長春工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文PAGEIV摘要大蒜在我國資源豐富，是我們常見的一種食物，也是重要的藥用植物，其中含黃酮類化合物、大蒜素等多種活性成分。本實驗以乙醇作為溶劑提取大蒜中的總黃酮，對其提取工藝條件進行研究。首先對水提取法、乙醇回流提取法以及超聲波輔助乙醇回流提取法進行對比，確定了超聲波輔助乙醇提取法為最佳提取方法；并通過單因素試驗探討超聲波處理時間、提取次數(shù)、料液比、提取溫度、乙醇濃度及提取時間對總黃酮得率的影響，然后又通過響應(yīng)面分析確定了超聲波輔助乙醇回流提取法的最佳工藝條件：料液比1:19，提取溫度67℃，乙醇濃度為80%，總黃酮得率達到1.32%。然后采用AB-8大孔吸附樹脂進行純化，同時進行紫外光譜和紅外光譜實驗分析，初步確定了大蒜黃酮主要為橙酮類。最后進行抗氧化試驗和抑菌試驗，證明大蒜總黃酮有比較強的抗氧化活性和較好的抑菌效果。與研究比較多的大蒜素相比，大蒜黃酮沒有刺激性氣味，將來可以作為功能性食品的基礎(chǔ)原料。關(guān)鍵詞:大蒜總黃酮；響應(yīng)面；純化；抗氧化；抑菌

ExtractionandPurificationoftheTotalFlavonesinGarlicAbstractGarlicAlliumisarichresourceinChina.Itisnotonlyakindofmostcommonfoodsbutalsoimportantmedicinalplants.Itcontainsflavonoids,allicinandotheractiveingredients.Thisexperimentuseethanolasextractivesolventtoextractthetotalflavonoids,andstudytheoptimalextractionconditions.Atfirst,comparedwaterextraction,ethanolextractionandultrasonicassistedethanolextractionweretodeterminetheoptimumextractionmethodwasethanolextraction.Thentheeffectionofextractiontemperature,solidtoliquidratio,extractiontimes,andethanolconcentrationontheyieldoftotalflavonoidswasinvestigatedbysinglefactortestandtheoptimumextractionconditionswithethanolassolventwasdeterminedbyaresponsesurfaceanalysis.Theresultwasliquidratio1:19,extractiontemperature67℃,82%ethanol,lavonesextractionratereached1.32%.TheAB-8macro-porousresinwasusedtopurify,UVandIRspectraanalysisinitiallyidentifiedgarlicflavonoidswhichwasorangeketones.Finally,inhibitoryeffectofthetotalflavonoidsingarlicwasdeterminedbytheantibacterialtest.Theresultprovedthatgarlichadstrongoxidationresistanceandbetterantibacterialeffects.Garlicflavonoidshadnoirritatingodorcomparedwiththeallicinstudiedmoreandtheycouldbeusedasthebasicrawmaterialinfunctionalfoods.Keywords:Garlicflavonoids;Responsesurface;Purification;Antioxidantactivity;Antibacterialactivity目錄摘要 IAbstract II1文獻綜述 11.1大蒜的概述 11.2大蒜的主要化學(xué)成分 11.2.1黃酮類化合物 21.2.2有機硫化物 21.2.3類固醇皂苷 21.2.4氨基酸 21.2.5有機鍺 21.2.6硒 31.2.7礦物元素 31.3大蒜的生理功能及作用 31.3.1防治心腦血管疾病 31.3.2預(yù)防癌癥和抗癌作用 31.3.3抗衰老作用 31.3.4降血脂作用 41.3.5保護肝臟作用 41.3.6提高機體免疫力 41.3.7預(yù)防感冒 41.4大蒜的國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 41.5黃酮類化合物的概述 51.5.1黃酮類化合物的分類 51.5.2黃酮類化合物的提取 61.5.3黃酮類化合物的測定 71.6黃酮類化合物的生物活性 81.6.1抗氧化活性 81.6.2抗腫瘤活性 81.6.3抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性 91.6.4抗病毒活性 91.6.5對心血管疾病的作用 91.6.6解毒護肝和細胞保護作用 91.6.7抗菌作用 101.7研究意義 102實驗材料與方法 122.1實驗材料 122.1.1實驗原料 122.1.2實驗試劑與設(shè)備與儀器 122.3實驗方法 132.3.1原料預(yù)處理 132.3.2預(yù)實驗 132.3.3大蒜總黃酮含量的測定 142.3.4大蒜總黃酮提取工藝的確定 152.3.5大蒜總黃酮的純化工藝研究 172.3.6大蒜純化樣品的紫外光譜及紅外光譜實驗 182.3.7大蒜總黃酮的生物活性研究 183結(jié)果分析與討論 203.1預(yù)實驗結(jié)果分析 203.1.1大蒜中活性成分的鑒定結(jié)果 203.1.2提取方法選擇結(jié)果 203.2大蒜總黃酮含量的測定 203.3大蒜總黃酮提取工藝確定結(jié)果分析 223.3.1單因素試驗 223.3.2響應(yīng)面實驗分析結(jié)果 263.4大蒜總黃酮的純化工藝研究 303.4.1大孔吸附樹脂的選擇結(jié)果分析 303.4.2乙醇濃度對解析效果的影響 303.4.3大蒜總黃酮得率的測定 313.5大蒜純化樣品的紫外光譜及紅外光譜分析 323.5.1紫外吸收光譜圖分析 323.5.2紅外吸收光譜圖分析 323.6大蒜總黃酮的生物活性研究 333.6.1大蒜總黃酮的抗氧化性分析 333.6.2大蒜中黃酮的抑菌效果分析 34結(jié)論 35致謝 36參考文獻 371文獻綜述1.1大蒜的概述大蒜（Garlic），多年生草本植物，百合科蔥屬。地下鱗莖分瓣，按皮色不同分為紫皮種和白皮種。其辛辣，有刺激性氣味，可食用或供調(diào)味，亦可入藥。大蒜在西漢時從西域傳入我國，經(jīng)人工栽培繁育深受大眾喜食。蒜以鱗莖入藥，春、夏采收，懸掛通風(fēng)處，陰干備用。蒜喜濕怕旱，宜選擇疏松的沙質(zhì)土壤、排水良好、有機質(zhì)豐富的地塊栽培。大蒜的品種很多，按照鱗莖外皮的色澤可分為紫皮蒜與白皮蒜兩種。紫皮蒜的蒜瓣少而大，辛辣味濃，產(chǎn)量高，多分布在華北、西北與東北等地，耐寒力弱，多在春季播種，成熟期晚；白皮蒜有大瓣和小瓣兩種，辛辣味較淡，比紫皮蒜耐寒，多秋季播種，成熟期略早。大蒜的成齡植株，是由葉身、假莖、鱗芽、花萼和莖盤組成鱗莖大形，具有6-10瓣，外包灰白色或淡紫色于膜質(zhì)鱗被。葉基生，實心，扁平，線狀披針形，寬約2.5厘米左右，基部呈鞘狀?；ㄇo直立，高約60厘米，種子黑色?；ㄆ谙募?。大蒜不能產(chǎn)生種子，生產(chǎn)上采用營養(yǎng)繁殖的方法，所以它的生長動態(tài)與其它蔥蒜類蔬菜都不相同。我國大蒜的主要產(chǎn)地：江蘇省邳州市、射陽縣、太倉市，山東省濟寧市金鄉(xiāng)縣、萊蕪市、商河縣、蒼山縣（臨沂市）、廣饒縣（東營市）、茌平縣、成武縣，濰坊市的安丘，河北永年縣、大名縣北部，河南省杞縣、中牟縣賀兵馬村，上海嘉定，安徽亳州市、來安縣，四川溫江縣、彭州市，云南大理、陜西興平市及新疆等地。它原產(chǎn)地在西亞和中亞，自漢代張騫出使西域，把大蒜帶回國安家落戶，至今已有兩千多年的歷史?！侗静萁?jīng)疏》[1]記載：“入足陽明、太陰、厥陰經(jīng)”。具有行滯氣，暖脾胃，消癥積，解毒。治飲食積滯，脘腹冷痛，水腫脹滿，癰疽腫毒，白禿癬瘡，蛇蟲咬傷。行氣消積，殺蟲解毒。用于感冒、菌痢、阿米巴痢疾、腸炎、飲食積滯、癰腫瘡瘍等功效。用法為煎湯，1.5-3錢；生食、煨食或搗泥為丸。外用：搗敷、作栓劑或切片灸。宜忌陰虛火旺者，以及目疾、口齒、喉、舌諸患和時行病后均忌食。1.2大蒜的主要化學(xué)成分[2]大蒜中含有的有效成分為黃酮類化合物，另外大蒜中還含有大量的揮發(fā)油，其中含硫揮發(fā)物43種，硫化亞磺酸酯類13種、氨基酸9種、肽類8種、甙類12種、酶類11種。大蒜具有防治腫瘤和癌癥、強力殺菌、降血壓、降膽固醇、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗血栓形成、防治糖尿病、保護心血管等功能。1.2.1黃酮類化合物黃酮類化合物具有多種生物活性，如抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性、抗炎及鎮(zhèn)痛活性、抗菌及抗病毒活性、抗心血管系統(tǒng)疾病[3]等。大量研究表明黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機體免疫力、鎮(zhèn)咳、祛痰等藥理活性。1.2.2有機硫化物大蒜有機硫化物分為揮發(fā)性化合物和非揮發(fā)性化合物。其中揮發(fā)性化合物包括脂溶性有機硫化物和硫代亞磺酸酯類等含硫化合物[4]；脂溶性有機硫化物按含硫原子數(shù)目分為一硫化物、二硫化物、三硫化物、四硫化物[5]。硫代亞磺酸酯類主要有二烯丙基硫代亞磺酸酯、甲基烯丙基硫代亞磺酸酯、烯丙基甲基硫代亞磺酸酯等[4]。非揮發(fā)性化合物包括水溶性有機硫化物，主要有S-烯丙基-L-半胱氨酸(SAC)、S-烯丙基巰基-L-半胱氨酸(SAMC)[6]。1.2.3類固醇皂苷類固醇皂苷以其糖苷配基的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)分為兩大類：呋甾皂苷(Furostanolspooning)和螺甾皂苷(Spirostanolspooning)。呋甾皂苷主要有：Proto-eruboside-B[7]，Proto-iso-eruboside-B，Sativoside-B1，Proto-desgalactotigonin。螺甾皂苷有：Eruboside-B，Iso-eruboside-B[8]，Sativoside-R1，Sativoside-R2[9]。大蒜提取物中也分離出一系列的類固醇皂苷和皂苷配基。1.2.4氨基酸大蒜中的氨基酸主要分為2類：一類是組成蛋白質(zhì)的氨基酸，另一類是非蛋白質(zhì)氨基酸。前者主要包括半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、胱氨酸和纈氨酸等，以前3種含量較高[10]。非蛋白質(zhì)氨基酸主要有S-取代半胱氨酸，如蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，SACS），還有脫氧蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸，SAC),(+)-S-(反-1-丙烯基)-L-半胱氨酸亞砜和S-烯丙巰基半胱氨酸等[11]。1.2.5有機鍺大蒜是有機鍺含量極高的植物。人參中含有極高的有機鍺，而蒜的有機鍺含量是人參的3倍。有機鍺能迅速吸收氧氣，供給體內(nèi)各器官，明顯的抗癌作用，同時加強生命體的免疫機能及降低血壓的功能。1.2.6硒大蒜含有微量元素硒，能使人體產(chǎn)生大量谷胱甘肽。硒具有靶向性，通過增高細胞中環(huán)腺甘酸的水平，造成抑制癌細胞分裂和增殖的作用，并可以自動識別癌細胞，阻斷能量供應(yīng)，使其因能量枯竭而死亡，而對正常的細胞沒有殺傷作用。因此，硒被世界衛(wèi)生組織稱為“抗癌之王”。另外大蒜中還有有機硒化物包括以硒半胱氨酸為活性中心的硒蛋白和其他形態(tài)的含硒化合物[12]。1.2.7礦物元素大蒜中含有豐富的礦物質(zhì)元素，其中含量以磷為最高，其次為鎂、鈣、鐵、硅、鋁和鋅等18]。1.3大蒜的生理功能及作用1.3.1防治心腦血管疾病大蒜可防止心腦血管中的脂肪沉積，誘導(dǎo)組織內(nèi)部脂肪代謝，增加纖維蛋白溶解活性，降低膽固醇，抑制血小板的聚集，降低血漿濃度，增加微動脈的擴張度，促使血管舒張，調(diào)節(jié)血壓，增加血管的通透性，從而抑制血栓的形成和預(yù)防動脈硬化。大蒜可幫助保持體內(nèi)一種酶的適當(dāng)數(shù)量而避免出現(xiàn)高血壓。1.3.2預(yù)防癌癥和抗癌作用大蒜在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最早用作抗癌藥物是20世紀50年代，發(fā)現(xiàn)大蒜中的硫代亞磺酸酯能夠抑制腫瘤細胞生長[13]。近年來，有關(guān)大蒜防癌、抗癌作用的研究日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，對大蒜抑制腫瘤細胞生長和增殖(抗腫瘤作用)研究取得了顯著的成果。大蒜可以減少各種組織和器官，如皮膚、乳房、結(jié)腸、結(jié)腸、食道、前列腺、膀胱、肺、肝及胃等患惡性腫瘤或癌癥的風(fēng)險[14]。1.3.3抗衰老作用大蒜里的某些成份，有類似維生素E與維生素C的抗氧化，防衰老特性。研究發(fā)現(xiàn)大蒜中超氧化物歧化酶(SOD)含量豐富，大蒜的SOD活力為21.73（U/g）[15]。SOD是一種源于生物體的抗氧化、抗衰老的活性物質(zhì)，能清除生物體在新陳代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。所以大蒜具有良好的抗氧化、抗衰老的作用。1.3.4降血脂作用徐彩菊[16]研究大蒜粗提物作為保健食品的降脂減肥作用。結(jié)果表明，大蒜粗提物0.2、0.4和1.2g/kg劑量組能明顯降低高血脂大鼠血清膽固醇（TC）含量；0.4、1.2g/kg劑量組能明顯降低血清甘油三酯（TG）含量，同時也明顯降低肥胖大鼠的體重、增重和體內(nèi)脂肪濕重；1.2g/kg劑量組能明顯降低肥胖大鼠的體脂比，其機制可能與調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝有關(guān)。胡獻國[17]指出，大蒜中的蒜素能夠降低血液中有害膽固醇含量，能預(yù)防動脈硬化，降低血糖和血脂。美國科學(xué)家曾對400例冠狀動脈硬化且發(fā)生過一次心肌梗死的患者進行試驗，一半人每日服加大蒜汁的牛奶，另一半人服不加蒜汁的牛奶，3年后者死亡率較前者高一倍。加大蒜汁組既降低了血壓，又減少了心臟病的發(fā)病率。1.3.5保護肝臟作用大蒜具有提高肝臟解毒能力的作用，有助于進入人體內(nèi)的重金屬排出，防止汞、鎘等被腸壁吸收。大蒜具有降低人體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的作用，可以消除病毒性肝炎所引起的黃疸。大蒜中的微量元素硒，通過參與血液的有氧代謝，清除毒素，減輕肝臟的解毒負擔(dān)，從而達到保護肝臟的目的。1.3.6提高機體免疫力大蒜能激活人體巨噬細胞功能。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜注射液對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬機能有明顯促進作用，而且淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和玫瑰花瓣狀反應(yīng)均顯著提高。大蒜中硒元素是谷胱甘肽過氧化酶的主要組成成分，其抗氧化能力比維生素E高500倍，對細胞膜有防護作用，參與輔酶A和輔酶Q的合成，從而提高機體免疫力。1.3.7預(yù)防感冒大蒜制劑對預(yù)防感冒有明顯效果。大蒜辣素對病原菌和寄生蟲有良好殺滅作用，可預(yù)防感冒，減輕發(fā)燒、咳嗽、喉痛及鼻塞等感冒癥狀。日本研究人員對小鼠進行試驗表明，大蒜具有阻止病原體侵入的作用，即使感染了感冒病毒，大蒜也有阻止發(fā)病的功能。1.4大蒜的國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀在古代就有許多關(guān)于大蒜的描述，在《本草經(jīng)疏》中記載：“入足陽明、太陰、厥陰經(jīng)”。在《綱目》有關(guān)大蒜的描述為“入太陰、陽明”。可以說大蒜的藥用功效非常大。但是，大蒜含物質(zhì)較多成分復(fù)雜，分離較難，對其各種有效成分研究相應(yīng)較少，國內(nèi)主要是對其綜合價值的研究。國外的科學(xué)家們對大蒜的研究也給予了高度的重視，從藥理、臨床、應(yīng)用等各個領(lǐng)域進行了比較深入系統(tǒng)的研究，獲得了大量的研究成果，進一步證明了大蒜不僅是一種優(yōu)良的保健食品，而且是一種具有廣泛用途的天然藥品。臨床應(yīng)用治療感染性疾病。賈鵬應(yīng)用大蒜素注射液靜脈滴注，輔以中藥灌腸治療真菌性腸炎12例，結(jié)果痊愈10例，好轉(zhuǎn)2例，總有效率100％。韓旭等應(yīng)用大蒜素膠囊13服，配合中藥沖洗坐浴，治療念珠菌性外陰陰道炎618例。輕、中、重癥有效率分別為100％、93.8％、70.83％。1.5黃酮類化合物的概述黃酮類化合物是一類植物中分布很廣且重要的天然產(chǎn)物，是具有2-苯基色原酮（flavone）結(jié)構(gòu)的化合物。分子中含有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在。絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及低于異物侵襲等方起重要的作用。有關(guān)黃酮類化合物的報道最早見著1962年，近幾十年，又有許多關(guān)于黃酮類化合物的專著相繼問世。由于黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用，早在17世紀，黃酮得到廣泛而深入的研究。1.5.1黃酮類化合物的分類[19](1)黃酮和黃酮醇類黃酮和黃酮醇廣發(fā)分布在各種植物中，是最典型的兩類黃酮化合物。黃酮類是以2-苯基色原酮為基本母核，3位無氧取代基。而黃酮醇類以2-苯基色原酮為基本母核，3位有含氧取代基。黃酮類化合物種類繁多，其種類多樣性的原因有以下三個因素：黃酮糖苷化的糖的種類不同；黃酮糖苷化的位點不同：單糖、雙糖或者多糖取代。主要從各種植物的葉、枝、果實、干、心木和根等組織中分離得到。(2)二氫黃酮二氫黃酮類化合物的主要特征：（1）黃酮的C2-C3雙鍵消失；（2）C2是手性碳。在天然產(chǎn)物中，絕大部分二氫黃酮的B環(huán)都是朝向紙面內(nèi)的，為α構(gòu)象。相反，朝向紙面外即為β構(gòu)象。主要分布于豆科，桑科等植物中。(3)二氫黃酮醇二氫黃酮醇即3-羥基二氫黃酮，其結(jié)構(gòu)變幻多樣，是很多黃酮類化合物的植物主要成分。主要分布于豆科，菊科，?？频戎参镏?。(4)花青素花青素是一類廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，與其他黃酮類化合物最大的不同之處是在其分子中含氧正離子。花青素被廣泛的應(yīng)用于飲料、糖果、果凍、果醬等食品工業(yè)?；ㄇ嗨氐膩碓磸V泛，花瓣、果實、葉子、根莖等都可獲得。(5)查爾酮類查爾酮類化合物是黃酮類化合物的一個分支，可在細分為查爾酮類和二氫查爾酮類。查爾酮類化合物在大多數(shù)植物中都存在，尤其是在花中作用突出，有些查爾酮是花中色素的主要成分。(6)橙酮類橙酮類是發(fā)現(xiàn)較晚的黃酮類化合物，由于橙酮母核的特點是結(jié)構(gòu)中含有苯并呋喃環(huán)，存在共軛體系，所以橙酮本身也顯黃色。(7)異黃酮類化合物異黃酮類化合物主要來源于豆科植物，這類化合物的特點是B環(huán)取代在C3位上。異黃酮的基本骨架為三苯基色原酮，屬于類黃酮化合物的一類次生代謝產(chǎn)物，可分為異黃酮、二氫異黃酮等。異黃酮類母體結(jié)構(gòu)圖黃酮類母體結(jié)構(gòu)圖黃烷類結(jié)構(gòu)母體圖黃酮醇類母體結(jié)構(gòu)圖1.5.2黃酮類化合物的提取[20]（1）水提法顧名思義，水提法就是加水在一定溫度下浸提。水提法的優(yōu)點是成本低、安全性高,適于工業(yè)生產(chǎn)。缺點是總黃酮提取率較低,易將可溶于水的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類提出,加大了進一步分離的困難,且易致霉變。此外,一些黃酮苷元難溶或不溶于水,不適于用水提法提取。（2）有機溶劑提取法對苷類和極性大的苷元如羥基黃酮、查耳酮、橙酮等，常用極性較大的溶劑如甲醇、乙醇或混合溶劑提取，對大多數(shù)苷元則用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性較小的溶劑提取。雖然有機溶劑對黃酮的提取率高，但缺點是大多有機溶劑都易燃易爆、多數(shù)有機溶劑具有強刺激性或有毒，會危害人體和污染環(huán)境、一般成本較高。（3）超聲波法超聲波提取技術(shù)的基本原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出。此外，超聲波的次級效應(yīng)，化學(xué)效應(yīng)等也能加速提取成分的擴散釋放，有利于提取。與常規(guī)提取法相比，具有提取時間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點。但超聲波提取對容器壁的厚薄及容器放置要求較高，否則會影響藥材的浸出效果，目前仍處于小規(guī)模實驗階段，要用于大規(guī)模生產(chǎn)，尚需進一步解決有關(guān)工程設(shè)備的問題。（4）微波提取法微波提取是利用不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在微波場中吸收微波能力的差異，使基體物質(zhì)中的某些區(qū)域或提取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被提取物質(zhì)從基體或體系中分離。此法的主要優(yōu)點是可有效地保護藥材中的功能成分，對提取物具有較高的選擇性，提取率高、提取速度快、省時，溶劑用量少、安全、節(jié)能、設(shè)備簡單，節(jié)省投資[21]。1.5.3黃酮類化合物的測定[19]黃酮的測定依據(jù)主要是黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),以及其顏色反應(yīng)。定量測定方法主要有比色法和高效液相色譜法。（1）黃酮類化合物的定性黃酮類化合物在其基本碳架上含有堿性氧原子,而絕大多數(shù)都是帶有酚性羥基的衍生物,因而能與某些金屬離子產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)和與某些較強的還原劑發(fā)生顏色反應(yīng)。因此,可以根據(jù)黃酮類化合物的這一特性對其進行定性鑒定。主要顏色反應(yīng)有:①紫外光下呈色反應(yīng)。取該樣品溶液點在濾紙上,在可見光下呈灰黃色,在紫外光下呈灰白色并有熒光斑點;②濃氨水反應(yīng)。取該樣品溶液點在濾紙上,將濾紙在氨水上方熏0.5min,立即在紫外光下觀察,呈極明顯的灰綠色熒光斑點;③三氯化鋁反應(yīng)。取樣品溶液點在濾紙上,滴加1%三氯化鋁乙醇溶液,吹干。在可見光下呈灰黃色,在紫外光下呈黃色熒光斑點;④乙酸鎂反應(yīng)。取樣品溶液點在濾紙上,滴加1%乙酸鎂甲醇溶液,吹干,紫外光下呈黃色斑點;⑤鹽酸一鎂粉反應(yīng)。取乙醇提取液lmL于試管中加鎂粉,再加入濃的鹽酸數(shù)滴(1次加入),在泡沫處呈紫紅色;⑥紙層析。取樣品溶液點在濾紙上。用正丁醇:醋酸:水=4:1:5為展開劑,上行展開5h,取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液,吹干后于紫外光下,可見熒光斑點。（2）比色法比色法測定總黃酮的原理:黃酮類化合物與鋁離子在堿性與亞硝酸根存在條件下形成黃酮的鋁絡(luò)合物,生產(chǎn)穩(wěn)定的黃色。在一定范圍內(nèi)黃色的深淺與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系,以蘆丁(對照品)作標準,于最大吸收波長處比色定量測定。（3）高效液相色譜法此方法比較簡單,提取物質(zhì)量一般,測定方法一般采用比色法或液相色譜法,比色法更為普遍。一些高效、方便快捷的提取新方法,如微波萃取法、酶解法、超臨界流體提取法,以及準確、靈敏的檢測方法,如極譜法、氣相色譜法、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細管電泳法等在大蒜黃酮研究中的應(yīng)用有待進一步研究。1.6黃酮類化合物的生物活性[19]1.6.1抗氧化活性人類心腦血管疾病、腫瘤、老年癡呆等疾病幾乎都與氧自由基有關(guān)。據(jù)最新研究顯示，黃酮類化合物清除自由基的作用機制主要與以下三個方面有關(guān)。（1）對體內(nèi)酶的作用。體內(nèi)許多氧化酶與自由基生成有關(guān)，而黃酮類化合物可特異地選擇與氧化酶結(jié)合，影響酶的構(gòu)象構(gòu)型，從而抑制酶的活性。有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物還可以通過增加體內(nèi)抗氧化物酶活性而達到抗氧化的目的。（2）對金屬離子的作用。從黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)來看，黃酮屬于多酚羥基化合物，因此相鄰的羥基或羰基上的氧原子可以作為配位原子同金屬離子配合形成五元或六元化合物，能清除引發(fā)活性自由基產(chǎn)生的鏈反應(yīng)中的催化劑。（3）終止自由基鏈反應(yīng)。黃酮類化合物在抗化作用中，不僅可以清除活性自由基和起催化作用的金屬離子，還可以抑制長生自由基的某些酶。更為重要的是，他可以通過酚羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基鏈反應(yīng)，這被認為是黃酮類化合物抗氧化作用的最主要的機制之一。1.6.2抗腫瘤活性抗腫瘤活性是黃酮類化合物藥理作用的另一個研究熱點。黃酮類化合物主要通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制癌基因表達等起到抗腫瘤的作用。抑制細胞在增值：主要表現(xiàn)在對腫瘤細胞具有細胞毒作用，而對正常細胞則無毒性和致突變作用，反而呈現(xiàn)抗氧化和正向免疫調(diào)節(jié)作用。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡:關(guān)于黃酮類化合物促腫瘤細胞凋亡的機制，有研究報道異黃酮類化合物可以通過激活細胞內(nèi)Ca2+誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑從而引發(fā)細胞凋亡。1.6.3抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性黃酮類化合物的抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性主要表現(xiàn)在以下幾方面。（1）對T細胞的作用?，F(xiàn)普遍認為T細胞的增殖主要受酪氨酸蛋白激酶的調(diào)節(jié)。酪氨酸蛋白激酶可以催化細胞內(nèi)酶作用底物的去磷酸化，繼而促進T細胞的增殖。而黃酮類化合物主要通過抑制酪氨酸蛋白激酶的活性而抑制T細胞的增值，繼而起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用(2)對B細胞的影響。黃酮類化合物可抑制B細胞的增值，而達到抗炎、調(diào)節(jié)免疫的目的。（3）對自然殺傷細胞的影響。（4）對巨噬細胞和單核細胞的的影響。（5）對肥大細胞和嗜堿性粒細胞的影響。證實黃酮類化合物可以有效地作用域動物的嗜堿性粒細胞，從而調(diào)節(jié)動物的免疫系統(tǒng)。（6）對中性粒細胞的影響。（7）對嗜酸性粒細胞的影響。黃酮類化合物不僅可以通過影響肥大細胞和嗜堿性粒細胞而達到抑制炎癥因子分泌的目的，還可以抑制中性和酸性粒細胞溶酶體酶釋放而抑制炎癥因子分泌。1.6.4抗病毒活性早在20世紀40年代，就有文獻報道天然黃酮類化合物的抗病毒活性，但對于合成的或經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的黃酮類化合物的抗病毒活性在90年代后才有文獻報道。譬如：槲皮素、蘆丁、二氫槲皮素、芹菜素、兒茶素等黃酮類化合物據(jù)報道黃酮類化合物具有11眾不同病毒活性。他們的病毒活性與其非糖苷復(fù)合物結(jié)構(gòu)和C-3的羥基化作用密切相關(guān)。1.6.5對心血管疾病的作用對冠狀動脈疾?。↙DL）的影響作用。LDL，特別是被氧化的LDL的增多被認為是冠狀動脈疾病的危險信號。有研究發(fā)現(xiàn)其作用機理主要是通過抑制巨噬細胞誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化氫的增殖和保護脂蛋白中親脂類抗氧化劑α-生育酚的活性，從而達到降低發(fā)生冠心病的危險。膽固醇的增多也被認為是冠狀動脈疾病的一個危險的信號。據(jù)文獻報道，大豆異黃酮可以促進膽固醇的減少。1.6.6解毒護肝和細胞保護作用肝臟易受到毒傘素、乙醇等物質(zhì)的致命傷害。早有文獻報道，黃酮類化合物水飛薊素和水飛薊賓具有明顯的護肝作用。其護肝機理與黃酮類化合物的膜穩(wěn)定作用有關(guān)，它能有限抑制機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而起到保肝的作用。目前，已有文獻報道黃酮類化合物可以喝鐵蛋白中的鐵離子螯合，而減少鐵蛋白中Fe2+和Fe3+的含量。1.6.7抗菌作用關(guān)于黃酮類化合物的抗菌作用，早就有文獻報道。其抗菌活性主要表現(xiàn)在其對真菌和細菌的抑制作用。（1）對細菌的抑制作用。據(jù)報道，黃酮類化合物具有抑制存在于魚類中病原體的活性，蜂膠中富含的黃酮類化合物能有效抑制存在于口腔的各種病原體。但其具體抑菌活性作用機理尚未見相應(yīng)的報道。（2）對真菌的抑制作用。1.7研究意義大蒜這一被世界許多國家視為珍品的物產(chǎn)，在我國卻一直未能被真正形成產(chǎn)業(yè)開發(fā)。我國大蒜基本上全部出口到世界各地，可進一步加工成系列產(chǎn)品，如保健食品、化妝品、飼料添加劑等可達幾十種產(chǎn)品。目前,已從桑葉、山楂葉、銀杏葉、金銀花、葛根、甘草、莽麥、大豆等多種植物中進行了黃酮類化合物的提取。研究表明，大蒜中含有黃酮類化合物，我國從大蒜中提取黃酮類物質(zhì)的報道較少，且采用工業(yè)生產(chǎn)上常用的乙醇溶劑回流浸提的方法更為少見。該文研究了超聲波輔助有機溶劑浸提大蒜黃酮的方法，以乙醇為溶劑，超聲波輔助提取，以蘆丁為標準品，采用分光光度法定量分析大蒜中總黃酮含量。為工業(yè)上生產(chǎn)大蒜黃酮提供理論依據(jù)，對于合理、充分利用豐富大蒜資源具有重要意義。與研究比較多的大蒜素相比，大蒜黃酮沒有刺激性氣味，將來可以作為功能性食品的基礎(chǔ)原料。超聲波提取技術(shù)的基本原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出。此外，超聲波的次級效應(yīng)，如機械振動、擴散、乳化、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速提取成分的擴散釋放，有利于提取。與常規(guī)提取法相比，具有提取時間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點[18]。黃酮類化合物是普遍存在于植物中天然物質(zhì)。體內(nèi)不能合成，只能從食物中攝取。對于調(diào)節(jié)生理機能，提高生命運動質(zhì)量，具有極其重要的意義。當(dāng)人缺少黃酮類化合物時，容易導(dǎo)致大腦和心臟功能不全，血管硬化，脆性增強。因其分子小，易被人體吸收，能通過血管屏障，進入脂肪組織。所以對人體的健康有廣泛的作用。黃酮的功效是多方面的，它是一種很強的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，如花青素、花色素可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的十倍以上，這種抗氧化作用還可以阻止細胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生。黃酮類化合物可以降低膽固醇，可以改善血液循環(huán)，向天果中的黃酮還含有一種PAF抗凝因子，這些作用大大降低了心腦血管疾病的發(fā)病率，也可改善心腦血管疾病的癥狀。黃酮可以抑制炎性生物酶的滲出，可以增進傷口愈合和止痛，櫟素由于具有強抗組織胺性，可以用于各類敏感癥。目前，全國保健食品的開發(fā)呈現(xiàn)出欣欣向榮的形勢。黃酮類化合物作為世界范圍新興的保健食品活性成分，以純天然、見效快為特征，以人體補充黃酮的理論和嚴格的科學(xué)實驗為基礎(chǔ)，為食用者帶來實實在在的健康體驗。黃酮類化合物在食品上的應(yīng)用比較局限，主要以保健食品的形式存在。從產(chǎn)品形式上看，種類不多，基本是液態(tài)飲品。眾多研究證實，黃酮類化合物具有保健功能，且已開發(fā)出多種保健食品。目前，市售的生物類黃酮功能食品可謂琳瑯滿目，涉及到功能食品的許多方面，如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降壓食品等，產(chǎn)品外觀覆蓋到液體、固體和半流體等多種形式。盡管食用大蒜對人類健康有利，但服用大蒜的有效劑量，大蒜中未知的生物活性化合物的種類以及生物學(xué)特性等仍待研究。大蒜產(chǎn)品的制作過程和功能成分的提取方法做進一步研究，盡可能保持大蒜及其制劑的高質(zhì)量和其特殊的生物活性。希望未來利用大蒜生產(chǎn)的商品有所突破，對保健品以及藥理作用有著重大意義。

2實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗原料新鮮大蒜，購于吉林省長春市。2.1.2實驗試劑與設(shè)備與儀器蘆丁，標準品上海友思生物技術(shù)有限公司；鎂粉，分析純天津光復(fù)精細化工研究所；鹽酸，分析純?nèi)R陽化工實驗廠；硝酸鋁，分析純天津光復(fù)精細化工研究所；亞硝酸鈉，分析純?nèi)R陽化工實驗廠；氫氧化鈉，分析純北京化工廠；無水乙醇，分析純天津富宇精細化工有限公司；鄰苯三酚，分析純沈陽市試劑五廠；牛肉浸膏，分析純沈陽市試劑五廠；蛋白胨，分析純沈陽市試劑五廠；氯化鈉，分析純沈陽市試劑五廠；牛肉膏，分析純沈陽市試劑五廠；酵母粉，分析純沈陽市試劑五廠；氯化鈉，分析純沈陽市試劑五廠；甲醇，色譜純美國Agilent公司；溴化鉀，光譜純天津市科器高新技術(shù)公司；AB-8大孔吸附樹脂天津市光復(fù)精細化工研究所；NAK-9大孔吸附樹脂天津市光復(fù)精細化工研究所；DB-101大孔吸附樹脂天津市光復(fù)精細化工研究所Jy3002電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精密試驗設(shè)備有限公司；RE52-98

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋北京光明醫(yī)療儀器廠；高壓滅菌鍋上海醫(yī)用設(shè)備廠；UV754紫外可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司；玻璃層析柱ф2cm×50cm上海青浦滬西儀器廠紫外分光光度計Lambda25型美國PerkinElmer儀器公司紅外光譜儀SpectrumOneFTIR型美國PerkinElmer儀器公司2.3實驗方法2.3.1原料預(yù)處理將新鮮的大蒜剝皮、切碎，在烘箱中55℃烘干，然后將大蒜進行粉碎備用。2.3.2預(yù)實驗大蒜化學(xué)成分的鑒定(1)黃酮類化合物[25]鹽酸—鎂粉反應(yīng)：可能有黃酮類化合物存在的原因：加入鎂粉幾顆、滴入濃鹽酸幾滴的放在試管中的1mL乙醇提取液（必要時在沸水中加熱3分鐘）是否顯紅紫顏色。(2)生物堿的檢識改良碘化鉍鉀（Dragendorff）試劑：一般在棕色瓶內(nèi)保存將由0.85g的堿式硝酸鉍溶于10mL的乙酸和40mL水中得到的試劑一和0.8g碘化鉀溶于20mL水中就得到的試劑二等量混合。用前各自取2mL上述的液體、4mL的乙酸與20mL水混合。若顯橙紅色表明提取液中存在有生物堿成分的。(3)酚類成分的檢識可能含有酚類的原因：取1~2滴1%三氯化鐵試劑加在1mL乙醇提取液觀察其呈藍墨綠色或藍紫色顏色變化的可直接進行檢查的如為酸性的提取液，堿性的可加乙酸酸化后檢查。(4)糖及苷Molish反應(yīng)：含有糖類或苷類的可能，觀察產(chǎn)生紫紅色環(huán)顏色的變化在濃硫酸的接觸面的少量濃硫酸被沿試管壁慢慢的加入前加入2~3滴的5%的萘酚乙醇液前1mL的水提取液或乙醇提取液中搖勻后。(5)甾體及萜類李伯曼反應(yīng)（Liebermann-Burchard反應(yīng)）：可能含有甾體皂苷元、甾醇或三萜類化合物，在試管中的顏色逐漸由黃→紅→紫→藍墨綠變化因為分別加入使它充分溶解的1mL冰乙酸在將溶劑揮發(fā)出去的3mL的再加1mL乙酸酐和滴入1滴濃硫酸在乙醇提取液和殘渣。顯色反應(yīng)：用新鮮配制的5%磷鉬酸乙醇溶液噴灑在濾紙上揮去溶劑的乙醇提取液，在120℃烘到出顏色，正反應(yīng)為顯藍—藍紫色斑點。(6)有機酸是否有黃色斑點在藍色背景下的觀察在噴霧溴甲酚綠試劑的硅膠板上先點上適量的乙醇的提取液之后。大蒜總黃酮提取方法的選擇（1）水提取法：取粉碎的大蒜粉末10g，加入50mL水，放在75℃水浴中提取2h，紗布過濾后減壓抽濾，棄濾渣得到的黃色濾液為大蒜總黃酮提取液。用紫外分光光度計測定其吸光度。（2）乙醇回流提取法：取粉碎的大蒜粉末10g，加入160mL的75%乙醇溶液，于75℃下的水浴中回流提取2h，紗布過濾后減壓抽濾，棄濾渣得到的黃色濾液為大蒜總黃酮提取液。用紫外分光光度計測定其吸光度。（3）超聲波輔助乙醇提取法：取粉碎的大蒜粉末10g，加入160mL的75%乙醇溶液，超聲波(300W)處理20min后，于75℃下的水浴中回流提取2h，紗布過濾后減壓抽濾，棄濾渣得到的黃色濾液為大蒜總黃酮提取液。用紫外分光光度計測定其吸光大蒜總黃酮的提取工藝流程新鮮大蒜剝皮、切碎烘干粉碎超聲波處理濃縮黃酮粗提液抽濾乙醇回流提取干燥大蒜黃酮粉末2.3.3大蒜總黃酮含量的測定標準液的制備蘆丁標準液配制[24]：準確稱取蘆丁標準品5mg(P2O5干燥24h)，置于50mL容量瓶中，用已醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成0.1mg/mL的蘆丁標準液備用。5%Na2NO2溶液：準確稱取12.59gNa2NO2固體，溶解后移入250mL容量瓶中，定容至刻度；10%Al(NO3)3溶液：準確稱取Al(NO3)3固體25g，溶解并移入250mL容量瓶中，定容至刻度備用；1mol/LNaOH溶液：準確稱取NaOH固體10g，溶解并移入250mL容量瓶，定容至刻度備用。蘆丁標準曲線的繪制用移液管準確吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL的蘆丁標準液分別置于10mL的容量瓶中，加水2-4mL，加50%亞硝酸鈉0.4mL，搖勻，放置6分鐘，加入10硝酸鋁0.4mL，搖勻，放置6分鐘，加入4.3%氫氧化鈉4.0mL，再加水至刻度、搖勻，放置15分鐘，以空白試劑作對比參照。用最小二乘法做線性回歸，求得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線。大蒜總黃酮含量測定方法在500nm[24]處，用紫外分光光度計測大蒜總黃酮提取液的吸光度。根據(jù)標準工作曲線，求出相當(dāng)于試樣吸光度的大蒜總黃酮含量，按以下公式計算大蒜總黃酮含量，結(jié)果精確至小數(shù)點后兩位。大蒜總黃酮的含量（%）=（C×V）/M×100%C-根據(jù)標準曲線計算出的被測液中的大蒜總黃酮含量，mg/mL；V-大蒜總黃酮提取液的體積，mL；M-大蒜粉的質(zhì)量M，mg。2.3.4大蒜總黃酮提取工藝的確定單因素試驗（1）超聲波處理時間的確定準確稱取30g大蒜粉5份，以1：16的料液比加入75%的乙醇溶液，超聲波(300W)處理時間分別為10min，15min，20min，25min，30min，在75℃水浴中，回流提取2h，取出后減壓抽濾，標號。濾液冷卻至室溫后，以相同體積分數(shù)的乙醇溶液為空白樣，在500nm波長下測定吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，確定最佳超聲波作用時間。（2）料液比的單因素試驗準確稱取30g大蒜粉末5份，在超聲波(300W)環(huán)境下處理20min后用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，按照1：12、1：14、1：16、1：18、1：20的料液比，在75℃水浴中，回流提取2h，取出后減壓抽濾，標號。濾液冷卻至室溫后，以相同體積分數(shù)的乙醇溶液為空白樣，在500nm波長下測定吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的料液比。（3）回流時間的單因素試驗準確稱取30g大蒜粉末5份，在超聲波(300W)環(huán)境下處理20min后用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，按照1：16的料液比，在75℃水浴中回流提取，時間分別為1h，1.5h，2h，2.5h，3h取出后減壓抽濾，標號。濾液冷卻至室溫，以相同體積分數(shù)的乙醇為空白，在500nm波長下測定吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的提取時間。（4）乙醇濃度的單因素試驗準確稱取30g大蒜粉末5份，按照1：16的料液比，在超聲波(300W)環(huán)境下處理20min后，分別用體積分數(shù)為70%、75％、80％、85％、90％的乙醇溶液，在75℃水浴中，回流提取2h，取出減壓抽濾，標號。冷卻后，以相同體積分數(shù)的乙醇溶液為空白樣，在500nm波長下測其吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的乙醇體積分數(shù)。（5）溫度的單因素試驗準確稱取30g大蒜粉末5份，在超聲波(300W)環(huán)境下處理20min后，用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，按1：16的料液比分別在70℃、75℃、80℃、85℃、90℃水浴中，回流提取2h，取出后減壓抽濾，標號。濾液冷卻后以相同體積分數(shù)的乙醇為空白樣，在500nm波長下測定吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的溫度。（6）提取次數(shù)的單因素試驗準確稱取30g大蒜粉末3份，在超聲波(300W)環(huán)境下處理20min后，用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，按1：16的料液比在75℃水浴中，回流提取2h，取出后減壓抽濾，標號。濾液冷卻后以相同體積分數(shù)的乙醇為空白樣，在500nm波長下測定吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的提取次數(shù)。響應(yīng)面實驗設(shè)計根據(jù)單因素試驗結(jié)果，由響應(yīng)面實驗設(shè)計表選取提取條件[22]。表2-1響應(yīng)面因素水平表水平因素料液比乙醇濃度（%）溫度（℃）-11:16806501:18857011:209075通過實驗與查找文獻可以看出提取次數(shù)對黃酮提取率影響不大，所以本實驗只考慮料液比、提取溫度、乙醇濃度三因素對黃酮提取效率的影響，最終確定各因素的影響重要性次序，以及各個因素之間的影響。表2-2響應(yīng)面實驗表實驗號料液比（1：x）乙醇濃（%）溫度（℃）116.0070.0095.00220.0065.0085.00318.0065.0075.00420.0070.0095.00518.0075.0095.00618.0070.0085.00718.0070.0085.00820.0075.0085.00918.0070.0085.001020.0070.0075.001116.0075.0085.001218.0075.0075.001318.0065.0095.001418.0070.0085.001518.0070.0085.001616.0070.0075.001716.0065.0085.002.3.5大蒜總黃酮的純化工藝研究粗提物→溶解稀釋→石油醚萃取→AB-8樹脂純化→精制總黃酮稱取5g大蒜黃酮粉末，用300mL75%的乙醇進行溶解后，放在干凈的分液漏斗中，加入300mL的石油醚進行萃取，不斷搖晃，萃取含有的油脂類物質(zhì)。分層后去下層液體，以備下一步純化實驗。樹脂的預(yù)處理大孔吸附樹脂預(yù)處理：取定量大孔吸附樹脂，用無水乙醇浸泡24h，再用蒸餾水反復(fù)洗滌，除去醇溶性雜質(zhì)，直至洗滌后溶液澄清為止。先用2%的NaOH溶液浸泡2~4個小時，再用蒸餾水反復(fù)洗滌，除去堿溶性雜質(zhì)，直至洗滌后溶液為中性為止，再用3%的HCl溶液浸泡2-4個小時，再用蒸餾水反復(fù)洗滌，除去酸溶性雜質(zhì)，直至洗滌后溶液中性為止。大孔吸附樹脂的選擇目前用最常用的大孔樹脂分離天然產(chǎn)物化學(xué)成份，不同的物質(zhì)在不同類型的樹脂中會具有不同的吸附性能。這里選用DB-101、AB-8、NAK-9三種型號的樹脂，將樹脂進行預(yù)處理。分別將預(yù)處理的DB-101、AB-8、NAK-9進行裝柱，各將300mL經(jīng)過脫脂后的大蒜溶液進行純化吸附，用體積分數(shù)為70%乙醇進行洗脫，分別測其洗脫液的總黃酮得率。不同乙醇體積分數(shù)對大蒜總黃酮解析的影響將處理好的AB-8樹脂進行裝柱，將300mL經(jīng)過脫脂后的大蒜濃縮物進行純化吸附，每次分別采用體積分數(shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液500mL進行洗脫，直至洗脫液將近無色后，在500nm波長下測定洗脫液的吸光度（A）值，重復(fù)三次，取平均值，并記錄實驗數(shù)據(jù)。大蒜總黃酮純度的檢測各取3-4mL純化前后大蒜總黃酮提取液，在500nm處的吸光度，計算其得率，查看純化效果。2.3.6大蒜純化樣品的紫外光譜及紅外光譜實驗紫外光譜分析（1）樣品的處理：取少量純化后的大蒜提取物放在小燒杯中，用20mL甲醇溶液將其溶解。（2）實驗：第一步用甲醇溶液做空白對照試驗，根據(jù)軟件提示將樣品溶液進行測量。紅外光譜分析（1）樣品的處理：取1-2mg純化后的樣品與適量的KBr粉末混合，將其研磨成細微粉末并混合均勻后，放入壓模內(nèi)，在壓片機上邊抽真空邊加壓，制成約1mm直徑為10mm的透明薄片進行測定[23]。（2）測定：將壓好的樣品制片放在儀器上進行測定，掃描的范圍為4000cm-1-400cm-1，記錄實驗數(shù)據(jù)。2.3.7大蒜總黃酮的生物活性研究大蒜總黃酮的抗氧化性研究（1）實驗原理利用某些體系在氧化過程中有超氧陰離子自由基（O2·-）的生成，O2·-與某些化合物的作用，產(chǎn)生具有特定吸收的有色物質(zhì)，利用分光光度計進行測定。受試物若能清除O2·-，則吸光度發(fā)生變化，可間接判斷受試物對O2·-的抑制作用。鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，自氧化過程中產(chǎn)生O2·-，O2·-又加速鄰苯三酚自氧化速率，同時產(chǎn)生有色中間物質(zhì)，有色中間產(chǎn)物的積累在滯后30-45s與時間成良好的線性關(guān)系，一般維持4min左右，隨后減慢。有色中間產(chǎn)物在322nm有強烈的光吸收。由于自氧化的速率依賴于O2·-的濃度，消除O2·-則抑制自氧化反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，從而評價受試物抑制O2·-的能力。（2）實驗方法鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5mL50mmol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2），4.2mL蒸餾水混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.3mL，迅速搖勻后倒入比色杯，325nm下每隔30s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘內(nèi)吸光度的增加，以10mmol/LHCl溶液配制空白管作為對照。加入大蒜總黃酮后鄰苯三酚自氧化速率的測定：按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1mL濃度為0.1g/mL、0.2g/mL樣品液，蒸餾水減少。用10mmol/LHCl溶液配制空白管作為對照，測定吸光度。計算抑制率抑制率（％）＝（△A1/△t-△A2/△t）/△A1/△t*100%式中：△A1/△t——鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率;△A2/△t——加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率.大蒜總黃酮化合物抗菌活性研究（1）配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基按蛋白胨10g/L，酵母粉3g/L，牛肉膏4g/L，氯化鈉5g/L，KH2PO40.25g/L配置100mL液體培養(yǎng)基，在121℃滅菌30min。取6支試管分別加入2~3mL滅菌后液體培養(yǎng)基，并用記號筆標記。（2）菌懸液的制備在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上接種大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），細菌斜面菌種2～3環(huán)，36℃培養(yǎng)下24h，然后備用配制成含菌數(shù)約為10-100cfu/mL的菌懸液用無菌水得到的。（3）抑菌性能測定（濾紙片法）在無菌條件下向培養(yǎng)皿（Φ120）中注入培養(yǎng)基15mL，冷卻后將各種供試菌懸液取0.2mL分別滴加到各自培養(yǎng)基上，涂勻。將已在160℃干熱滅菌2h后的小圓濾紙片(直徑6mm)用無菌鑷子浸入裝有無菌水溶液的大蒜黃酮（總大蒜黃酮含量80mg/mL）的無菌小瓶中，浸泡15min以上。將3個濾紙片貼在平板的相應(yīng)位置，一個為空白對照，兩個沾有大蒜黃酮溶液。蓋好培養(yǎng)皿，36℃培養(yǎng)24h用細菌培養(yǎng)箱，比較抑菌效果是通過測量抑菌圈直徑大小在濾紙片周圍的。3結(jié)果分析與討論3.1預(yù)實驗結(jié)果分析3.1.1大蒜中活性成分的鑒定結(jié)果表3-2大蒜中活性成分的檢測結(jié)果實驗項目實驗試劑實驗現(xiàn)象結(jié)論黃酮類化合物鎂粉+濃鹽酸由黃色變?yōu)樗{綠色無生物堿改良碘化鉍鉀橙色沉淀無酚類成分乙酸+1%三氯化鐵變墨綠色有糖及苷苯酚+濃硫酸變紅色有甾體及萜類李伯曼反應(yīng)黃→紅→紫→藍墨綠無有機酸濾紙干燥后無明顯油漬有將大蒜的乙醇提取液與鹽酸-鎂粉反應(yīng)，無明顯的顏色變化。研究表明,大蒜中含有黃酮類化合物[27],說明大蒜中的確存在黃酮類化合物。經(jīng)查文獻資料發(fā)現(xiàn)查兒酮，橙酮，兒茶素，異黃酮此反應(yīng)呈陰性，我們暫且將大蒜中的黃酮定為這幾種之一，以后通過UV及紅外光譜進行試驗驗證。3.1.2提取方法選擇結(jié)果表3-1提取方法實驗對比序號方法吸光度1水提法0.1632乙醇回流提取法0.2283超聲波輔助乙醇提取法0.324本實驗分別用了水提法、超聲波輔助乙醇提取法、乙醇回流提取法三種方法進行比較。水提法中總黃酮含量較低，乙醇回流提取法有所提高，但都不及超聲波輔助乙醇提取法，其得率最高，所以本實驗采取超聲波輔助乙醇提取法。3.2大蒜總黃酮含量的測定3.2.1標準曲線的繪制分別配置一系列濃度的蘆丁標準液在500nm波長處測定吸光度，參比液為試劑空白，實驗數(shù)據(jù)列于表3-3。表3-3蘆丁濃度與對應(yīng)吸光度值蘆丁(mg/mL)0.010.020.030.040.05吸光度(A)0.1140.2160.3170.4250.527利用上表3-3中的數(shù)據(jù)，以吸光度為縱坐標，以蘆丁標準溶液濃度作為橫坐標，繪制標準曲線，見圖3-1.圖3-1蘆丁標準曲線由圖可以看出，標準曲線的回歸方程為：Y=10.325X＋0.0100，R2=0.9995，表明了蘆丁在濃度0-0.05mg/mL之內(nèi)線性關(guān)系最好。3.3大蒜總黃酮提取工藝確定結(jié)果分析3.3.1單因素試驗超聲波處理時間對大蒜黃酮提取效果的影響圖3-2超聲波處理時間對提取效果的影響在30g大蒜干粉中加入料液比為1：16的75%的乙醇溶液后，回流提取2h，研究不同超聲波作用時間對大蒜中的總黃酮提取效果的影響的，結(jié)果見圖3-2。通過上圖表明：隨著超聲波作用時間的增加，大蒜總黃酮的得率升高；但當(dāng)時間大于20分鐘后黃酮得率趨于平穩(wěn)。所以本實驗選擇超聲波處理20min為宜。料液比對大蒜總黃酮得率的影響圖3-3不同料液比對提取效果的影響不同料液比實驗結(jié)果如上圖表明（圖3-3）：隨著料液比的增加，大蒜中總黃酮得率不斷增大，但當(dāng)料液比大于1:18時，總黃酮得率開始下降，因此料液比應(yīng)為1:18最好。因而應(yīng)選用1:18左右的料液比為提取液提取為宜。料液比對總黃酮得率的影響表現(xiàn)為隨著料液比的增加，總黃酮得率也提高，這是因為隨料液比的增大，濃度差提高，有利于傳質(zhì)，所以在總體上表現(xiàn)為隨著料液比的增加，總黃酮得率也增高。但這種影響不是無限的，當(dāng)料液比增高達到一定值后總黃酮得率不再增高，這是因為大蒜中總黃酮含量是一定的?；亓鲿r間對大蒜總黃酮得率的影響不同回流時間實驗結(jié)果（圖3-4）得出：最佳回流時間為2h。時間短，大蒜總黃酮類物質(zhì)未充分溶出，但當(dāng)時間超過2h，黃酮類物質(zhì)溶出量下降。這可能由于提取時間過長，提取液內(nèi)有效成分濃度析出造成的。圖3-4提取時間對提取效果的影響乙醇濃度對大蒜總黃酮得率的影響圖3-5乙醇濃度對總黃酮得率的影響從大蒜總中提取總黃酮時，使用不同質(zhì)量分數(shù)的乙醇，對黃酮得率也有很大影響。實驗結(jié)果表明（圖3-5）：隨著乙醇濃度的升高總黃酮得率呈上升的趨勢，當(dāng)乙醇濃度達到85%時，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大呈下降的趨勢。因而應(yīng)選用85%左右濃度的乙醇做提取液提取為宜。如果濃度過高，揮發(fā)變多乙醇濃度依然會降低，所以本實驗選擇85%左右的。提取溫度對大蒜總黃酮得率的影響圖3-6提取溫度對大蒜總黃酮得率的影響從大蒜總中提取總黃酮時，提取溫度不同時，黃酮得率有很大的變化。升高溫度，滲透、溶解、擴散速度加快，有利于黃酮類物質(zhì)的溶出。實驗結(jié)果表明（圖3-6）：隨著溫度的升高總黃酮得率呈上升的趨勢，當(dāng)溫度達到75℃時，總黃酮得率隨著溫度的升高呈下降的趨勢。這可能是因為溫度升高到一定程度會破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成樣品中黃酮類物質(zhì)的損失，并且會導(dǎo)致提取液的大量揮發(fā)，因而應(yīng)選用75℃左右的溫度進行提取為宜。提取次數(shù)對大蒜總黃酮得率的影響圖3-7提取次數(shù)對大蒜總黃酮提取的影響從大蒜中提取總黃酮時，提取次數(shù)不同，其黃酮得率的變化從（圖3-7）表明：提取黃酮含量隨提取次數(shù)而變小，提取第一次得率較第兩次和第三次高很多，后兩次黃酮基本沒有，且成本高、耗時多，所以本實驗選擇提取一次。3.3.2響應(yīng)面實驗分析結(jié)果Design-Expert試驗設(shè)計的結(jié)果與分析以料液比、提取溫度、乙醇濃度三因素，通過響應(yīng)面實驗分析大蒜總中總黃酮提取的最佳條件。以為料液比、提取溫度、乙醇濃度為3因素，做3水平的響應(yīng)面試驗，試驗方案結(jié)果分析見表3-4。表3-4響應(yīng)面試驗測定結(jié)果分析表實驗號料液比（1：x）乙醇濃度（%）溫度（℃）總黃酮得率（%）116.0070.0095.000.71220.0065.0085.000.72318.0065.0075.000.96420.0070.0095.001.07518.0075.0095.000.54618.0070.0085.001.26718.0070.0085.001.26820.0075.0085.000.75918.0070.0085.001.261020.0070.0075.000.881116.0075.0085.000.701218.0075.0075.000.761318.0065.0095.000.501418.0070.0085.001.261518.0070.0085.001.261616.0070.0075.000.791716.0065.0085.000.62表3-4為不同條件下所測定的大蒜總黃酮在500nm波長紫外吸光度值，利用軟件對表3-4中總黃酮提取得吸光度試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合；由表3-4為回歸分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著。并且該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9256說明，該模型與實際實驗擬合較好，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于大蒜總黃酮乙醇溶液提取實驗的理論預(yù)測分析。各個因素經(jīng)回歸擬合后，選擇對響應(yīng)值顯著的各項可以得到大蒜總黃酮得率度編碼自變量（提取溫度、提取時間、液料比）的二次多項回歸方程為：Y=+0.22-4.750E-003*A+0.014*B+3.750E-003*C-3.500E-003*A*B+1.000E-003*B*C-0.071*A2-0.073*B2-0.073*C2由表3-5可知，上述模型的一次項A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2都極為顯著，模型的F值為83.79，整體模型的顯著水平p<0.0001，表明該模型顯著。模型的R2為0.8243，R2（Adj）為0.9918，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬項較小，可以用該方程代替真實試驗點進行分析。表3-5響應(yīng)面回歸方程分析結(jié)果項目平方和自由度均方F值P值顯著性模型0.7698.415E-00383.32<0.0001**A1.805E-00411.805E-0041.790.2231B1.682E-00311.682E-00316.650.0047*C1.125E-00411.125E-00411.10.3263**AB4.900E-00514.900E-0050.490.5086AC0.0010.000.001.0000BC4.000E-00614.000E-00612.350.040*A20.02110.021208.67<0.0001**B20.02210.022220.64<0.0001**C20.02310.023223.68<0.0001**殘差7.070E-00471.010E-004失擬項7.070E-00432.375E-00441.980.0018凈誤差0.00040.000校正項0.07616注：“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.0001.以下三個響應(yīng)面立體直觀圖給出了各個因子交互作用后對總黃酮提取率的影響直觀圖。圖3-8提取溫度與料液比的相互作用對大蒜總黃酮提取率的影響圖3-9乙醇濃度與料液比的相互作用對大蒜總黃酮提取率的影響圖3-10提取溫度與乙醇濃度的相互作用對大蒜總黃酮提取率的影響條件優(yōu)化響應(yīng)面分析表明：最佳提取工藝理論值是提取溫度66.68℃，料液比1:18.98，乙醇濃度81.94%?？紤]到實際操作的便利，將大蒜中總黃酮提取的最佳工藝條件修正為：浸提溫度為67℃，料液比為1:19，乙醇濃度80%，浸提時間為2h。試驗驗證：在浸提溫度為67℃，料液比為1:19，乙醇濃度80%，浸提時間為2h條件下進行5次驗證試驗。結(jié)果如表3-6所示，可以得到大蒜總黃酮得率由1.26%上升到1.32%。表3-6試驗驗證相應(yīng)面優(yōu)化條件序號項目12345總黃酮得率1.33%1.35%1.34%1.28%1.32%平均值1.32%3.4大蒜總黃酮的純化工藝研究圖3-11AB-8大孔樹脂純化裝置以及精致大蒜黃酮3.4.1大孔吸附樹脂的選擇結(jié)果分析表3-7不同型號大孔吸附樹脂對大蒜黃酮的吸附的影響樹脂型號精制黃酮得率（%）AB-858.82D10146.47NKA-940.16表3-7列出了AB-8，D101，NKA-9三種大孔吸附樹脂對大蒜總黃酮吸附效果。由表中結(jié)果可知三種大孔吸附樹脂AB-8，D101，NKA-9其中吸附效果最佳的是AB-8樹脂，所以試驗選用AB-8樹脂對大蒜總黃酮進行純化。3.4.2乙醇濃度對解析效果的影響起初流出液的吸光度小，吸附效率較高，吸附達到一定程度后，流出液的吸光度顯著上升，最終接近飽和吸附。圖3-12乙醇濃度對解析效果的影響由圖3-12可看出，吸附飽和的樹脂用65%左右的乙醇水溶液進行解析，黃酮解析速度較快且效果較好。3.4.3大蒜總黃酮得率的測定比較可得，純化后黃酮得率升高，結(jié)果顯著結(jié)果如圖3-13所示。圖3-13純化前后黃酮得率對比3.5大蒜純化樣品的紫外光譜及紅外光譜分析3.5.1紫外吸收光譜圖分析將實驗數(shù)據(jù)記錄后進行再處理得到下圖圖3-14大蒜提取物的紫外吸收圖譜可以清晰的看到在440nm左右出現(xiàn)明顯的吸收峰，也是大蒜提取物的特征峰，查閱相關(guān)文獻表3-8黃酮類化合物的紫外可見吸收波段項目帶Ⅱ(nm)帶Ⅰ(nm)黃酮類250～280310～380黃酮醇類250～280330～360異黃酮類245～275310～330肩峰雙氫黃酮類275～295300～330肩峰查爾酮類230～270340～390橙酮類230～270340～450花色素類270～280465～560從表3-8可以得出大蒜中含有的主要黃酮類化合物可能為橙酮類，吸收峰的波段在340nm到450nm之間。3.5.2紅外吸收光譜圖分析紅外光譜同紫外光譜一樣，單一的結(jié)果無法判斷出物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但其可以反映出物質(zhì)中特征的官能團，從而判斷出物質(zhì)的大體組成。測定的結(jié)果見下圖：圖3-15大蒜提取物的紅外吸收光譜圖查閱文獻，3399cm-1為-OH的吸收特征峰，可以作為判斷有無羥基的主要依據(jù)；1631cm-1為C=O雙鍵的伸縮振動吸收；1600cm-1為苯基特征吸收峰；1189～1071cm-1為醇類吸收峰，可以作為判斷醇類化合物的依據(jù)；885～746cm-1為苯環(huán)四取代；從譜圖分析其結(jié)果，該符合大蒜黃酮的結(jié)構(gòu)，從而確定提取出的主要成分可能為大蒜黃酮類物質(zhì)。3.6大蒜總黃酮的生物活性研究3.6.1大蒜總黃酮的抗氧化性分析表3-9每隔30s所測鄰苯三酚自氧化的吸光度時間（s）0306090120150180吸光度A0.1190.6701.0651.2781.4481.5581.632由表3-9得鄰苯三酚自氧化速率ΔA1/Δt=8.42×10-3/s表3-10每隔30s所測加入大蒜黃酮樣品后鄰苯三酚自氧化的吸光度時間（s）0306090120150180加入大蒜黃酮后鄰苯三酚自氧化速率（10-3）10.3020.4040.5150.6670.8080.8981.0123.9420.2970.3980.4270.5780.7580.8820.9913.86由表3-10可以得到加入大蒜黃酮樣品后鄰苯三酚自氧化平均速率ΔA2/Δt=3.90×10-3/s，鄰苯三酚的自氧化速率明顯降低，說明大蒜黃酮具有較強的抗氧化活性?？寡趸囼灉y得大蒜黃酮對超氧陰離子自由基（O2·-）的平均抑制率54%左右，說明大蒜黃酮具有一定抗氧化功能。3.6.2大蒜中黃酮的抑菌效果分析表3-11大蒜黃酮對各菌種抑制效果細菌抑菌圈直徑（mm）細菌抑菌圈直徑（mm）大腸桿菌2.8嗜熱鏈球菌3.2金黃色葡萄球菌3.7枯草芽孢桿菌3.1大蒜中的黃酮對供試菌種的抑制效果如表3-11所示。可以看出：大蒜中的黃酮對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、大腸桿菌的抑制作用較強。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌同為革蘭氏陽性菌，可以得出大蒜中的黃酮類化合物具有廣譜的抑菌效果。結(jié)論本研究主要大蒜中的總黃酮提取工藝、分離純化和抗氧化及抑菌的進行研究，主要得出以下結(jié)論：通過用水提法，乙醇回流提取法，超聲波輔助乙醇回流提取法對大蒜中黃酮提取的比較后，確定超聲波輔助乙醇回流提取法為最佳提取方法。通過單因素實驗以及響應(yīng)面設(shè)計實驗優(yōu)化。確定了大蒜總黃酮的最佳提取工藝理論值為提取溫度67℃，料液比1:19，乙醇濃度80%，結(jié)果顯示大蒜總黃酮得率為1.32%。（3）通過分析選用AB-8大孔吸附樹脂純化，用65%乙醇進行洗脫，濃縮干燥后得精制黃酮。（4）通過紫外光譜及紅外光譜實驗初步確定大蒜黃酮主要為橙酮類。（5）通過抗氧化性實驗證明大蒜總黃酮確實具有抗氧化性，大蒜黃酮對超氧陰離子自由基（O2·-）的平均抑制率54%左右。同時抑菌實驗證明大蒜中黃酮具有一定的抑菌作用，大蒜中的黃酮類化合物具有廣譜的抑菌效果。由于時間和實驗室條件的限制，大蒜的總黃酮研究不盡完善，對于提取工藝，還應(yīng)該對超臨界萃取、微波輔助提取等新興的技術(shù)提高其提取率進行研究，對大蒜黃酮化合物進行質(zhì)譜分析、高效液相色譜法進一步確定其結(jié)構(gòu)。致謝本論文是在張海悅老師的悉心指導(dǎo)下圓滿完成。在這半年多的時間里，從論文的選題、文獻的查閱、英文文獻的翻譯、實驗方案的設(shè)計、實驗結(jié)果的分析到論文的撰寫、修改、定稿，都是老師用心栽培的成績。在此，謹向張老師致以深深的敬意和衷心的感謝！感謝所有食品教研室的老師，感謝他們一直以來對我的關(guān)心和幫助。同時感謝在大學(xué)期間所有的關(guān)心和幫助我的老師、同學(xué)、朋友們。在實驗過程中，還得到了其他實驗室老師的關(guān)懷和指導(dǎo)。從