2025年大學(xué)《生物技術(shù)》專(zhuān)業(yè)題庫(kù)——高效基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)化考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡(jiǎn)述電穿孔法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的原理，并列舉至少三個(gè)影響電穿孔效率的關(guān)鍵參數(shù)。二、比較脂質(zhì)體介導(dǎo)法和基于陽(yáng)離子聚合物的基因轉(zhuǎn)染方法在原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍上的主要差異。三、在優(yōu)化針對(duì)CHO細(xì)胞的腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率時(shí)，除了調(diào)整病毒滴度和細(xì)胞密度外，還可以考慮哪些實(shí)驗(yàn)條件或策略進(jìn)行優(yōu)化？請(qǐng)至少列舉四種。四、某研究者在轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率較低。他嘗試了增加脂質(zhì)體與DNA的摩爾比，但效果不佳。請(qǐng)分析可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下的原因（至少列舉三點(diǎn)），并提出相應(yīng)的優(yōu)化建議。五、設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，旨在優(yōu)化將一個(gè)報(bào)告基因（如GFP）穩(wěn)定整合到肝癌細(xì)胞系HepG2中的效率。方案應(yīng)包括選擇的主要轉(zhuǎn)染方法、至少兩個(gè)關(guān)鍵優(yōu)化參數(shù)及其預(yù)設(shè)的調(diào)整梯度、對(duì)照組的設(shè)置以及預(yù)期檢測(cè)效率的指標(biāo)。六、簡(jiǎn)述在優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染過(guò)程時(shí)，使用輔助質(zhì)粒（如穿梭質(zhì)粒）或小分子化學(xué)助劑可能起到的作用。請(qǐng)分別舉例說(shuō)明。七、解釋什么是MOI（感染復(fù)數(shù)），并說(shuō)明在評(píng)估病毒載體轉(zhuǎn)染效率時(shí)，如何通過(guò)設(shè)置不同MOI的實(shí)驗(yàn)組來(lái)確定最佳感染復(fù)數(shù)。試卷答案一、電穿孔法利用高強(qiáng)度的電場(chǎng)瞬間使細(xì)胞膜上形成可逆的親水孔道（電孔），使帶電的外源DNA易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。影響電穿孔效率的關(guān)鍵參數(shù)包括：電場(chǎng)強(qiáng)度（電壓）、電容（電容量）、脈沖寬度、脈沖次數(shù)、電擊時(shí)間、電擊緩沖液成分（離子強(qiáng)度、pH）、細(xì)胞密度、細(xì)胞類(lèi)型、DNA濃度等。二、脂質(zhì)體介導(dǎo)法利用脂質(zhì)分子在細(xì)胞膜附近形成脂質(zhì)雙分子層包裹DNA，通過(guò)膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是制備相對(duì)簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞毒性較低、可表面修飾以提高靶向性。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率可能受細(xì)胞類(lèi)型影響較大、穩(wěn)定性不如病毒載體。適用于短期基因表達(dá)研究、基因治療載體開(kāi)發(fā)（非整合型）等?；陉?yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染方法利用陽(yáng)離子聚合物（如聚乙烯亞胺PEI）與帶負(fù)電的DNA形成復(fù)合物，通過(guò)靜電作用或內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高（尤其對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、操作簡(jiǎn)便、成本較低。缺點(diǎn)是可能存在一定的細(xì)胞毒性、聚合物純度要求高。適用于多種細(xì)胞類(lèi)型，尤其是一些轉(zhuǎn)染難度大的細(xì)胞系。三、優(yōu)化腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率時(shí)可考慮的策略包括：1.優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如調(diào)整培養(yǎng)基成分（血清、脂質(zhì)體等加入時(shí)間）、更換更優(yōu)的轉(zhuǎn)染試劑或方法；2.對(duì)病毒載體進(jìn)行改造，如優(yōu)化衣殼蛋白、降低病毒滴度以減少毒性；3.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，如使用血清饑餓、同步化細(xì)胞周期或預(yù)處理試劑提高細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性；4.優(yōu)化細(xì)胞狀態(tài)，如確保細(xì)胞處于對(duì)轉(zhuǎn)染敏感的生長(zhǎng)階段（如對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）、調(diào)整細(xì)胞密度至最佳范圍。四、原因分析：1.脂質(zhì)體/DNA比例不當(dāng)可能導(dǎo)致復(fù)合物形成不佳或細(xì)胞內(nèi)釋放效率低；2.細(xì)胞密度過(guò)高可能抑制轉(zhuǎn)染或?qū)е聝?nèi)吞作用飽和；3.培養(yǎng)基中血清等成分可能干擾脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的相互作用；4.DNA質(zhì)量或濃度問(wèn)題；5.轉(zhuǎn)染操作手法不當(dāng)。優(yōu)化建議：1.針對(duì)比例問(wèn)題，系統(tǒng)優(yōu)化脂質(zhì)體/DNA摩爾比，尋找最佳配比；2.調(diào)整細(xì)胞密度，嘗試較低密度轉(zhuǎn)染；3.優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程，如更換血清-free培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后一段時(shí)間再補(bǔ)加血清；4.確保使用高質(zhì)量的DNA并優(yōu)化其濃度；5.改進(jìn)操作步驟，確保轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞充分混合。五、實(shí)驗(yàn)方案：轉(zhuǎn)染方法選擇：脂質(zhì)體介導(dǎo)法（因其適用性廣且對(duì)CHO細(xì)胞相對(duì)友好）。優(yōu)化參數(shù)與梯度：1.脂質(zhì)體/DNA摩爾比：設(shè)置梯度，如1:1,2:1,3:1,4:1；2.轉(zhuǎn)染時(shí)間：設(shè)置梯度，如4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)。對(duì)照組設(shè)置：1.空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）；2.陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染不含報(bào)告基因的空載體）；3.陽(yáng)性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染已知效率高的報(bào)告基因載體，或使用其他確認(rèn)高效的轉(zhuǎn)染方法）。效率檢測(cè)指標(biāo)：通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP熒光強(qiáng)度并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，或使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比，或通過(guò)qPCR檢測(cè)報(bào)告基因mRNA水平，或通過(guò)WesternBlot檢測(cè)報(bào)告基因蛋白水平。六、輔助質(zhì)粒作用：輔助質(zhì)粒通常與目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，利用其與宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的相互作用，提高目標(biāo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率或表達(dá)水平。1.穿梭質(zhì)粒/載體：利用穿梭質(zhì)粒（如pCMV）能在多種宿主細(xì)胞中復(fù)制或表達(dá)的能力，或利用其與病毒載體系統(tǒng)（如Adenovirus、AAV）的兼容性，輔助病毒載體包裝或提高其轉(zhuǎn)染/感染效率。2.選擇性標(biāo)記質(zhì)粒：攜帶抗藥性基因（如Neo、G418、Hyg）或熒光標(biāo)記基因（如mCherry），用于篩選成功轉(zhuǎn)染了目標(biāo)基因的細(xì)胞。小分子化學(xué)助劑作用：通過(guò)非特異性或特異性方式促進(jìn)轉(zhuǎn)染。1.非特異性助劑：如陽(yáng)離子脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺（PEI）等，通過(guò)形成復(fù)合物幫助DNA跨膜。2.特異性助劑：如靶向特定細(xì)胞表面受體的試劑，或能增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性的試劑，提高特定細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)染效率。七、MOI（感染復(fù)數(shù)）是指平均每個(gè)宿主細(xì)胞接收到的病毒顆粒數(shù)，計(jì)算公式為：MOI=病毒滴度(PFU/μL)×加入病毒的體積(μL)/細(xì)胞總數(shù)(細(xì)胞數(shù))。通過(guò)設(shè)置不同MOI的實(shí)驗(yàn)組來(lái)確定最佳感染復(fù)數(shù)的方法：1.選擇一系列遞增的MOI值，例如0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0。2.在相同條件下，將不同MOI的病毒載體分別轉(zhuǎn)染相同的細(xì)胞數(shù)量。3.轉(zhuǎn)染后一定時(shí)間（通常待病毒復(fù)制產(chǎn)生明顯效果后），通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)（如熒光強(qiáng)度、酶活性、蛋白量）或病