ICSxxx

中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號

T/GAIA

廣東省分析測試協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GAIAxxx—xxxx

血清中米酵菌酸的測定

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

Determinationofbongkrekicacidinserumbyultra-highperformanceliquid

chromatography-tandemmassspectrometry

xxxx-xx-xx發(fā)布xxxx-xx-xx實(shí)施

發(fā)布

GAIAxxx—xxxx

血清中米酵菌酸的測定超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血清中米酵菌酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定性定量檢測方法。

標(biāo)準(zhǔn)適用于血清中米酵菌酸的定性、定量分析。其他可疑樣品中米酵菌酸的定性、定量分析可參照

使用。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定

WS/T679突發(fā)中毒事件衛(wèi)生應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范總則

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

樣品用0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（80∶20，v/v）提取，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，以

保留時(shí)間、質(zhì)譜特征碎片離子峰和相對豐度比作為定性判斷依據(jù)，以峰面積為定量依據(jù)，采用外標(biāo)法進(jìn)

行定量分析。

5試劑與材料

5.1試劑

5.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。

5.1.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

5.1.3甲酸（CH2O2）：色譜純。

5.1.4氨水（NH4OH）：色譜純。

5.2試劑配制

5.2.10.1%氨水甲醇－乙腈溶液（80∶20，v/v）：取20mL乙腈，加入0.1mL氨水，加甲醇定容至100mL，

搖勻。

5.2.20.05%甲酸水溶液：取5mL甲酸，用水定容至1000mL，搖勻。

II

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5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

5.3.1米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（10.0mg/L）：根據(jù)米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)固體，

用甲醇配制成10.0mg/L米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，-20℃避光保存，有效期6個(gè)月?；虿捎檬惺塾凶C標(biāo)準(zhǔn)溶

液配置。

5.3.2米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（200μg/L）：準(zhǔn)確吸取米酵菌酸中間溶液（5.3.1）200μL于10mL容量瓶，

用甲醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為200μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-20℃避光保存。

5.3.3米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.3.2），用初始流動相逐步稀釋成濃

度為0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，

臨用現(xiàn)配。

5.4材料

5.4.1具塞塑料離心管：2mL。

5.4.2吸管：5mL。

5.4.3微孔濾膜（有機(jī)相）：0.22μm

6儀器和設(shè)備

6.1超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：配電噴霧離子源（ESI）和三重四極桿質(zhì)量分析器。

6.2離心機(jī):轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。

6.3渦旋震蕩器。

6.4精密移液器。

6.5生物安全柜。

7試樣的采集、保存和運(yùn)輸

試樣的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合WS/T679-2020中的第8章要求。

8分析步驟

8.1個(gè)人防護(hù)

在處理樣本時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵從對潛在生物傳染性樣本處理的相關(guān)規(guī)定，使用時(shí)遵循生物安全規(guī)則，于

生物安全柜中對樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并根據(jù)規(guī)定對廢物進(jìn)行處理，做好相應(yīng)個(gè)人防護(hù)。

8.2提取

準(zhǔn)確移取血清樣品0.2mL于2mL塑料離心管中，加入1mL0.1%氨水甲醇－乙腈溶液（5.2.1），渦

旋2min，10000r/min離心5min，取上清液于2mL塑料離心管加入0.5mL正己烷渦旋混合，靜置2min

后，取甲醇－乙腈層過0.22μm濾膜后上機(jī)。

8.3儀器檢測

8.3.1液相色譜參考條件

a）色譜柱：AcquityBEHC18色譜柱（2.1×50mm，1.7μm），或相當(dāng)者。

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b）流動相：A為0.05%（v/v）甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1。

表1液相色譜梯度洗脫條件

時(shí)間（min）A（%）B（%）

0.07030

1.07030

3.01585

6.01090

7.0595

7.17030

9.07030

c）流速：0.3mL/min。

d）柱溫：40℃。

e）進(jìn)樣量：5μL。

8.3.2質(zhì)譜儀參考條件

a）離子源：電噴霧離子源（ESI）。

b）毛細(xì)管電壓：-2.5kv；去溶劑溫度：500℃。

c）掃描方式：負(fù)離子掃描。

d）檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）。

e）霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣由氮?dú)獍l(fā)生器產(chǎn)生或使用高純氮?dú)狻⑴鲎矚饩鶠楦呒儦鍤?；使?/p>

前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求。

f）錐孔電壓、碰撞能量等電壓值優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。

g）定性離子對、定量離子對，錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2米酵菌酸的質(zhì)譜參數(shù)

化合物保留時(shí)間(min)離子對(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)

定量：485.2>441.2-22-12

米酵菌酸4.37

定性：485.4>397.3-22-18

8.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確吸取5μL的米酵菌酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3.3），由低濃度到高濃度依次注入超高效液相色譜

-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行測定。以米酵菌酸定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作

溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖參見附錄A圖A。

8.3.4定性測定

在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測定時(shí)，被測試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的

保留時(shí)間相比較，相對誤差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，

而且所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致（相對豐度＞50%，允許±20%偏差；相對豐

度20%～50%，允許±25%偏差；相對豐度10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差），

則可判斷樣品中存在米酵菌酸。

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8.3.5定量測定

本標(biāo)準(zhǔn)采用外標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定，定量用標(biāo)準(zhǔn)溶液采用同種基質(zhì)配置，且所測樣品中米酵菌

酸的相應(yīng)值應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)，如果試樣待測液中被測物質(zhì)的響應(yīng)值超出儀器檢測的線性范圍，可

適當(dāng)稀釋后測定。

8.4空白試驗(yàn)

除不加試樣外，均按照上述測定步驟進(jìn)行。

9結(jié)果計(jì)算和表述

試樣中米酵菌酸的含量C按式（1）計(jì)算。

C0V

C…………………（1）

V0

式中：

C──待測組分含量（μg/L）；

C0──由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中被測組分濃度（μg/L）；

V──樣品定容體積（mL）；

V0──樣品取樣體積（mL）；

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效

數(shù)字。

10方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度

10.1靈敏度

本方法檢出限為1.0μg/L，定量限為3.0μg/L。

10.2準(zhǔn)確度

本方法中米酵菌酸在0.50μg