分子、底物分子和ES復(fù)合物的解離狀態(tài)。過高、過低的pH導(dǎo)致酶蛋白變性。五、激活劑的影響激活劑(activator)

凡能提高酶活性，加速酶促反應(yīng)速度的物質(zhì)都稱為該酶的激活劑。主要激活劑

金屬離子：K+、Na+

、Mg2+

、Zn2+

、Fe2+

、Ca2+

、Mn2+

無機(jī)陰離子：Cl-

、Br-、I-、CN-,PO43-小分子有機(jī)物：抗壞血酸、還原型谷胱甘肽、半胱氨酸等生物大分子：蛋白酶、鈣調(diào)素等六、抑制劑的影響抑制作用：某些物質(zhì)與酶分子上特定基團(tuán)，主要是活性中心的某些基團(tuán)結(jié)合，使酶活性中心的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，從而引起酶活力的下降或喪失，這種作用稱為酶的抑制作用。酶的抑制劑(inhibitor)：能對酶產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)即為酶的抑制劑。

抑制劑與變性劑：抑制劑對酶有一定選擇性——必需基團(tuán)；引起變性的因素對酶沒有選擇性。

抑制作用的類型

不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：競爭性抑制(competitiveinhibition)非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)1.不可逆性抑制作用（irreversibleinhibition）

概念抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。抑制劑不能用透析、超濾等方法除去。

抑制劑重金屬:汞、鉛、砷有機(jī)磷化合物：農(nóng)藥（敵敵畏、敵百蟲）細(xì)胞呼吸抑制劑：氰化物、一氧化碳等

有機(jī)磷化合物羥基酶(膽堿酯酶)磷?；?失活酶)酸羥基酶抑制劑

有機(jī)磷化合物，R、R’:烷基;X:-F,-CN等解磷定(PAM,碘化醛胯甲基吡啶)或氯磷定巰基酶抑制劑烷化劑：例ICH2COOH，ICH2CONH2等E-SH+ICH2COOHE-S-CH2COOH+HI有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物(對氯汞苯甲酸,路易士氣)路易士氣巰基酶失活酶酸路易士氣的解毒失活酶BAL(二巰基丙醇)巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物2.可逆性抑制作用(reversibleinhibition)*概念抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制*類型（１）競爭性抑制作用（competitiveinhibition）

+IEIE+SE+PES反應(yīng)模式抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶反應(yīng)速度降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。

+++EESIESEIEP抑制劑是底物的結(jié)構(gòu)類似物

競爭性抑制作用動力學(xué)Vmax不變；Km（Km’）變大，隨[I]增加而增加（2）非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）

抑制劑與酶活性中心外的基團(tuán)結(jié)合，不影響酶與底物的結(jié)合，酶和底物的結(jié)合也不影響酶與抑制劑的結(jié)合。但酶-底物-抑制劑復(fù)合物不能進(jìn)一步釋放出產(chǎn)物。*反應(yīng)模式E+SESE+P+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP+IEI+SEIS+I非競爭性抑制作用動力學(xué)Km=Km’（不變）；Vmax變小，Vmax’隨[I]增加減小(３)反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）

抑制劑只與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，既減少從中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，也減少從中間產(chǎn)物解離出游離酶和底物的量。*反應(yīng)模式

E+SE+PES+IESI++ESESESIEP反競爭性抑制作用動力學(xué)Vmax、Km變??；Vmax、Km隨[I]增加減小可逆性抑制作用比較第六節(jié)

重要酶類及其活性調(diào)節(jié)

一、多酶體系與反饋調(diào)節(jié)多酶體系反饋調(diào)節(jié)蘇氨酸異亮氨酸二、別構(gòu)酶和別構(gòu)調(diào)節(jié)1．基本概念

（1）別構(gòu)調(diào)節(jié)（allostericregulation）某些化合物與酶特定部位結(jié)合（可逆非共價結(jié)合），引起酶的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致酶活性變化，這種調(diào)節(jié)方式稱為別構(gòu)調(diào)節(jié)。

（2）效應(yīng)物（effector）能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)（常為小分子代謝物或輔因子）稱為效應(yīng)物或別構(gòu)劑。

正效應(yīng)物（positiveeffetor）

效應(yīng)物與酶的結(jié)合使酶活性升高者，稱為正效應(yīng)物或別構(gòu)激活劑。

負(fù)效應(yīng)物（negativeeffetor）

效應(yīng)物與酶的結(jié)合使酶活性降低者，稱為負(fù)效應(yīng)物或別構(gòu)抑制劑。

（3）別構(gòu)酶（allostericenzyme）

能進(jìn)行別構(gòu)調(diào)節(jié)的酶為別構(gòu)酶。別構(gòu)酶除活性中心外還有別構(gòu)中心（與別構(gòu)劑結(jié)合的部位）。別構(gòu)酶一般為寡聚體，別構(gòu)中心可位于同一亞基的不同部位或不同亞基上。存在別構(gòu)中心的亞基稱調(diào)節(jié)亞基。存在活性中心的亞基稱催化亞基。

活性中心負(fù)責(zé)對底物的結(jié)合與催化，別構(gòu)中心負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)速度。（4）別構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect）：效應(yīng)物與別構(gòu)中心結(jié)合，使活性中心與底物的結(jié)合和催化活性受到影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度，此效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng)。

（5）同促效應(yīng)（homotropiceffect）：

底物分子本身對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)谝粋€效應(yīng)分子與酶別構(gòu)中心結(jié)合后，有利于同種后續(xù)分子的結(jié)合。（活性部位和調(diào)節(jié)部位是相同的。）（6）異促效應(yīng)（heterotropiceffect）：

非底物分子調(diào)節(jié)物對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)。當(dāng)?shù)谝粋€效應(yīng)分子與酶別構(gòu)中心結(jié)合后，有利于不同后續(xù)分子（底物）與酶的結(jié)合。

（7）協(xié)同效應(yīng)（cooperativeeffect）

：

調(diào)節(jié)部位和活性部位雖然在空間上是分開的，但這兩個部位通過構(gòu)象的變化可相互影響，這種影響統(tǒng)稱為協(xié)同效應(yīng)。酶結(jié)合一分子調(diào)節(jié)物（或底物），構(gòu)象變化，有利于后續(xù)分子與酶結(jié)合——正協(xié)同效應(yīng)（positivecooperativety）；新構(gòu)象不利于后續(xù)分子與酶結(jié)合——負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negativecooperativety）。三、酶的可逆共價調(diào)節(jié)（共價修飾covalentlymodulatedenzymes

）

在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。共價調(diào)節(jié)的逆反應(yīng)需在另一種酶的催化下進(jìn)行。

共價修飾的類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變

-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白酶的磷酸化與脫磷酸化糖原磷酸化酶活性的調(diào)節(jié)

磷酸化/脫磷酸化調(diào)節(jié)（磷酸化位點：Ser14）四、同工酶（isoenzymeorisozyme）

概念同工酶是指由不同基因或等位基因編碼的多肽鏈所組成的單體、純聚體或雜合體，催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。舉例：乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenaseLDH）

催化的反應(yīng)

乳酸丙酮酸

LDH5骨骼肌:乳酸丙酮酸心肌:LDH1HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脫氫酶的同工酶結(jié)構(gòu)特征（2種亞基4聚體，5種同工酶）

H：heart；M：muscle電泳行為乳酸脫氫酶同工酶在不同組織中

的分布（%）生理意義

心肌：LDH1（H4）對NADKm值小，氧化供能骨骼?。篖DH5(M4)對丙酮酸Km值小同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345*肌酸激酶（creatinephosphatekinaseCPK）催化的反應(yīng)：肌酸+ATP=肌酸磷酸+ADP結(jié)構(gòu)：2種亞基2聚體，三種同工酶MM,MB,BB肌酸激酶同工酶在人體組織中的分布肌酸激酶（CPK）骨骼肌心臟腦肝胃腎總活力（IU/g）1900-3000380160412518MM10076-90310MB-22-6210BB-110049590***第七節(jié)

酶的分離純化

和活力測定一、酶分離純化的一般原則材料選擇：新鮮、酶含量豐富所有蛋白質(zhì)分離純化的方法都適合酶特別注意酶活性的保護(hù)，避免一切能引起蛋白變性的因素每一步都要進(jìn)行酶活力的測定，跟蹤酶的去向，評價純化方法。

二、酶活力與測定

1.酶活力

（enzymeactivity）

一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，以反應(yīng)速度表示。酶活力與反應(yīng)速度呈正比。

*反應(yīng)速度：指單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。由于底物是過量的，減少量不易測準(zhǔn)，所以通常以測定產(chǎn)物的生成量為準(zhǔn)。2.酶活力單位

（unit,U）

國際單位（IU,1961

）：一個國際單位指在最適條件下，每分鐘催化1微摩爾(μmol)底物減少或1微摩爾產(chǎn)物生成所需要的酶量（25?C）。Katal（Kat

，1972）：在最適條件下，每秒鐘能催化1摩爾（mol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為1Kat。Kat與國際單位的換算如下：1Kat=