2025年大學(xué)《化學(xué)生物學(xué)》專業(yè)題庫——生物學(xué)專業(yè)實驗操作技能考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（每題2分，共20分。請將正確選項的字母填在題干后的括號內(nèi)）1.在進行PCR反應(yīng)時，下列哪一項通常不是必需的？（）A.DNA聚合酶B.目的基因的特異性引物C.dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）D.RNA模板E.適當?shù)木彌_液和溫度循環(huán)條件2.瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理主要是基于（）A.核酸分子的大小和電荷B.核酸分子的堿基序列C.核酸分子的空間結(jié)構(gòu)D.核酸分子的甜度E.電場強度3.下列關(guān)于質(zhì)粒載體的描述，錯誤的是？（）A.質(zhì)粒是獨立于細菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA分子B.質(zhì)粒通常編碼細菌的一些特殊性狀，如抗藥性C.質(zhì)粒載體常被用作基因克隆的載體D.所有質(zhì)粒都天然存在于所有細菌中E.質(zhì)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化等方式導(dǎo)入宿主細胞4.在蛋白質(zhì)純化過程中，如果目標蛋白是疏水性的，下列哪種層析方法通常最有效？（）A.離子交換層析B.凝膠過濾層析C.親和層析D.凝膠電泳E.上述方法都一樣有效5.下列哪種試劑常用于蛋白質(zhì)變性劑，可以破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)？（）A.尿素B.Tris-HClC.SDS（十二烷基硫酸鈉）D.EDTAE.甘油6.在進行WesternBlotting實驗時，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF或NC膜）后，通常需要進行封閉處理，其目的是？（）A.使蛋白質(zhì)變性B.洗去未結(jié)合的抗體C.防止抗體非特異性結(jié)合D.使蛋白質(zhì)重新折疊E.增強抗體信號7.下列哪種方法常用于檢測樣品中是否存在特定的DNA序列？（）A.PCRB.WesternBlottingC.ELISAD.RFLP（限制性片段長度多態(tài)性分析）E.電泳8.在酶促反應(yīng)動力學(xué)研究中，米氏常數(shù)（Km）表示什么？（）A.酶的最大反應(yīng)速率B.酶的催化效率C.底物濃度達到一半最大速率時的濃度D.反應(yīng)達到平衡時的底物濃度E.酶的激活能9.下列哪種儀器常用于測定DNA或RNA的濃度和純度？（）A.紫外分光光度計B.高效液相色譜儀C.熒光顯微鏡D.氣相色譜儀E.電子顯微鏡10.在細胞培養(yǎng)過程中，維持無菌環(huán)境的主要目的是？（）A.防止細胞過度增殖B.防止細菌和真菌污染C.提高細胞活力D.促進細胞分化E.降低培養(yǎng)基成本二、判斷題（每題1分，共10分。請將“正確”填在題干后的括號內(nèi)，將“錯誤”填在括號內(nèi)）1.()在進行凝膠電泳時，核酸分子總是從負極向正極遷移。2.()PCR反應(yīng)需要加熱變性、退火和延伸三個基本步驟。3.()SDS是一種基于蛋白質(zhì)分子量大小進行分離的凝膠電泳技術(shù)。4.()質(zhì)粒載體上的抗性基因主要用于篩選成功導(dǎo)入了質(zhì)粒的宿主細胞。5.()親和層析通常利用抗原抗體反應(yīng)來純化目標蛋白。6.()WesternBlotting實驗中，一抗是特異性結(jié)合目標蛋白的抗體，二抗是結(jié)合一抗的酶標抗體。7.()離子交換層析分離蛋白質(zhì)主要利用蛋白質(zhì)分子表面電荷的差異。8.()核酸雜交是指兩種不同核酸分子之間通過堿基互補配對形成的雙鏈結(jié)構(gòu)的過程。9.()酶的比活性是指酶催化單位重量（通常為mg）的酶所具有的反應(yīng)速率。10.()細胞培養(yǎng)必須在無菌條件下進行，以防止微生物污染影響實驗結(jié)果。三、簡答題（每題5分，共30分）1.簡述PCR技術(shù)的基本原理及其關(guān)鍵組成部分。2.簡述凝膠過濾層析（凝膠滲透層析）的分離原理及其應(yīng)用。3.在進行WesternBlotting實驗時，至少需要哪些主要步驟？請簡要說明每步的目的。4.簡述影響酶促反應(yīng)速率的主要因素。5.簡述在細胞培養(yǎng)過程中，如何確保培養(yǎng)環(huán)境的基本要求（如無菌、適宜溫度、pH等）。6.簡述分子克隆實驗中，將目的基因片段插入到質(zhì)粒載體上通常需要哪些關(guān)鍵步驟。四、操作流程圖繪制題（10分）根據(jù)你學(xué)習(xí)的知識，繪制一個簡圖，清晰地展示利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶進行基因片段克隆到質(zhì)粒載體的基本操作流程。要求步驟清晰，至少包含限制性酶切、載體回收、目的基因回收、連接反應(yīng)、轉(zhuǎn)化、篩選等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并用箭頭指示流程方向。五、數(shù)據(jù)分析題（15分）假設(shè)你進行了一個蛋白質(zhì)純化實驗，收集了以下幾個步驟的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）和純化倍數(shù)數(shù)據(jù)：|純化步驟|蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)|純化倍數(shù)||:|:|:||上清液(粗提)|10|1||離子交換層析|3|3||親和層析|1.5|6||凝膠過濾層析|1|15|請根據(jù)以上數(shù)據(jù)：1.計算每次純化步驟后，目標蛋白質(zhì)的回收率（假設(shè)每次處理的起始蛋白質(zhì)總量大致相同，可用純化倍數(shù)近似表示，或進行更精確計算說明）。2.分析該蛋白質(zhì)純化過程中的主要變化（如純度提升、回收率等），并簡要說明親和層析和凝膠過濾層析在該純化方案中的作用。3.如果最終得到的目標蛋白純度為90%，且上清液中的雜蛋白占總蛋白的95%，請大致估算純化后目標蛋白的回收率。六、實驗設(shè)計題（15分）假設(shè)你需要從一個新的物種中克隆其某個未知基因，并且已知該基因可能編碼一種轉(zhuǎn)錄因子。請設(shè)計一個初步的實驗方案，用于獲取該基因的cDNA序列。你的方案應(yīng)至少包含以下內(nèi)容：1.如何從該物種的特定組織中提取總RNA？2.需要設(shè)計什么樣的引物用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA？3.采用何種方法進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)？4.如何從合成的cDNA中擴增出目標基因片段？5.簡述你將如何判斷獲得的PCR產(chǎn)物是否為目標基因的cDNA片段。試卷答案一、選擇題1.D2.A3.D4.A5.A6.C7.D8.C9.A10.B二、判斷題1.正確2.正確3.正確4.正確5.正確6.正確7.正確8.正確9.正確10.正確三、簡答題1.原理：PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）是利用DNA聚合酶在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，特異性地擴增目的DNA片段的技術(shù)。其原理基于DNA雙鏈解旋后，以各自的鏈為模板，由DNA聚合酶合成新的互補鏈，從而實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增。關(guān)鍵組成部分：PCR反應(yīng)體系通常包含：模板DNA（含有目的片段的雙鏈DNA）、特異性引物（兩對，分別與目的片段上下游互補，指引合成起始點）、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq酶，負責合成新鏈）、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸，合成新鏈的原料）、PCR緩沖液（提供Mg2?等必需離子和穩(wěn)定pH環(huán)境）、以及水。2.原理：凝膠過濾層析（也稱凝膠滲透層析或分子排阻層析）是基于分子大小差異進行分離的技術(shù)。其填充劑（如葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）含有貫穿其中的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當樣品溶液流過層析柱時，分子較小的物質(zhì)能夠進入孔隙內(nèi)部，路徑較長，行程較遠；而分子較大的物質(zhì)則無法進入孔隙，只能沿著柱床顆粒間的空隙流過，路徑較短。因此，不同大小的分子因路徑長度不同而得到分離，分子越大，洗脫速度越快。應(yīng)用：主要用于分離、純化蛋白質(zhì)、多肽、多糖等生物大分子，也可用于脫鹽、濃縮等。3.主要步驟及目的：*電泳：將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使混合蛋白質(zhì)按分子量大小分離。*轉(zhuǎn)移：將凝膠中的蛋白質(zhì)通過電泳等方式轉(zhuǎn)移（電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移）到固相載體（如PVDF膜或NC膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜表面。*封閉：將膜用封閉液（如脫脂奶粉、BSA溶液）處理，封閉膜上非特異性結(jié)合位點，防止抗體非特異性結(jié)合。*一抗孵育：將膜與特異性識別目標蛋白的單克隆抗體（一抗）孵育，使其結(jié)合到目標蛋白上。*洗滌：用洗滌液（如TBST）多次洗滌膜，去除未結(jié)合的一抗。*二抗孵育：將膜與結(jié)合了一抗的酶標二抗（或熒光標記二抗）孵育，使酶或熒光標記物連接到目標蛋白上。*洗滌：再次用洗滌液多次洗滌膜，去除未結(jié)合的二抗。*顯色/檢測：通過加入底物使酶標二抗顯色（如化學(xué)發(fā)光、顯色底物），或使用熒光檢測系統(tǒng)，在膜上出現(xiàn)目標蛋白的顯色/熒光條帶。4.主要影響因素：*底物濃度：在一定范圍內(nèi)，底物濃度越高，反應(yīng)速率越快。*酶濃度：酶濃度越高，反應(yīng)速率越快。*溫度：對于需要加熱的酶促反應(yīng)（如DNA聚合酶），溫度是關(guān)鍵因素，過高會降低酶活性甚至變性，過低則反應(yīng)速率慢。*pH值：每種酶都有最適pH值，偏離最適pH值會降低酶的活性。*激活劑：某些酶需要輔因子（金屬離子或有機分子）才能發(fā)揮活性。*抑制劑：抑制劑可以降低酶的活性，分為競爭性、非競爭性等類型。*反應(yīng)時間：反應(yīng)速率隨時間變化，通常會趨近于最大速率。5.確?；疽蟮姆椒ǎ?無菌：在超凈工作臺或生物安全柜中操作，使用無菌的試劑、耗材和工具，對培養(yǎng)基和細胞進行無菌處理（如高壓蒸汽滅菌、過濾除菌），定期進行微生物檢測。*溫度：使用細胞培養(yǎng)箱維持恒定的培養(yǎng)溫度（如37°C對哺乳動物細胞）。*pH：使用緩沖液（如含Hepes的培養(yǎng)基）和CO?培養(yǎng)箱（提供碳酸氫鹽緩沖體系）維持適宜的培養(yǎng)基pH值（如7.2-7.4）。*氣體環(huán)境：CO?培養(yǎng)箱提供適宜的氣體環(huán)境（通常95%空氣+5%CO?）。*營養(yǎng)：使用符合標準的、無菌的細胞培養(yǎng)基和血清等添加物。*定期觀察：觀察細胞生長狀態(tài)、形態(tài)及培養(yǎng)液顏色變化，及時發(fā)現(xiàn)異常。6.關(guān)鍵步驟：*獲取目的基因片段：通過PCR擴增、限制性內(nèi)切酶切割基因文庫等方式獲得目的基因片段。*獲取載體：選擇合適的質(zhì)粒載體，用同一種或兼容的另一種限制性內(nèi)切酶進行酶切，產(chǎn)生粘性末端或平末端。*目的基因與載體連接：將酶切后的目的基因片段和載體混合，加入DNA連接酶，在適宜條件下進行連接反應(yīng)，形成重組質(zhì)粒。*轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細菌細胞（如大腸桿菌）中。*篩選：通過抗生素抗性（如果載體帶有抗性基因）或其他標記（如藍白斑篩選），篩選出成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的細菌。*（后續(xù)步驟未要求）擴增、提取、鑒定等。四、操作流程圖繪制題（此處應(yīng)繪制流程圖，無法用文字完全替代，但可描述關(guān)鍵步驟和箭頭）流程圖應(yīng)從“限制性酶切（目的基因+載體）”開始，箭頭指向“載體回收”，再指向“目的基因回收”，然后指向“連接反應(yīng)”，接著指向“轉(zhuǎn)化”，再指向“篩選”，最后指向“（后續(xù)純化等步驟）”。每個步驟旁需簡要標注操作名稱。五、數(shù)據(jù)分析題1.計算回收率：由于每次處理的起始總量大致相同，純化倍數(shù)可以近似代表回收率（或回收的蛋白量比例）。因此：*上清液：1倍*離子交換層析：3倍*親和層析：6倍*凝膠過濾層析：15倍解析思路：純化倍數(shù)定義為（某步驟后目標蛋白濃度×該步驟后總體積）/（起始目標蛋白濃度×起始總體積）。當起始總量大致不變時，純化倍數(shù)越高，表示回收的相對量越多。2.主要變化及作用分析：*純度提升：從上清液到凝膠過濾層析，純化倍數(shù)從1增加到15，表明純度有顯著提升。離子交換和親和層析起到了主要的富集和純化作用。*回收率：整個過程的總回收率約為15倍（以凝膠過濾層析的回收率為準）。親和層析的純化倍數(shù)（6倍）遠高于離子交換層析（3倍），說明親和層析對目標蛋白的富集能力更強，雜質(zhì)去除效果更好。*親和層析作用：利用目標蛋白與特定配體的特異性結(jié)合（如標簽親和），高效地吸附目標蛋白，同時洗脫掉大量非特異性結(jié)合的雜蛋白。*凝膠過濾層析作用：作為精制步驟，進一步去除與目標蛋白分子量相近的雜蛋白，獲得高純度的目標蛋白。解析思路：通過比較各步驟的純化倍數(shù)，可以判斷純度提升的程度和順序。分析各層析方法的原理，結(jié)合純化倍數(shù)的變化，可以解釋其在整個純化方案中的作用。3.估算回收率：*假設(shè)上清液總蛋白量T，其中目標蛋白占總蛋白的5%，雜蛋白占95%。則起始目標蛋白量=0.05T。*凝膠過濾層析得到的目標蛋白純度為90%，即目標蛋白占總蛋白的90%。設(shè)最終目標蛋白量為P。*根據(jù)凝膠過濾層析的純化倍數(shù)（15倍）：P/(P+雜蛋白量)=0.90*解得：P/雜蛋白量=9。即最終目標蛋白量是雜蛋白量的9倍。*最終總蛋白量=P+雜蛋白量=P+P/9=(10/9)P。*回收率=(最終目標蛋白量/起始目標蛋白量)×100%*回收率=[(10/9)P/(0.05T)]×100%=[(10/9)P/(0.05*P+0.95*T)]×100%*由于P是目標蛋白，T是總蛋白，P遠小于T（雜蛋白占比高），近似為：回收率≈[(10/9)P/(0.95T)]×100%≈[(10/9)/0.95]×(P/T)×100%*起始P/T=0.05，代入：回收率≈[(10/9)/0.95]×0.05×100%≈0.578×5%≈2.89%*或者更直接地，從純化倍數(shù)和最終純度出發(fā)：回收率≈純化倍數(shù)×最終純度=15×0.90=13.5。但這忽略了起始比例的精確影響?；谧罱K純度90%，雜蛋白占10%，目標蛋白占90%，目標蛋白占總量的比例是90%/(90%+10%/9)≈90%/(0.90+0.11)≈90%/1.01≈89%。所以回收率約為89%。解析思路：利用最終純度（目標蛋白占總蛋白比例）和目標蛋白與雜蛋白的比例關(guān)系，可以計算出最終總蛋白中目標蛋白占的比例，進而估算回收率。這里采用更精確的方法計算得到約89