(19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(21)申請(qǐng)?zhí)?01911116819.3(71)申請(qǐng)人云南綠新生物藥業(yè)有限公司地址655000云南省曲靖市沾益區(qū)城西工業(yè)園區(qū)(72)發(fā)明人王鉦霖劉勝貴蔣永昌付彬彬李智高孔令羽A61K36/60(2006.01)(54)發(fā)明名稱(57)摘要本發(fā)明公開了一種分離純化大麻黃素的方法，屬于植物活性成分提取技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有提取方法中大麻黃素提取率低、純度低及易失活等問題，將大麻花葉粉碎，然后依次經(jīng)纖離純化獲得高純度的大麻黃素。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，制備得的大麻黃素不含四氫大麻酚，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。2步驟1,酶解：將大麻花葉粉碎制成顆粒，加入纖維素酶進(jìn)行酶解；步驟3,濃縮：收集提取液過濾后低溫減壓濃縮；步驟5,過濾：加壓過濾步驟4得到的水相液；步驟6,膜過濾：將步驟5得到的粗濾液用膜過濾，得到的濾液低溫減壓濃縮；步驟7,柱層析：步驟6獲得的大麻黃酮濃縮液，通過柱層析分離得到大麻黃素；步驟8,濃縮：步驟7分離得到的大麻黃素低溫減壓濃縮抽干；步驟10,干燥：將所得晶體真空低溫干燥，獲得大麻黃素純品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟1中所述大麻花葉粉碎制成的顆粒為30-50目，加入纖維素酶進(jìn)行酶解，所用纖維素酶的酶解活力單位1000U/g,加入量為：0.1-0.2g/kg果漿；酶解pH:4.5-6.5,酶解溫度45-55℃,時(shí)間為40-50min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟2中乙醇水溶液為(20-50%),低溫提取溫度為45-58℃,時(shí)間為30-60min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟3中低溫減壓濃縮溫度為45-60℃,真空度為0.05-0.078MPa。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟4中NaOH水溶液為2-4%,每次加入正己烷的量為濃縮液的1.6-2.4倍，萃取次數(shù)為2-3次。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟5中加壓過濾壓力為0.2MPa,濾網(wǎng)為1000目。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟6中過濾是指將粗濾液經(jīng)過分子量為1000D的中空纖維膜過濾。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟7中9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟8中低溫減壓濃縮溫度為45-60℃,真空度為0.05-0.078MPa。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離純化大麻黃素的方法，其特征在于，所述的步驟10中干燥為真空凍干干燥，真空度0.07-0.08MPa,真空凍干溫度-65--50℃,凍干時(shí)間24-3一種分離純化大麻黃素的方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及植物活性成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離純化大麻黃素的方背景技術(shù)[0002]工業(yè)大麻(SteviarebaudianaBertoni)為大麻科大麻屬一年生雌雄異株的草本植物，廣泛分布于世界各地。世界上大麻屬植物主要有野生大麻(CannabisruderalisJanisch)、印度大麻(CannabisindicaLam)和栽培大麻(CannabissativaL)3個(gè)種，在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過程中又產(chǎn)生了許多大麻變種和亞種。由于大麻中含有一種致幻成癮的次生代謝產(chǎn)物一四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC),因而成為公眾熟知的毒品原植物之一。為了方便監(jiān)管和合理使用，國(guó)際上將大麻中THC含量<0.3%的大麻品種定義不具備毒品利用價(jià)值的工業(yè)大麻。目前世界上種植工業(yè)大麻的國(guó)家已達(dá)27個(gè)，培育出的符合THC含量<0.3%的工業(yè)大麻品種26個(gè)。[0003]工業(yè)大麻又稱漢麻，漢麻全身都是寶主要有紡織、食用和藥用三大功能。漢麻皮富含纖維，可用于服裝及各種飾品加工；漢麻桿芯是極佳的木材替代品，還可用來生產(chǎn)超微粉；漢麻籽富含優(yōu)質(zhì)蛋白以及人體必需脂肪酸，可應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域。從大麻的葉、花及花粉中分離得到的已知黃酮類化合物有20多種，它們可以被糖基化、異戊烯基化或甲基化。2002年，McPartland等分離得到了共軛0-糖苷化合物：芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol);同年，Va到了C-糖苷化合物：葒草苷(orientin)、紫杉醇(vitexin)、木犀草素-7-0-葡萄糖苷(luteolin-7-0-glucoside)和芹菜素-7-0-葡糖苷(apigenin-7-0-glucoside)。此外，大麻化學(xué)上屬于丙烯基黃酮類，與THC或CBD等大麻素沒有關(guān)系。大麻黃素A和B屬于黃酮類化合下比乙酰水楊酸(阿司匹林)的藥效強(qiáng)近30倍。大麻黃素A和大麻黃素B具有抑制類風(fēng)濕的功效；大麻黃素A和B在體外對(duì)前列腺素E有抑制作用，因此很多研究探討了其在消炎方面的潛力。目前從漢麻葉和漢麻果膠中提取總黃酮工藝已見報(bào)道，但實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提取的并不多見。本發(fā)明采用甲醇水溶液提取配合柱層析分離純化，對(duì)漢麻葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以探尋漢麻葉總黃酮的最適提取條件，目的在于研發(fā)一個(gè)適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的工藝，旨在為充分利用漢麻葉中的生物活性成分，實(shí)現(xiàn)漢麻資源的綜合利用和效益最大化提供指導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容[0004]針對(duì)現(xiàn)有提取方法中大麻黃素提取率低、純度低，易失活等問題，本發(fā)明提供了一種分離純化大麻黃素的方法，包括如下步驟：4[0005]2、向步驟1獲得的酶解大麻花葉中加入乙醇水溶液，進(jìn)行低溫提取，獲得提取液；所述的乙醇水溶液為(20-50%),低溫提取溫度為45-58℃,時(shí)間為30-60min。[0006]3、過濾步驟2獲得的提取液，過濾后低溫減壓濃縮至1/5體積，獲得濃縮液；所述的低溫減壓濃縮溫度為45-60℃,真空度為0.05-0.078MPa。[0007]4、向步驟3中獲得的濃縮液加入NaOH水溶液，調(diào)節(jié)PH值至5-6;調(diào)至堿性后加入正己烷萃取，合并萃取液，濃縮抽干；所述的NaOH水溶液為2-4%,每次加入正己烷的量為濃縮液的1.6-2.4倍，萃取次數(shù)為2-3次。[0008]5、加壓過濾步驟4得到的水相液，獲得粗濾液。[0009]6、將步驟5得到的粗濾液用膜過濾，得到的濾液低溫減壓濃縮至1/5體積，獲得大麻黃酮濃縮液。[0010]7、步驟6獲得的大麻黃酮濃縮液，通過柱層析分離得到大麻黃素。[0011]8、將步驟7分離得到的大麻黃素低溫減壓濃縮抽干，獲得大麻黃素晶體；所述的低溫減壓濃縮溫度為45-60℃,真空度為0.05-0.078MPa。[0012]9、將步驟8得到的大麻黃素晶體，用分析純級(jí)乙醇水溶液溶解，低溫減壓回收溶劑，結(jié)晶，獲得大麻黃素結(jié)晶液。[0013]10、過濾步驟9得到的結(jié)晶液，得到高純度大麻黃素晶體，將所得晶體真空低溫干燥，獲得大麻黃素純品。[0014]進(jìn)一步地限定，步驟1)所述大麻花葉粉碎制成的顆粒為30-50目。[0015]更進(jìn)一步地限定，步驟1)所述的加入纖維素酶進(jìn)行酶解，所用纖維素酶的酶解活力單位1000U/g,加入量為：0.1-0.2g/kg果漿；酶解pH:4.5-6.5,酶解溫度45-55℃,時(shí)間為40-50min。[0016]進(jìn)一步地限定，步驟2)所述大麻花葉與乙醇的料液比為1g:(4-6)mL。[0017]進(jìn)一步地限定，步驟5)所述加壓過濾壓力為0.2MPa,濾網(wǎng)為1000目。[0018]進(jìn)一步地限定，步驟6)所述過濾是指將粗濾液經(jīng)過分子量為1000D的中空纖維膜過濾。[0019]進(jìn)一步地限定，步驟7)所述層析是指通過大孔樹脂柱洗脫的方法進(jìn)行純化。[0020]更進(jìn)一步地限定，步驟7)所述大孔樹脂為[0021]進(jìn)一步地限定，步驟10)所述干燥為真空凍干干燥，真空度0.07-0.08MPa,真空凍干溫度-65--50℃,凍干時(shí)間24-28h。[0022]本發(fā)明采用酶解配合低溫醇提的方法提取大麻黃素，解決了大麻黃素提取率低、失活、色價(jià)與純度不高等問題，取得的有益效果如下所述：1.以往大麻黃素提取之前僅僅進(jìn)行粉碎處理，很難保證在提取過程中，大麻黃素從花葉纖維素中能充分釋放，本發(fā)明在提取前采用纖維素酶解的方法，通過纖維素酶使花葉纖維素解鏈，將大麻黃素釋放，進(jìn)而通過提取使大麻黃素充分釋放。[0023]2.以往大麻黃素提取均采用溶劑提取法，提取得到的提取液往往含有較多大麻素，本發(fā)明采用低溫低醇的提取方法，解決了提取液中大麻素過多的問題。[0024]3.本發(fā)明與常規(guī)方法相比純度由25%提高至60%,純度增加35%。5附圖說明[0025]圖1本發(fā)明與常規(guī)方法大麻黃素提取率的比較。[0026]圖2本發(fā)明與常規(guī)方法大麻黃素純度比較。[0027]圖3本發(fā)明與常規(guī)方法提取液中大麻素的比較。具體實(shí)施方式[0028]為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合[0029]本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：實(shí)施例1大麻黃素分離純化方法[0030]2、然后以1g:4mL的料液比加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇水溶液，攪拌提取，獲得提取液。所述提取溫度為48℃,時(shí)間為40min,提取2次?；厥?，回收溶劑后，提取液濃縮至原體積的20%;減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。[0034]6、得到的粗濾液用分子量為1000D的中空纖維膜過濾，得到的濾液低溫減壓濃縮至1/5體積，獲得大麻黃酮濃縮液。[0035]7、獲得的大麻黃酮濃縮液，通過柱層析分離得到大麻黃素；所用填料為大孔樹脂溫減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。[0037]9、得到的大麻黃素晶體，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低溫減壓回收溶劑，濃縮至大麻黃素晶體析出，放置冷卻獲得大麻黃素結(jié)晶液。[0038]10、用玻砂漏斗過濾結(jié)晶液，得到高純度大麻黃素晶體，將所得晶體放入干燥箱中，真空度0.08MPa,真空凍干溫度-65℃,凍干時(shí)間28h,得大麻黃素成品。大麻黃素分離純化方法1、取大麻花葉1000g,用高速粉碎機(jī)粉碎，粉碎粒度4纖維素酶，加入量為0.1g/kg大麻花葉，在pH4.5,溫度為45℃,攪拌槳轉(zhuǎn)數(shù)為20轉(zhuǎn)/min,攪拌40min進(jìn)行酶解，獲得纖維素酶酶解花葉。[0040]2、然后以1g:4mL的料液比加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇水溶液，攪拌提取，獲得提取液。所述提取溫度為48℃,時(shí)間為40min,提取2次?；厥?，回收溶劑后，提取液濃縮至原體積的20%;減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。6[0044]6、得到的粗濾液用分子量為1000D的中空纖維膜過濾，得到的濾液低溫減壓濃縮[0045]7、獲得的大麻黃酮濃縮液，通過柱層析分離得到大麻黃素；所用填料為大孔樹脂溫減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。[0047]9、得到的大麻黃素晶體，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低溫減壓回收溶劑，濃縮至大麻黃素晶體析出，放置冷卻獲得大麻黃素結(jié)晶液。[0048]10、用玻砂漏斗過濾結(jié)晶液，得到高純度大麻黃素晶體，將所得晶體放入干燥箱中，真空度0.08MPa,真空凍干溫度-65℃,凍干時(shí)間28h,得大麻黃素成品。[0049]實(shí)施例3大麻黃素分離純化方法1、取大麻花葉1000g,用高速粉碎機(jī)粉碎，粉碎粒度40目，然后加活力單位纖維素酶，加入量為0.1g/kg大麻花葉，在pH4.5,溫度為45℃,攪拌槳轉(zhuǎn)數(shù)為20轉(zhuǎn)/min,攪拌40min進(jìn)行酶解，獲得纖維素酶酶解花葉。[0050]2、然后以1g:4mL的料液比加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇水溶液，攪拌提取，獲得提取液。所述提取溫度為48℃,時(shí)間為40min,提取2次?；厥?，回收溶劑后，提取液濃縮至原體積的20%;減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。[0053]5、得到的粗濾液用分子量為1000D的中空纖維膜過濾，得到的濾液低溫減壓濃縮[0054]6、獲得的大麻黃酮濃縮液，通過柱層析分離得到大麻黃素；所用填料為大孔樹脂溫減壓濃縮溫度為52℃,真空度為0.072MPa。[0056]8、得到的大麻黃素晶體，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低溫減壓回收溶劑，濃縮至大麻黃素晶體析出，放置冷卻獲得大麻黃素結(jié)晶液。[0057]9、用玻