綠豆源成分檢測定性PCR法2018-12-01實(shí)施2018-12-01實(shí)施天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、陳笑蕓、王成、趙新、蘭璞、王永、王慶平、汪小福、黃鳳軍、秦志12規(guī)范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法4原理5試劑和材料5.1除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。5.21mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入8.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后，冷卻至室溫，再5.3CTAB-Abuffer:將4g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、16.4g氯化鈉(NaC1)、3.15g三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HC1)、1.5g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)依次加入到100mL無菌去離子水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液(見5.1)調(diào)pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌15min。5.4CTAB-Bbuffer:將1g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、0.5g氯化鈉(NaC1)、依次加入到100mL無菌去離子水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液(見5.1)調(diào)pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa (121℃)條件下滅菌15min。25.51.2mmol/LNaC1溶液：將7g氯化鈉(NaC1)溶于100mL無菌去離子水中。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌15min。5.670%乙醇：將737mL95%乙醇，加水定容至105.7500mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):稱取18.6g乙二胺四乙酸二鈉，加入70mL水中，緩慢滴加氫氧化鈉溶液(見5.1)直至EDTA-Na2完全溶解，用氫氧化鈉溶液(見5.1)調(diào)pH至8.0,加水定容至100mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。5.81mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HC1)溶液(pH8.0):稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌5.9TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見5.7)和2mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見5.6),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。5.1110g/L溴化乙錠(EB)溶液：稱取1.0g溴化乙錠，溶解于100mL水中，避光保存。溴化乙錠5.1250×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見5.6),用冰乙酸調(diào)pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使5.13加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍(lán)，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲基苯腈藍(lán)，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解?；旌弦陨先N溶液，加水定容至100mL,在4℃下保存。5.14DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：可以清楚區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段。體積混合。5.16TaqDNA聚合酶、PCR擴(kuò)增緩沖液及25mmol/L氯化鎂(MgC12)溶液。——Mungbean_470bp_F:5′-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3——Mungbean_470bp_R:5'-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-——預(yù)期擴(kuò)增片段大小為470bp,參見附錄A5.18引物溶液：用TE緩沖液(見5.8)或水分別將上述引物稀釋到10μmol/L。5.21定性PCR試劑盒。6儀器6.1分析天平：重感0.1g和0.1mg。6.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s,孔間溫度差異<1.0℃。6.3電泳槽、電泳儀等電泳裝置。6.6重蒸餾水發(fā)生器或超純水儀。37.1DNA提取buffer,充分混勻；加入20μL蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻，65℃水浴1h,間期混勻三次；加入20μLRNaseA(10mg/mL),充分混勻，65℃水浴10min;16000g離心10min;轉(zhuǎn)移上清液至新的2.0mL離心管中，加入500μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心10min;轉(zhuǎn)移500μL上清液至新的2.0mL離心管中，加入500μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心5min,轉(zhuǎn)移上清液至新的2.0mL離心管中，加入2倍體積的CTAB-Bbuffer,吹打混勻，室溫靜置60min;16000g離心5min,棄上清液；沉淀中加入350μL1.2mmol/LNaCl,再加入350μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液至新的潔凈2.0mL離心管中：加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻；16000g離心10min,棄上清液；加入500μL70%乙醇，顛倒混勻：16000g離心10min,棄上清液：室溫靜置至管內(nèi)水分7.2DNA的濃度和質(zhì)量7.3PCR擴(kuò)增7.3.1.1每一個(gè)試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。7.3.1.2在PCR反應(yīng)管中按附錄B依次加入反應(yīng)試劑，混勻，再加25μL石蠟油(有熱蓋設(shè)備的PCR儀可不加)。7.3.1.3將PCR管放在離心機(jī)上，500g～3000g離心10s,然后取出PCR7.3.1.4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共進(jìn)行35次循環(huán)，72℃延伸7min。(可根據(jù)儀器和試劑要求對反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。)7.3.2.1在試樣PCR擴(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性7.3.2.3除模板外，其余組分與PCR擴(kuò)增與7.2.1相同。7.4PCR產(chǎn)物電泳檢測瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固合成泳檢測。47.6PCR產(chǎn)物回收7.7PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證8.2結(jié)果表述9檢出限本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限為1%(含靶序列樣品DNA/總樣品DNA)。5(資料性附錄)61GACAAGGAAGCAAAGTAGCAATGATATAAAATGTTCAGAATCAAATTGCAGAATCCATTA121ATAAAATTTTGTAATGCAGAAGTAAGGAAAAAGTAATGTGTCCATAACACTATCCTTGCG181CTCATACTAGCTCCCCAATTTGTTTGCCTCATGCTATTATTG241AATTCAATTCTAGATTGTAAGCACTTAAAAAATCAAGAATCTAAGAAAACAAATGCTGCA301ATGCAACCTCAACTGAAGGTAGTACAAACAGGATTGAGAAAAAGA361AAAAAAAAGGCATAAAGAAAGTTAGCCAGTTATCATAGTTCCAGCACCTTCATCAGTTAA421AATCTCGAGCAACA