《豬鏈球菌病診斷技術(shù)》編制說明

注：提交時黑色和藍色字均不可刪減。沒有的應(yīng)寫“無”。

一、工作簡況

（一）任務(wù)來源

1.任務(wù)來源

依據(jù)《全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會征集2022年度動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)立項項

目的通知》，對標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布5年以上，且在實施過程中反映出來的不適應(yīng)生產(chǎn)現(xiàn)狀

和科學(xué)技術(shù)發(fā)展的標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)委會秘書處結(jié)合現(xiàn)有動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)體系，梳理形成了

擬制修訂標(biāo)準(zhǔn)立項征集清單（診斷技術(shù)類）。其中第8項是要求在原有10項豬

鏈球菌病相關(guān)國標(biāo)和行標(biāo)（GB/T19915.1－2005豬鏈球菌2型平板和試管凝集

試驗操作規(guī)程；GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程；GB/T

19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術(shù)；GB/T19915.4－2005豬鏈球

菌2型三重PCR檢測方法；GB/T19915.5－2005豬鏈球菌2型多重PCR檢測方

法；GB/T19915.6－2005豬鏈球菌2型通用熒光PCR檢測方法；GB/T19915.7

－2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法；GB/T19915.8－2005豬鏈球菌2型

毒力因子熒光PCR檢測方法；GB/T19915.9－2005豬鏈球菌2型溶血素基因

PCR檢測方法；NY/T1981-2010豬鏈球菌病監(jiān)測技術(shù)規(guī)范）的基礎(chǔ)上制修訂新

的《豬鏈球菌病診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)。為此，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)OIE豬鏈球菌病參考

實驗室牽頭6家單位組成的項目組向全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出申請，

申報制修訂國家標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌病診斷技術(shù)》。

2.背景介紹

豬鏈球菌病（SwineStreptococcosis）是一種常見的豬傳染病，世界各國均有

發(fā)生，是一直困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，危害嚴重，我國將其列為二類

動物疫病。豬鏈球菌病是由鏈球菌屬某些種的鏈球菌引致的以敗血癥、腦膜炎、

肺炎和關(guān)節(jié)炎等為主要臨床癥狀的豬傳染性疾病，其主要病原是豬鏈球菌的某些

血清型（主要為2、7和9型）和馬鏈球菌獸疫亞種，此外，蘭氏分群中D、E、

L群的某些鏈球菌等也可引起豬鏈球菌病。該病在世界范圍內(nèi)流行，在我國曾多

次暴發(fā)流行，造成重大危害。更應(yīng)引起重視的是，豬鏈球菌的某些血清型可感染

1

人，威脅人類健康，曾在我國導(dǎo)致嚴重的公共衛(wèi)生事件，如1998年江蘇南通、

2005年四川資陽等地先后暴發(fā)由豬鏈球菌2型感染引致的豬鏈球菌病，導(dǎo)致豬

群發(fā)病和死亡，并分別引起25人感染14人死亡和215人感染38人死亡的重大

公共衛(wèi)生事件。近年來，豬鏈球菌病大面積暴發(fā)在我國已得到基本控制，但豬鏈

球菌病在不同規(guī)模的養(yǎng)豬場都時常發(fā)生，也有人感染發(fā)病和死亡的報道。同時，

表現(xiàn)出了散發(fā)、隱性感染和與其它傳染病混合感染等新特點，對我國豬鏈球菌病

的防治提出了新要求。

由于豬鏈球菌常污染環(huán)境，在糞、灰塵及水中能存活較長時間，在健康動物

的口咽拭子甚至肺臟中也能夠檢測出。因此豬鏈球病的確診，需要臨床診斷、科

學(xué)的采樣和實驗室檢測相結(jié)合才能綜合判定。根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變

化，可以做出初步診斷；確診需通過分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)和核酸檢測等

實驗室方法。另外，近年來關(guān)于豬鏈球菌種屬界定出現(xiàn)了較大的變化，對該病定

義和診斷也提出了新要求。而現(xiàn)行的豬鏈球菌2型檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)2005年

9月27日由國家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局和國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布，2005年11

月1日起實施。該標(biāo)準(zhǔn)中涉及的部分檢測方法已經(jīng)不能適應(yīng)當(dāng)前和今后我國豬鏈

球菌病診斷的技術(shù)需求，如該標(biāo)準(zhǔn)針對的主要是豬鏈球菌2型，檢測內(nèi)容單一，

涵蓋范圍不全，不能全面檢測豬鏈球菌病的其他病原。因此，當(dāng)前亟需制修訂新

的豬鏈球菌病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的制定對于加強豬鏈球菌病的診斷，實

現(xiàn)我國對動物和人豬鏈球菌病的科學(xué)防控具有重要意義。

（二）起草單位和主要起草人及其所做的工作

1、起草單位

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、四川省動物疫病預(yù)防控制中

心、上海市動物疫病預(yù)防控制中心、廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司、河南科

技大學(xué)、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院。

2、主要起草人及分工

姓名工作單位任務(wù)分工

姚火春南京農(nóng)業(yè)大學(xué)項目主持人，負責(zé)項目設(shè)計與實施

王楷宬中國動物衛(wèi)生與流行協(xié)調(diào)起草工作組的工作，技術(shù)資料的整理、意見

病學(xué)中心征詢；豬鏈球菌2型，7型，9型的玻片凝集技

術(shù)的起草。

2

邵靚四川省動物疫病預(yù)防標(biāo)準(zhǔn)起草、修改、技術(shù)復(fù)核；豬鏈球菌通用、7

控制中心型、9型熒光PCR技術(shù)的起草。

潘子豪南京農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)起草、修改、技術(shù)復(fù)核；豬鏈球菌病的臨床

診斷的起草；豬鏈球菌2型熒光PCR技術(shù)的起草；

復(fù)核樣品盤的制備。

劉廣錦南京農(nóng)業(yè)大學(xué)協(xié)調(diào)技術(shù)專家的工作；附錄部分的起草。

王建上海市動物疫病預(yù)防馬鏈球菌獸疫亞種通用PCR技術(shù)的起草。

控制中心

吳宗福南京農(nóng)業(yè)大學(xué)豬鏈球菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定技術(shù)的起草；豬

鏈球菌2型PCR技術(shù)、豬鏈球菌通用PCR技術(shù)起

草。

賈愛卿廣東海大畜牧獸醫(yī)研意見征詢；豬鏈球菌7型、9型PCR技術(shù)。

究院有限公司

劉平中國動物衛(wèi)生與流行豬鏈球菌病樣品的采集、保存與運輸起草。

病學(xué)中心

馬喆南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鏈球菌獸疫亞種的分離培養(yǎng)、生化鑒定技術(shù)的

起草。

林祥梅中國檢驗檢疫科學(xué)研范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義起草。

究院

孫向東中國動物衛(wèi)生與流行豬鏈球菌病樣品的采集、保存與處理起草。

病學(xué)中心

陳斌四川省動物疫病預(yù)防豬鏈球菌7型、9型熒光PCR技術(shù)的起草。

控制中心

鄧飛四川省動物疫病預(yù)防豬鏈球菌通用型熒光PCR技術(shù)的起草。

控制中心

王曉旭上海市動物疫病預(yù)防馬鏈球菌獸疫亞種通用熒光PCR技術(shù)起草。

控制中心

馬家樂南京農(nóng)業(yè)大學(xué)文本校對、索引以及附錄部分的起草。

王娟廣東海大畜牧獸醫(yī)研豬鏈球菌7型、9型PCR檢測技術(shù)的起草。

究院有限公司

張煒南京農(nóng)業(yè)大學(xué)文本校對、索引以及附錄部分的起草。

汪洋河南科技大學(xué)文本校對、索引以及附錄部分的起草。

王娜中國檢驗檢疫科學(xué)研文本校對、索引以及附錄部分的起草。

究院

（三）主要工作過程

要按標(biāo)準(zhǔn)各階段為單位分別編寫。列出各階段的關(guān)鍵內(nèi)容。征求意見、審查

階段的主要內(nèi)容要詳細給出。征求意見要對征求對象的代表性、回復(fù)情況、意見

處理情況進行總結(jié)說明。

1.起草階段

3

2021年4月組建標(biāo)準(zhǔn)起草小組，制定了項目工作計劃，明確了起草小組中

每個人的職責(zé)及工作內(nèi)容，重點論證了標(biāo)準(zhǔn)的框架和主要內(nèi)容。在前期研究工作

的基礎(chǔ)上，2021年10月形成了標(biāo)準(zhǔn)草案，2021年12月形成了征求意見稿。

2.征求意見階段

2022年1月-3月，同過網(wǎng)絡(luò)郵件形式由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所、

浙江大學(xué)、上海交通大學(xué)、南京海關(guān)動植物與食品檢測中心、資陽市動物疫病預(yù)

防控制中心等科研院所、高等院校、海關(guān)系統(tǒng)、動物疫病預(yù)防控制系統(tǒng)等不同行

業(yè)的5位專家進行了函審，共計收回5份“征求意見稿”的意見回執(zhí)表。隨后，項

目組根據(jù)專家們對“意見回執(zhí)表”中提出的24條意見進行匯總、歸類，經(jīng)項目組

認真討論、修改，共采納意見24條（采納意見共占100%），未采納意見0條，

部分采納意見0條。在征集到的修改意見中未對本標(biāo)準(zhǔn)的原則性內(nèi)容提出修改意

見，均為文字性和表述性進行進一步規(guī)范和完善。對所有專家的意見項目組均經(jīng)

過多次溝通、充分討論決定，必要時再次咨詢相關(guān)專家決定是否采納所提意見，

在此基礎(chǔ)上形成本標(biāo)準(zhǔn)的“征求意見稿”進行申報。

3.審查階段（此次不寫本部分）

4.報批階段（此次不寫本部分）

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則

主要闡述標(biāo)準(zhǔn)制定或修訂過程遵循的基本原則。

1、標(biāo)準(zhǔn)編制遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，注重標(biāo)準(zhǔn)的

通用性、適用性和可操作性，同時符合我國國情。

2、標(biāo)準(zhǔn)編制格式符合GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)

構(gòu)和編寫》的要求。

3、本次標(biāo)準(zhǔn)的修訂主要以原國家《GB/T19915.1－2005豬鏈球菌2型平板和

試管凝集試驗操作規(guī)程》、《GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)

程》、《GB/T19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術(shù)》、《GB/T19915.4

－2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法》、《GB/T19915.5－2005豬鏈球菌2型多

重PCR檢測方法》、《GB/T19915.6－2005豬鏈球菌2型通用熒光PCR檢測方法》、

4

《GB/T19915.7－2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法》為基礎(chǔ)，廣泛查閱大量參

考文獻，進行充分調(diào)研，結(jié)合診斷實際需求，增加和整合了臨床診斷，樣品采集、

保存與運輸，馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌等主要致病菌普通和熒光PCR方法、

生化試驗、血清凝集試驗等檢測方法。

（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等。

依據(jù)包括試驗和統(tǒng)計數(shù)據(jù)。尤其注意本條不要寫成任務(wù)來源。

豬鏈球菌病的主要病原是豬鏈球菌的某些血清型（2、7和9型等）和馬鏈

球菌獸疫亞種。在2005年，四川發(fā)生人感染豬鏈球菌2型的疫情后，我國發(fā)布

了《豬鏈球菌病應(yīng)急防治技術(shù)規(guī)范》以及豬鏈球菌2型檢測方法的一系列國家標(biāo)

準(zhǔn)（GB/T19915.1—2005、GB/T19915.2—2005、GB/T19915.3—2005、

GB/T19915.4—2005、GB/T19915.5—2005、GB/T19915.7—2005、

GB/T19915.8—2005、GB/T19915.9—2005）。近幾年來，豬鏈球菌病的大面積暴

發(fā)在我國已得到基本控制，但有關(guān)豬群和人感染導(dǎo)致死亡的報道持續(xù)不斷。同時，

該病表現(xiàn)出散發(fā)、隱性感染和與其它傳染病混合感染等新特點。尤其是2018年

后，我國生豬養(yǎng)殖行業(yè)在非洲豬瘟的影響下，對疫病防控和穩(wěn)產(chǎn)保供提出了新的

要求，之前的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)已不能適應(yīng)新形勢下的豬鏈球菌病診斷。在本標(biāo)準(zhǔn)中，

除了針對豬鏈球菌2型，還擴展到感染人的其它血清型（7型和9型）以及馬鏈

球菌獸疫亞種的檢測，除了PCR方法，還增加了敏感性更高的熒光PCR方法。

在2008年-2017年，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)OIE豬鏈球菌病參考實驗室牽頭，聯(lián)

合四川省動物疫病預(yù)防控制中心、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、上海市動物疫

病預(yù)防控制中心等多家單位開展了公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專項《豬鏈球菌病生物災(zāi)害防

控技術(shù)研究與示范》（200803016）和《豬鏈球菌病防控技術(shù)研究與示范》

（201303041）項目，圍繞豬鏈球菌病應(yīng)急防控、流行病學(xué)調(diào)查、致病機制、檢

測診斷技術(shù)、疫苗研制、豬鏈球菌病綜合防控技術(shù)集成及推廣應(yīng)用等方面開展了

系統(tǒng)研究，取得了一批具有較高學(xué)術(shù)價值和實用價值的科技成果，例如青島市科

學(xué)技術(shù)二等獎，山東省農(nóng)牧漁業(yè)豐收獎成果獎二等獎、四川省科學(xué)技術(shù)三等獎，

相關(guān)的檢測方法也開展了廣泛的應(yīng)用和推廣。本標(biāo)準(zhǔn)的實施為我國豬鏈球菌病的

診斷提供了堅實的技術(shù)支撐，不僅對畜牧業(yè)的健康發(fā)展具有推動作用，也具有重

要的公共衛(wèi)生意義。

5

（三）新舊標(biāo)準(zhǔn)對比（適用于修訂標(biāo)準(zhǔn)的情況）

與以上國標(biāo)相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：

——增加了豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種以及豬鏈球菌病等術(shù)語和定義（見

3）；

——增加了樣品采集、保存與運輸（見4）；

——增加了豬鏈球菌病臨床診斷（見5）；

——增加了豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種分離培養(yǎng)（見5）；

——增加了豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種生化鑒定（見5）；

——增加了豬鏈球菌2型、7型、9型玻片凝集試驗（見6）；

——增加了豬鏈球菌通用PCR試驗（見5）；

——增加了豬鏈球菌7型PCR試驗（見6）；

——增加了豬鏈球菌9型PCR試驗（見6）；

——增加了豬鏈球菌通用熒光PCR試驗（見5）；

——增加了豬鏈球菌2型熒光PCR試驗（見6）；

——增加了豬鏈球菌7型熒光PCR試驗（見6）；

——增加了豬鏈球菌9型熒光PCR試驗（見6）；

——增加了馬鏈球菌獸疫亞種PCR試驗（見6）；

——增加了馬鏈球菌獸疫亞種熒光PCR試驗（見5）；

——修改了豬鏈球菌2型PCR試驗（見6）。

三、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預(yù)期的

經(jīng)濟效果

（一）主要試驗或驗證的分析

6

本標(biāo)準(zhǔn)為綜合性豬鏈球菌病診斷技術(shù)，涉及臨床診斷，樣品采集、保存與運

輸，豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種等主要致病菌普通和熒光PCR方法、分離培養(yǎng)、

生化鑒定、玻片凝集試驗等方法，能夠?qū)ωi鏈球菌病進行安全、特異、快速、靈

敏的診斷，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。涉及的主要試驗包括：

1.臨床診斷

（1）方法建立和依據(jù)

編制過程中，參考了《豬鏈球菌病》（陸承平、吳宗福主編，中國農(nóng)業(yè)出

版社）；《豬病學(xué)》，第十一版（2019）（GottschalkM,SeguraM.Streptococcosis[J].

Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻方法，同時依據(jù)中華人民共和國農(nóng)

業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌病監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（NY/T1981-2010）、四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

《豬2型鏈球菌病防治技術(shù)規(guī)范》（DB51/T1103—2018）等標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)描述，

編制豬鏈球菌的臨床診斷方法。

（2）診斷依據(jù)

診斷依據(jù)按照易感動物、臨床癥狀分類以及病理變化類型進行綜合描述，符

合描述的表型可以初步判定為豬鏈球菌病的疑似病例，需要進一步進行實驗室診

斷。臨床癥狀從病程過程分類表述，包括最急性、急性和慢性臨床表型；病理變

化主要病理癥狀展開描述，包括敗血癥型、心內(nèi)膜型、腦膜炎型以及關(guān)節(jié)炎型。

2.樣品采集、保存與運輸

編制過程中，主要參考了《豬鏈球菌病》（陸承平、吳宗福主編，中國農(nóng)業(yè)

出版社）；《豬病學(xué)》，第十一版（2019）（GottschalkM,SeguraM.

Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻方法，同時參考

了中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌病監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（NY/T1981-2010）、

安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB51/T1103—2018》（DB34/T2996—2017）和四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

《豬2型鏈球菌病防治技術(shù)規(guī)范》（DB51/T1103—2018）等3個標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)描

述。

發(fā)現(xiàn)疑似鏈球菌病病例時，應(yīng)在同一豬群的不同個體或同一個體不同組

織中分離；因該菌在健康豬肺中存在，故患敗血癥的病豬應(yīng)優(yōu)先從采取肺臟

以外的其它組織進行分離；患有腦膜炎病豬，應(yīng)采取腦脊液進行分離培養(yǎng)。

7

（1）采樣前的準(zhǔn)備。采樣人員應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識和采樣的基本技能；

防護用品要具備防護人員免受感染的功能；采樣器具符合樣品采集和實驗室檢測

的需要。

（2）樣品采集。包括鼻咽拭子、組織樣品、血液樣品的采集以及采樣單和

標(biāo)簽的填寫。既要符合實驗室檢測的要求，也要符合生物安全要求。

（3）樣品保存和運輸。咽喉拭子、組織和血液樣品根據(jù)不同的特征和檢測

需要包裝在不同的容器中，滿足防水、防破損、防外泄、耐高溫、耐高壓的要求；

包裝袋外應(yīng)標(biāo)注相關(guān)信息。全程應(yīng)冷鏈運輸。

3.分離培養(yǎng)

（1）方法建立和依據(jù)

編制過程中，主要參考了《豬鏈球菌病》（陸承平、吳宗福主編，中國農(nóng)

業(yè)出版社）；《豬病學(xué)》，第十一版（2019）（GottschalkM,SeguraM.

Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.）；《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)

手冊》，第二版，第三卷（2009年）（VosPD,GarrityGM.,JonesD.,etal.Bergey’s

ManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,The

Firmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.）；《獸醫(yī)微生物學(xué)》第六

版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第6版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版，

81-87.）等文獻方法，同時參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T19915.2－2005豬

鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程》、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌病監(jiān)

測技術(shù)規(guī)范》（NY/T1981-2010）、四川省地方標(biāo)準(zhǔn)《豬2型鏈球菌病防治技術(shù)規(guī)

范》（DB51/T1103—2018）等3個標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)描述，編制豬鏈球菌、馬鏈球菌

獸疫亞種等豬鏈球菌病致病菌的分離方法。

（2）培養(yǎng)基的選擇

采用29個豬鏈球菌血清型參考菌株（加拿大蒙特利爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院引進）、

馬鏈球菌獸疫亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35246作為質(zhì)控菌株進行復(fù)核，驗證培養(yǎng)基的

配制方案。

本方法根據(jù)豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種等主要致病菌的生長特性、菌落形

態(tài)、藥物抗性等，確定了選擇性培養(yǎng)基的配制方案。采納參考方法和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容同

8

時，結(jié)合試驗技術(shù)和原輔材料及耗材的發(fā)展。最終確定從發(fā)病豬的內(nèi)臟組織、血

液、關(guān)節(jié)液分離豬鏈球菌時采用THB綿羊血平板；從健康豬的鼻拭子、扁桃體

分離豬鏈球菌時采用THB選擇性增菌液培養(yǎng)基和THB綿羊血平板選擇性培養(yǎng)基。

豬鏈球菌在THB綿羊血平板上形成圓形、微凸、表面光滑、濕潤，邊緣整

齊，半透明的菌落，直徑約1mm，大多數(shù)菌株呈草綠色α溶血，部分菌株或延

長培養(yǎng)時間可產(chǎn)生透明的β溶血菌落。革蘭氏陽性菌體直徑1~2μm，單個或雙

個卵圓形，在液體培養(yǎng)中才呈短鏈狀。馬鏈球菌獸疫亞種菌株大部分菌株形成

3~4mm的菌落，透明且稍粘，呈露珠狀，小部分呈非粘液樣菌落，大小約1mm

左右，產(chǎn)生明顯的β溶血。革蘭氏染色均為陽性鏈狀球菌，固體培養(yǎng)基中呈

短鏈排列，液體中細菌呈8~12節(jié)長鏈狀排列。

（3）臨床應(yīng)用

應(yīng)用該方法，項目組已經(jīng)對數(shù)百例臨床豬鏈球菌病或健康豬群進行豬鏈球菌、

馬鏈球菌獸疫亞種等的分離培養(yǎng)和鑒定。如2019年從患腦膜炎仔豬的腦組織中

分離到一株豬鏈球菌，血清型為9型，將其命名為WH1609（畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2019）；

2014-2015年在廣州周邊地區(qū)共采集488份屠宰豬群扁桃體樣品和健康豬群鼻拭

子樣品分離到68株SS菌株（中國獸醫(yī)學(xué)報.2017）；從罹患肺炎型豬鏈球菌

病的仔豬氣管中分離出1株豬鏈球菌強毒株，命名為SS2011GZ（畜牧與獸

醫(yī)，2021）。2007年對國內(nèi)10省市分離的10株豬源馬鏈球菌獸疫亞種分離株

進行了培養(yǎng)和小鼠免疫效力評價（中國人獸共患病學(xué)報報，2007）；從廣東各地

送檢病料中分離出22株鏈球菌，并開展了其血清群檢測，鑒定出3株C群鏈球

菌（中國獸藥雜志，2007）；從1997-1999上海地區(qū)分離出15株豬源鏈球菌，

其中4株為C群鏈球菌（中國獸醫(yī)學(xué)報，2001）；通過細菌分離培養(yǎng)、生化鑒

定、血清定型試驗，從上海14個豬場分離出19株鏈球菌，其中7株為C群鏈

球菌（上海畜牧獸醫(yī)，2001）。

結(jié)果證明，建立的分離培養(yǎng)與純化的方法在豬鏈球菌病的診斷中具有敏感性、

特異性好、操作簡便的特點，可用于發(fā)病豬或健康豬中攜帶的豬鏈球菌、馬鏈球

菌獸疫亞種等豬鏈球菌病主要致病菌的分離培養(yǎng)。

4.豬鏈球菌生化鑒定

9

（1）方法建立和依據(jù)

本方法根據(jù)豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種等豬鏈球菌病致病菌在生長代謝中，

其分解或利用糖類等，建立其生化鑒定方法。方法建立的主要參考《伯杰氏系

統(tǒng)細菌學(xué)手冊》，第二版，第三卷（2009年）（VosPD,GarrityGM.,JonesD.,

etal.Bergey’sManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,Volume

Three,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.）；《獸醫(yī)微生

物學(xué)》第六版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第6版.北京：中國

農(nóng)業(yè)出版，81-87.）等文獻的方法。

（2）敏感性與特異性

采用29個豬鏈球菌血清型參考菌株（加拿大蒙特利爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院引進）、

馬鏈球菌獸疫亞種菌株ATCC35246進行質(zhì)控和復(fù)核。

生化反應(yīng)是定性反應(yīng)，結(jié)果以陽性（+），陰性（-）和產(chǎn)氣（O）顯示。微

量生化試驗可用于鏈球菌的細菌鑒定，并己積累了大量的經(jīng)驗，但鏈球菌生

化反應(yīng)活潑，不同血清型或同一血清不同菌株之間的生化反應(yīng)有差異，故生化實

驗最好還是與血清學(xué)、PCR等鑒定方法結(jié)合起來。大多豬鏈球菌菌株具有下述

特性：在富含淀粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，VP反應(yīng)陰性，6.5%NaCl抑制其

生長，不能還原0.1%的美藍，能發(fā)酵菊粉和棉子糖，七葉苷水解陽性，馬尿酸

鹽和甘露糖陰性；大多數(shù)馬鏈球菌獸疫亞種鏈球菌菌株具有下述特性：在富含淀

粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，V-P反應(yīng)陰性，6.5%Nacl抑制其生長，不能還原

0.1%的美藍，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不還原硝酸鹽，不液化明膠，水解精氨酸，發(fā)酵乳

糖、七葉苷、水揚酸、山梨醇產(chǎn)酸。不能發(fā)酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖，

見表4-1，目前已開發(fā)出商業(yè)化鑒定系統(tǒng)用于臨床鏈球菌分離株的鑒定，見

表4-2。但由于鏈球菌生化特征變化較大，所以只能作為豬鏈球菌病診斷的輔助

手段，鑒定豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種等致病性菌株時還應(yīng)結(jié)合細菌的生長特

征、菌體形態(tài)、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、生化鑒定和種特異性PCR等進

行最終判定。

表4-1主要病原鏈球菌的特性

6.5%NaCl

菌種蘭氏分群馬尿酸鈉七葉苷甘露醇山梨醇乳糖菊糖棉實糖海藻糖水楊苷

生長

無乳鏈球菌S.agalactiaeB-+---+--+(+)

10

6.5%NaCl

菌種蘭氏分群馬尿酸鈉七葉苷甘露醇山梨醇乳糖菊糖棉實糖海藻糖水楊苷

生長

牛鏈球菌S.bovisD--+d-+++d+

犬鏈球菌S.canisG--d--(+)--(+)

停乳鏈球菌S.dysgalactiaeC-----+--+-

停乳鏈球菌類馬亞種

C、G、L-----d--+(+)

S.dysgalactiaessp.equisimilis

馬鏈球菌馬亞種

C---------+

S.equissp.equi

馬鏈球菌獸疫亞種

C----++---+

S.equissp.zooepidemicus

馬鏈球菌類馬亞種

C

S.equissp.equisimilis

類豬鏈球菌S.ρorcinusE(P,U,V)

類馬鏈球菌S.equinusD--+---++d(+)

海豚鏈球菌S.iniae---+？---？++

肺炎鏈球菌S.pneumoniae---(+)--++++d

化膿鏈球菌S.pyogenesA---d-+--++

豬鏈球菌S.suisR、S--d--+(+)(+)++

乳房鏈球菌S.uberis-(+)++++++-++

注：+陽性反應(yīng)-陰性反應(yīng)（+）反應(yīng)緩慢d陽性或陰性因菌株而不同

表4-2用于病原鏈球菌鑒定的主要檢測系統(tǒng)

商品名稱分析形式制造商

APIStrep生化bioMerieux

ATBRapid32Strep生化bioMerieux

GPI生化bioMerieux

Biolog碳氧化Biolog

RapidID32STREP生化BD

Phoenix生化BD

Sherlock或MIDI氣相色譜MicrobialIDInc

WalkAway生化MicroScan

MID-62鏈球菌鑒定系統(tǒng)生化廣東環(huán)凱微生物科技有限公司

（3）臨床應(yīng)用

應(yīng)用該方法，項目組已經(jīng)對數(shù)百株臨床分離的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種

等豬鏈球菌病致病菌株進行了生化鑒定。如2020年對疑似SS進行培養(yǎng)、染色、

11

生化試驗、豬鏈球菌PCR鑒定、血清分型PCR鑒定，結(jié)果表明3株分離菌的生

化特性與豬鏈球菌相符（江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020）；2009年選取豬鏈球菌9型（SS9）

GZ0565株連續(xù)傳代培養(yǎng)至20代（S1～S20代），用API20Strep生化鑒定試劑

條和全自動生化分析儀對各代次之間進行了比較鑒定，結(jié)果表明傳代穩(wěn)定性好

（中國獸醫(yī)科學(xué)，2010）；2016年2月，上海市崇明區(qū)某鄉(xiāng)鎮(zhèn)一規(guī)模養(yǎng)豬場出

現(xiàn)40多頭5~8周齡仔豬發(fā)病死亡情況，經(jīng)細菌分離、分離菌株生化鑒定和PCR

檢測，確診為豬鏈球菌2型感染（中國動物檢疫，2017）。2007年從廣東各地

送檢病料中分離22株鏈球菌，開展了其血清群鑒定及生化特性等方面的研究，

鑒定出3株C群鏈球菌（中國獸藥雜志，2007）；結(jié)合培養(yǎng)特性、生化特性及

血清定型等對1997-1999上海地區(qū)分離出15株豬源鏈球菌進行了檢測鑒定，其

中4株為C群鏈球菌（中國獸醫(yī)學(xué)報，2001）；采用細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、

血清定型等方法對從上海14個豬場分離出19株鏈球菌進行鑒定，7株為C群

鏈球菌（上海畜牧獸醫(yī)，2001）。

結(jié)果證明，建立的生化鑒定方法操作簡便，與細菌PCR檢測等結(jié)果一致，

可以作為豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種等豬鏈球菌病病原菌鑒定的輔助手段。

5.豬鏈球菌2、7、9型玻片凝集試驗

（1）方法建立和依據(jù)

血清學(xué)分型是豬鏈球菌常規(guī)檢測的重要方法之一，以豬鏈球菌抗原抗體間的

特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，具有較高的敏感性和特異性。常用的方法有玻片凝集、

試管凝集、協(xié)同凝集試驗以及免疫印跡分析，此外還有人建立了酶聯(lián)免疫吸附試

驗（ELISA）的方法用于檢測豬鏈球菌,其中，應(yīng)用最為廣泛的是玻片凝集試驗。

玻片凝集試驗是將已知診斷血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分鐘

后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即判為陽性。此法快速、簡便，適用于新分離菌的

鑒定和分型。

莢膜多糖是豬鏈球菌血清學(xué)分型的重要依據(jù)，也是制備型特異性抗血清的重

要抗原。根據(jù)莢膜多糖抗原性不同可將豬鏈球菌分成27個血清型，每個血清型的

莢膜多糖都是由糖苷鍵連接寡糖重復(fù)單元而成的結(jié)構(gòu)不同的多糖。根據(jù)HigginsR,

GottschalkM.AnupdateonStreptococcussuisidentification[J].JournalofVeterinaryDiagnostic

12

Investigation,1990,2(3):249-252.；陳國強,張敬友,張常印,等.GB/T19915.1-2005.豬鏈

球菌2型平板和試管凝集試驗操作規(guī)程[s].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005等文獻，采

用菌體外層莢膜多糖完整的豬鏈球菌2型、7型和9型參考菌株（菌株信息見表5-1）

作為抗原進行多次重復(fù)免疫清潔級新西蘭白兔，可獲得豬鏈球菌2型、7型和9型

參考菌株的高免血清（與濃度為4×109cfu/mL的參考菌株進行試管凝集，效價應(yīng)

大于1:32），即為血清型特異性定型血清，該血清可應(yīng)用于玻片凝集試驗。

中國動物與流行病學(xué)中心已成功制備了豬鏈球菌2型、7型和9型特異性定型

血清，并于2008年在《中國動物檢疫》雜志發(fā)表《豬鏈球菌35個血清型標(biāo)準(zhǔn)抗血

清的制備及應(yīng)用》，應(yīng)用該特異性定型建立了豬鏈球菌2型、7型和9型玻片凝集

試驗。

（2）敏感性與特異性

采用豬鏈球菌2型、7型和9型的玻片凝集試驗，檢測29個豬鏈球菌參考

菌株和無乳鏈球菌1886（groupB）、停乳鏈球菌ATCC9926（groupC）、馬鏈

球菌獸疫亞種ATCC35246（groupC）、變形鏈球菌UA159（groupC）。29個豬

鏈球菌參考菌株從加拿大蒙特利爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院引進，具體信息見表5-1。

表5-129個血清型菌株

豬鏈球菌參考菌株名稱血清型來源分離地區(qū)

4281病豬丹麥

26511/2病豬丹麥

7352病豬丹麥

49613病豬丹麥

64074病豬丹麥

115385病豬丹麥

25246病豬丹麥

80747病豬丹麥

146368病豬丹麥

220839病豬丹麥

441710病豬丹麥

1281411病豬丹麥

883012病豬丹麥

1058113病豬丹麥

1373014病豬丹麥

NCTC1044615病豬荷蘭

272616病豬丹麥

93A17外表健康豬加拿大

NT7718外表健康豬加拿大

13

豬鏈球菌參考菌株名稱血清型來源分離地區(qū)

42A19外表健康豬加拿大

14A21外表健康豬加拿大

89-247923病豬加拿大

88-5299A24病豬加拿大

89-3576-325病豬加拿大

89-525927病豬加拿大

89-59028病豬加拿大

92-119129病豬加拿大

92-140030病豬加拿大

92-417231病牛犢加拿大

結(jié)果顯示，豬鏈球菌2型參考菌株（735）為豬鏈球菌2型血清學(xué)定型陽性，

其余均為陰性；豬鏈球菌7型參考菌株（8074）為豬鏈球菌7型血清學(xué)定型陽性，

其余均為陰性；豬鏈球菌9型參考菌株（22083）為豬鏈球菌9型血清學(xué)定型陽

性，其余均為陰性?？梢姡i鏈球菌2型、7型和9型的玻片凝集試驗均具有較

好的敏感性和特異性。

（3）檢測下限

豬鏈球菌2型、7型和9型參考菌株經(jīng)THB液體培養(yǎng)后，測定菌體濃度，

使用PBS對菌液進行10倍稀釋至1×107CFU/mL~1CFU/mL。分別滴加豬鏈球菌

2型、7型和9型特異性定型血清10μL至載玻片，與10μL稀釋的豬鏈球菌2型、

7型和9型參考菌株菌液進行玻片凝集試驗，測定豬鏈球菌2型、7型和9型玻

片凝集試驗檢測下限。結(jié)果顯示，豬鏈球菌2型、7型和9型玻片凝集試驗的最

低檢測下限均為1×105CFU/mL。

（4）臨床應(yīng)用

應(yīng)用該方法，中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心已經(jīng)對數(shù)百株臨床分離的豬鏈球

菌進行2型、7型和9型鑒定。如：2006年，隨機采集重慶市17個區(qū)縣（市）

定點屠宰場表觀健康豬的腭扁桃體1360份，進行豬鏈球菌的分離鑒定，共分離

出豬鏈球菌菌株225株，分離率為16.54%，檢出豬鏈球菌2型4株，豬鏈球菌7

型3株，豬鏈球菌9型3株（重慶地區(qū)表觀健康豬的豬鏈球菌的檢測，畜牧獸醫(yī)

學(xué)報，2010年）；2007-2008年，從我國20個不同地區(qū)屠宰場采集248份扁桃

體，進行增菌培養(yǎng)后用PCR方法進行豬鏈球菌種型鑒定并用血清凝集試驗復(fù)檢，

共檢出14株豬鏈球菌，其中3株為豬鏈球菌2型，2株為豬鏈球菌7型,1株為

豬鏈球菌9型（表觀健康豬群攜帶豬鏈球菌情況流行病學(xué)調(diào)查，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)

14

報，2009年）。

豬鏈球菌2型、7型和9型的玻片凝集試驗在豬鏈球菌病的診斷中具有敏感

性好、特異性好、操作簡便的特點，且為豬鏈球菌2型、7型和9型的血清型鑒

定的金標(biāo)準(zhǔn)。

6.豬鏈球菌通用PCR試驗

（1）方法建立和依據(jù)

參考文獻（OkuraM,etal.,:CurrentTaxonomicalSituationofStreptococcussuis.

Pathogens2016,5(3).），編碼DNA修復(fù)酶的recN基因是豬鏈球菌的種特異性基

因。本研究將recN基因作為靶基因，建立了豬鏈球菌的種特異性PCR試驗，經(jīng)

驗證敏感性高、特異性強、臨床應(yīng)用效果好。

（2）特異性

本試驗對豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、多動物鏈球菌、嗜

水氣單胞菌、肺炎克雷伯菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌的液體培養(yǎng)物進行已建立的

豬鏈球菌種特異性PCR鑒定方法，評估該方法的特異性。如下圖所示，除豬鏈

球菌擴增出336bp條帶，其他種屬細菌檢測結(jié)果均為陰性，該方法特異性強。

圖6-1豬鏈球菌通用PCR特異性試驗

（M：Trans2Kmark；1：豬鏈球菌；2：馬鏈球菌獸疫亞種；3：無乳鏈球菌；4：多動物鏈球菌；5：嗜水

氣單胞菌；6：肺炎克雷伯菌；7：停乳鏈球菌；8：大腸桿菌；N：空白對照）

（3）檢測下限

8

本試驗將豬鏈球菌培養(yǎng)至OD600=0.6，其菌量濃度為1.4×10cfu/mL。將菌液

進行10倍比稀釋成1.4×108至1.4×103cfu/mL6個系列濃度梯度，分別進行PCR

15

試驗。如下圖所示，PCR體系所用模板為2μL，所以豬鏈球菌種特異性PCR鑒

定方法檢測下限可達2.8×104cfu。

6-2豬鏈球菌通用PCR敏感性試驗

（M：Trans2Kmark；1：1.4×108cfu/mL；2：1.4×107cfu/mL；3：1.4×106cfu/mL；4：1.4×105cfu/mL；

5：1.4×104cfu/mL；6：1.4×103cfu/mL；N：陰性對照）

（4）臨床應(yīng)用

對實驗室收集的131份屠宰場健康豬扁桃體進行豬鏈球菌的分離培養(yǎng)，用建

立的豬鏈球菌種特異性PCR試驗對樣品進行檢測。試驗結(jié)果顯示，131份樣品

中豬鏈球菌陽性樣品為82份，占比62.59%，共分離豬鏈球菌68株。此結(jié)果說

明該方法敏感性高，特異性強，能夠準(zhǔn)確有效地對豬鏈球菌進行鑒定。

7.豬鏈球菌2型PCR試驗

（1）方法建立和依據(jù)

參考文獻（OkuraM,etal.,:Geneticanalysisofcapsularpolysaccharide

synthesisgeneclustersfromallserotypesofStreptococcussuis:potentialmechanisms

forgenerationofcapsularvariation.Appliedandenvironmentalmicrobiology2013,

79(8):2796-2806.），莢膜多糖合成相關(guān)基因簇cps2I基因是豬鏈球菌2型或1/2型

的血清型特異性基因；cpsK基因是2型和1/2型的鑒別基因，豬鏈球菌2型該基

因的479-483bp位置序列為5’-CCTGG-3’，可被限制性核酸內(nèi)切酶MvaI識別，

豬鏈球菌1/2型該基因的479-483bp位置序列為5’-CCTGC-3’或5’-CCTGT-3’，

不能被識別。本研究以莢膜多糖合成相關(guān)基因簇cps2I、cpsK基因作為靶基因，

進行豬鏈球菌2型的鑒定，以cpsK基因片段的限制性核酸內(nèi)切酶MvaI酶切條

16

帶作為鑒別兩種血清型的依據(jù)，建立了豬鏈球菌2型和1/2型的鑒定方法。

（2）特異性

本試驗對豬鏈球菌2型、1/2型、7型、9型、8型、31型，馬鏈球菌獸疫亞

種，無乳鏈球菌，多動物鏈球菌，嗜水氣單胞菌，肺炎克雷伯菌，停乳鏈球菌，

大腸桿菌的液體培養(yǎng)物，以cps2I基因引物進行PCR擴增，建立豬鏈球菌2型鑒

定方法，評估該方法的特異性。如下圖所示，除豬鏈球菌2型和1/2型擴增出363

bp條帶，其他血清型豬鏈球菌及其他種屬細菌均為陰性；豬鏈球菌2型的cpsK

片段經(jīng)酶切后呈347bp和139bp兩個條帶，1/2型的cpsK片段經(jīng)酶切后仍呈486

bp的條帶，該方法特異性強。

7-1豬鏈球菌2型/1/2型PCR特異性試驗

（M：Trans2Kmark；1：豬鏈球菌2型；2：豬鏈球菌1/2型；3：豬鏈球菌7型；4：豬鏈球菌9型；5：

豬鏈球菌8型；6：豬鏈球菌31型；7：馬鏈球菌獸疫亞種；8：無乳鏈球菌9：多動物鏈球菌；10：嗜水

氣單胞菌；11：肺炎克雷伯菌；12：停乳鏈球菌；13：大腸桿菌；N：空白對照）

17

圖7-2豬鏈球菌2型cpsK片段經(jīng)酶切試驗

（M：Trans2Kmark；1：豬鏈球菌2型cpsK片段；2：豬鏈球菌2型cpsK片段經(jīng)酶切后；

3：豬鏈球菌1/2型cpsK片段；豬鏈球菌1/2型cpsK片段經(jīng)酶切后；N：空白對照）

（3）檢測下限

8

本試驗將豬鏈球菌2型培養(yǎng)至OD600=0.6，其菌量濃度分別是1.4×10cfu/mL。

將菌液分別10倍比稀釋成1.4×108至1.4×103cfu/mL6個系列濃度梯度，分別

進行PCR試驗。如下圖所示，PCR體系所用模板為2μL，所以豬鏈球菌2型PCR

鑒定方法檢測下限可達2.8×103cfu。

圖7-3豬鏈球菌2型PCR敏感性試驗

（M：Trans2Kmark；1：1.4×108cfu/mL；2：1.4×107cfu/mL；3：1.4×106cfu/mL；4：1.4×105cfu/mL；

5：1.4×104cfu/mL；6：1.4×103cfu/mL；N：空白對照）

18

（4）臨床應(yīng)用

對實驗室收集的378份屠宰場健康豬扁桃體進行豬鏈球菌的分離培養(yǎng)及血

清型鑒定，共分離339株豬鏈球菌，用建立的豬鏈球菌2型鑒定試驗對菌株進行

檢測。試驗顯示，分離株中共有27株血清型為2型。此結(jié)果說明該方法敏感性

高，特異性強，能夠準(zhǔn)確有效地對豬鏈球菌2型進行鑒定。

8.豬鏈球菌7型PCR試驗

本方法以豬鏈球菌7型莢膜多糖基因中cps7H為靶基因，可用于豬鏈球菌7

型PCR分型試驗，經(jīng)驗證敏感性高，特異性強，臨床使用效果好。

（1）方法建立和依據(jù)

通過分子雜交技術(shù)對比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基因簇的

基因組，發(fā)現(xiàn)莢膜多糖合成相關(guān)基因簇的cps7H基因是豬鏈球菌7型的血清型特異

性基因，可用于血清型特異性PCR檢測（Smith,H.E.,etal.,RapidPCRtestfor

Streptococcussuisserotype7.FEMSMicrobiolLett,1999.178(2)）。本研究根據(jù)

GenBank公布的豬鏈球菌cps7H基因序列（JX986796.1），設(shè)計了針對豬鏈球菌

cps7H基因的特異性引物，并通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度等反應(yīng)體系和條件，

建立了cps7HPCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性等性能進行了評估，

可用于豬鏈球菌7型PCR分型檢測。

（2）特異性

分別以豬大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌7型、豬沙門氏菌、波氏桿

菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌2型及豬鏈球菌9

型等菌液或基因組核酸為模板，用已建立的PCR方法進行檢測，評估該方法的

特異性；結(jié)果顯示，除了豬鏈球菌7型菌株擴增出542bp條帶，豬鏈球菌其他

血清型及其他細菌檢測結(jié)果均為陰性（圖8-1）。

19

123456789NM

bp

2000

1000

750

500

250