ICS65.020.20

B21

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3860—2020

玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法

Technicalregulationforidentificationofmaizevarietiesandpurity—

SNPmarkermethod

2020-10-13發(fā)布2020-11-13實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3860—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙涵、張?bào)w付、呂遠(yuǎn)大、陳艷萍、林峰、陸海燕、梁帥強(qiáng)。

I

DB32/T3860—2020

玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用SNP（singlenucleotidepolymorphism）標(biāo)記進(jìn)行玉米品種及純度鑒定的原理、儀

器設(shè)備及試劑、引物信息、操作步驟等要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米自交系、單交種及純度的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

SNP標(biāo)記singlenucleotidepolymorphismmarker

基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記。

3.2

推薦引物recommendedprimer

品種鑒定中優(yōu)先選用的一套SNP引物，其檢測(cè)位點(diǎn)多態(tài)性高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好。

3.3

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP,KompetitiveAlleleSpecificPCR）

通過(guò)引物末端特異性堿基競(jìng)爭(zhēng)性匹配DNA模板實(shí)現(xiàn)SNP基因分型的鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)。

3.4

品種純度varietalpurity

品種在DNA分子標(biāo)記基因分型方面一致的程度，用供檢樣品中本品種的種子數(shù)占供檢樣品種子總

數(shù)的百分率表示。

1

DB32/T3860—2020

4原理

玉米基因組中普遍存在著單堿基的變異，不同品種同一SNP位點(diǎn)的基因型可利用適宜引物通過(guò)

KASP檢出，進(jìn)而根據(jù)SNP位點(diǎn)基因型的差異鑒定品種及純度。

5儀器設(shè)備及試劑

見(jiàn)附錄A。

6引物信息

見(jiàn)附錄B。

7操作步驟

7.1樣品DNA提取

7.1.1樣品準(zhǔn)備

試驗(yàn)樣品種子的分樣與保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定。

7.1.2用于品種鑒定樣品DNA提取

從送檢樣品中隨機(jī)抽取10粒種子發(fā)苗。分單株剪取100mg幼苗用液氮研磨，將研磨粉末轉(zhuǎn)入2mL

離心管，加入0.5mL2×CTAB提取緩沖液充分混勻。在55℃～65℃恒浴30min。加入1mL氯仿:異戊

醇（24：1），充分搖動(dòng)5min，8000g，室溫下離心5min。取上清液加入0.6×體積異丙醇，室溫下靜

置30min，5000g，4℃離心5min。沉淀用0.8mL高鹽緩沖液充分溶解，15000g離心2min。上清

加入0.6×體積異丙醇，室溫下靜置30min，5000g，4℃離心5min。沉淀用400μL雙蒸水溶解，加

入2.5×體積95%的預(yù)冷乙醇，﹣20℃冰箱放置2h以上，15000g離心20min。用70%的預(yù)冷乙醇洗

一次，自然干燥后，用200μL0.1×TE緩沖液溶解，置4℃保存。

注：以上為推薦用于品種鑒定的DNA提取方法，其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.1.3用于純度鑒定樣品DNA提取

按GB/T3543.4規(guī)定的方法，從送檢樣品中抽取不少于100粒種子發(fā)苗。分單株剪取0.5cm～1cm

長(zhǎng)的幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔1株幼苗樣品。每孔加入40μLDNA提取試劑盒Ⅰ緩沖液，

在沸水中煮沸30s，然后加入60μLDNA提取試劑盒Ⅱ緩沖液，在沸水中煮沸2min，置4℃保存，保

存不超過(guò)7d。

注：以上為推薦用于純度鑒定的DNA提取方法，其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法都適用于本標(biāo)

準(zhǔn)。

7.2PCR擴(kuò)增

7.2.1引物篩選

用于品種及純度鑒定的40組推薦引物及其序列參見(jiàn)附錄B。

2

DB32/T3860—2020

自行篩選引物時(shí)，取送檢雜交種及父、母本種子各5粒，通過(guò)KASP對(duì)一系列SNP分子標(biāo)記引物

進(jìn)行篩選，確定適宜的引物。適宜引物應(yīng)為能夠清晰區(qū)分雜交種及其父、母本的共顯性引物。

7.2.2PCR反應(yīng)體系

在5μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含0.07μL引物KASPAssaymix，2.5μL2×KASP

Mastermix，50ng模板DNA。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性15min；94℃變性20s，61℃

退火和延伸60s，10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)降低0.6℃；94℃變性20s，55℃退火和延伸60s，26個(gè)循

環(huán)。反應(yīng)利用96孔PCR板在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

7.3基因分型檢測(cè)

在微孔板熒光分析儀上讀取熒光信號(hào),使用熒光結(jié)果處理軟件按照分型明確、NTC(無(wú)樣品陰性對(duì)

照)無(wú)特異性擴(kuò)增的原則進(jìn)行樣品SNP分型。

7.4數(shù)據(jù)采集與判定

7.4.1數(shù)據(jù)記錄

純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X和Y/Y，其中X、Y為同一位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；雜合

位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y；缺失位點(diǎn)等位變異數(shù)據(jù)記錄為-/-。

7.4.2品種鑒定的判定

根據(jù)送檢樣品在40個(gè)SNP位點(diǎn)基因型的差異進(jìn)行品種鑒定，具體判定標(biāo)準(zhǔn)如下：

——差異位點(diǎn)數(shù)≥4，判定為不同品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)≥1且≤3，判定為近似品種；

——差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為極近似或相同品種。

對(duì)利用附錄B中40組引物仍未檢測(cè)到≥4個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，必要時(shí)可增加自行篩選引物進(jìn)行

檢測(cè)。

7.4.3純度鑒定的判定

品種純度按照下列公式計(jì)算：

品種純度%（自交系）=（供檢種子粒數(shù)-非本品種種子粒數(shù)）/供檢種子粒數(shù)×100%

品種純度%（單交種）=（供檢種子粒數(shù)-母本種子粒數(shù)-其他類(lèi)型種子粒數(shù)）/供檢種子粒數(shù)×100%

3

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

儀器設(shè)備及試劑配制

A.1儀器設(shè)備

儀器設(shè)備包括：

——微孔板熒光分析儀；

——PCR擴(kuò)增儀；

——電子天平（感量0.01g，0.001g）；

——冰箱；

——微量加樣器（0.1μL～2.5μL,0.5μL～10μL,20μL～200μL,100μL～1000μL）；

——磁力攪拌器；

——高壓滅菌鍋；

——酸度計(jì)等；

——離心管（0.5mL，1.5mL）；

——吸頭(10μL，200μL，1000μL)；

——96孔PCR板；封板膜；

——一次性手套；

——離心管架；

——水平儀。

A.2試劑配制

A.2.1DNA提取試劑Ⅰ

稱取1g氫氧化鈉溶于99mL水中。

A.2.2DNA提取試劑Ⅱ

取10mL12mol/L的鹽酸溶于470mL水中即成0.25mol/L鹽酸。將0.25mol/L鹽酸與0.5mol/L

Tris(PH8.0)按2：1稀釋。

A.2.31mol/LTris溶液(PH8.0)

稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris），加入800mL雙蒸水中溶解，加入濃鹽酸58.4mL，加水

定容至1000mL。

A.2.40.5mol/LEDTA溶液（PH8.0）

稱取186.6g乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA?2H2O），加入700mL雙蒸水中溶解，加入20g氫氧

化鈉，加水定容至1000mL。

A.2.52×CTAB提取緩沖液

4

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2%CTAB（w/v），100mmol/LTris(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L氯化鈉，1%PVP

Mr40000。稱取20g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，81.9g氯化鈉，10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），

加入100mL1mol/LTris溶液(PH8.0)和40mL0.5mol/LEDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。

A.2.6高鹽緩沖液

10mmol/LTris(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，1mol/L氯化鈉。稱取58.5g氯化鈉,加入10mL

1mol/LTris溶液(PH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。

A.2.70.1xTE緩沖液

1mmol/LTris(pH8.0)，0.1mmol/LEDTA(pH8.0)，1mL1mol/LTris溶液(PH8.0)和0.2mL0.5mol/L

EDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000mL。

A.2.82×KASPMastermix試劑

包含TaqDNA聚合酶、帶有熒光的接頭序列、鎂離子、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP），ROX內(nèi)參

熒光染料。

A.2.9KASPAssaymix

包含46μLddH2O、12μL100μmol/L特異性引物F1、12μL100μmol/L特異性引物F2、30μL100

μmol/L通用引物。

5

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

推薦使用的40組SNP引物序列及其玉米基因組分布

推薦使用的40組SNP引物序列及其玉米基因組分布見(jiàn)表B.1。

表B.140組SNP引物序列及其玉米基因組分布

染引物序列（5'-3'）PCR擴(kuò)增序列（bp）b

引物名稱色擴(kuò)增

正向a反向（通用）起始位置終止位置

體長(zhǎng)度

catgtaaataggaaccttgttctcgtA

JAASKASP11agtcactcaaacatgttcgttgtccaaa443781524437820756

atgtaaataggaaccttgttctcgtC

tgcattggctgacatggtaC

JAASKASP21acttgcagaagctccagagt11233739311233747280

tgcattggctgacatggtaG

agcataactaggacaaccattgaT

JAASKASP31ggaactaatggcacggttcc15820113315820118755

agcataactaggacaaccattgaG

aacatgtgatggtttgggtatgG

JAASKASP41cattcgtcaatgatgtgcagct29275123129275128050

aacatgtgatggtttgggtatgC

cctcctcccaacaatgtcagcA

JAASKASP52gattgtttrtgccatataacttgcaggttt2501058250110952

ctcctcccaacaatgtcagcG

agcattctacatgtcgcgcA

JAASKASP62ggagaacctcgtcgatagcg875197218751977151

agcattctacatgtcgcgcC

ttgaaatgttacgaatgtaaggacT

JAASKASP72ggctgctctaaattacggca12634182512634187854

ttgaaatgttacgaatgtaaggacC

ccactagcagaagcaatgcaaA

JAASKASP82gcacacagtttggtgacatgt23617325523617331258

ccactagcagaagcaatgcaaG

acatgaagaagagccacgaA

JAASKASP93tgcttccagttccaagctcc106922091069227466

acatgaagaagagccacgaG

cctccactttgtcatcgttccA

JAASKASP103tgtgtgccattaatgatgcact657910396579109658

cctccactttgtcatcgttccT

tcgagtagtgtaagtggtagcaA

JAASKASP113acgaattcttgtgctcccca16918005116918013383

tcgagtagtgtaagtggtagcaC

gctagagatccaagatttgtttgtT

JAASKASP123gtgaagacggtcgtttgtgc21090261521090268571

gctagagatccaagatttgtttgtC

tcacctccttttccggcaaC

JAASKASP134gctctgacttggaatgccca6610435661048551

tcacctccttttccggcaaG

gctcttgtgtattcgggcaC

JAASKASP144aacacatgaagcgagacgga337281133372816250

gctcttgtgtattcgggcaG

cagatctgattgcttgttattggtA

JAASKASP154aggagtagctcgatcagatgt17054451317054456452

cagatctgattgcttgttattggtG

6

DB32/T3860—2020

表B.140組SNP引物序列及其玉米基因組分布（續(xù)）

ttcccagatctacaacaggatgcA

JAASKASP164cagtgacrtcaccaagcaatctaaagat23901467423901473461

cccagatctacaacaggatgcG

actttattgtccccagctagttttA

JAASKASP175aaattagactgcggctgccc324820053248208278

actttattgtccccagctagttttG

agttagccactctaatctgtccaG

JAASKASP185aagttaatctakattagctggccttcttgt718752117187526454

tagttagccactctaatctgtccaA

gcgagcttggattagatagtttgA

JAASKASP195ctctgcatgacaacctccga14751903014751908758

gcgagcttggattagatagtttgG

cgtatcacaaactcgcacgatT

JAASKASP205tggatgaaagtggcgtttgc17403606117403611959

cgtatcacaaactcgcacgatC

cattgcaaggctcctgaacA

JAASKASP216ggaaccagagcgcaaacatag6019073601917098

cattgcaaggctcctgaacG

acatactctcgacagattagttggA

JAASKASP226tcgacgatcagttccgtagc763994517639950151

acatactctcgacagattagttggG

acctctttacaccccttcacaT

JAASKASP236aggcaagccatggagtttct817739598177403678

acctctttacaccccttcacaG

ctgctatagtgctagttacatggtA

JAASKASP246cgagcagccgtgattttcaa14227410814227416962

ctgctatagtgctagttacatggtG

agcactgtgcaacagctaccaC

JAASKASP257tccaaaaccactgcaaacataaaggctaa202581842025826279

cagcactgtgcaacagctaccaT

gcggaggtagaaatttgggttT

JAASKASP267cggcggtggttttgattcag848808278488089569

gcggaggtagaaatttgggttA

gcatcaccaaagtcaccagtgcA

JAASKASP277gctgaagttggcgtcatgatggtta10353577810353582952

catcaccaaagtcaccagtgcG

tagcagagctgatcggagcC

JAASKASP287tacaagtggtcgtgcgtctt16138816416138822158

tagcagagctgatcggagcA

acgaccagatccatgaaaaggatA

JAASKASP298tcgacgacaagatgtgggtg328644353286449056

acgaccagatccatgaaaaggatC

agtggttgtttctagccaacA

JAASKASP308aaagcagccaaacagaccct894758558947591763

agtggttgtttctagccaacC

tgttattggtggggtgggaA

JAASKASP318ttccaccgtccaacagacat10197099010197103950

tgttattggtggggtgggaC

ccggttcgatgccacacatA

JAASKASP328ggtttgatgcaccaccacac17484108917484117587

ccggttcgatgccacacatC

aagcacacctcaggctggaC

JAASKASP339gccagctatcatccacaggg166822271668229165

aagcacacctcaggctggaT

catctgttaagttaaggcccttatA

JAASKASP349gccaagatgggaggtttgga663294236632947654

catctgttaagttaaggcccttatC