2025年大學(xué)《生物信息學(xué)》專(zhuān)業(yè)題庫(kù)——RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析考試時(shí)間：______分鐘總分：______分姓名：______一、簡(jiǎn)述RNA測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)相比傳統(tǒng)表達(dá)譜芯片技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)。二、在RNA-Seq數(shù)據(jù)分析流程中，進(jìn)行讀段質(zhì)量控制（QC）時(shí)，通常會(huì)關(guān)注哪些關(guān)鍵指標(biāo)？請(qǐng)列舉至少三項(xiàng)，并簡(jiǎn)述其意義。三、解釋什么是“參考基因組”。在RNA-Seq讀段比對(duì)過(guò)程中，使用參考基因組的重要性體現(xiàn)在哪些方面？四、比較featureCounts和RSEM這兩種常用的RNA-Seq定量方法在原理、輸出結(jié)果（特別是計(jì)數(shù)值）和適用場(chǎng)景上的主要異同點(diǎn)。五、在使用DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析時(shí)，為何需要進(jìn)行文庫(kù)大小因子（LibrarySizeFactor）的計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化？請(qǐng)解釋其背后的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理。六、簡(jiǎn)述在RNA-Seq差異表達(dá)分析中，使用火山圖（VolcanoPlot）進(jìn)行結(jié)果可視化時(shí)，圖中橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表什么信息？如何通過(guò)火山圖初步篩選顯著且差異幅度較大的基因？七、在進(jìn)行基因集富集分析（如GO富集分析）時(shí)，常用的P值調(diào)整方法有哪些？簡(jiǎn)述其目的和區(qū)別。八、假設(shè)你獲得了一組來(lái)自處理組和對(duì)照組的RNA-Seq數(shù)據(jù)，處理組發(fā)生了某種生物學(xué)變化。請(qǐng)簡(jiǎn)述你將如何設(shè)計(jì)一個(gè)基本的分析流程，以探究該變化對(duì)基因表達(dá)的影響？請(qǐng)列出主要步驟，并說(shuō)明每個(gè)步驟選擇方法的理由（至少涉及比對(duì)、定量和差異分析三個(gè)環(huán)節(jié)）。九、在RNA-Seq數(shù)據(jù)分析中，什么是重復(fù)序列（或低復(fù)雜度區(qū)域）？它們可能對(duì)哪些分析環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響？通常采用哪些策略來(lái)應(yīng)對(duì)這些影響？十、某研究者在進(jìn)行RNA-Seq分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分樣本的比對(duì)率（MappingRate）偏低。請(qǐng)列舉可能導(dǎo)致這種情況的幾種原因，并簡(jiǎn)述相應(yīng)的解決思路。試卷答案一、RNA-Seq技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)包括：1.動(dòng)態(tài)范圍廣：能夠檢測(cè)極低豐度和極高豐度的轉(zhuǎn)錄本，而芯片技術(shù)容易飽和或無(wú)法檢測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本。2.無(wú)需預(yù)設(shè)計(jì)探針：可發(fā)現(xiàn)基因組中未知或新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本、可變剪接體等，而芯片需要預(yù)先合成針對(duì)已知基因的探針。3.物種通用性：只需已知物種的參考基因組即可進(jìn)行分析，不受雜交特異性限制，易于應(yīng)用于新物種研究。4.定量精度高：結(jié)合計(jì)算方法，可實(shí)現(xiàn)更精確的基因和轉(zhuǎn)錄本豐度定量。二、QC時(shí)關(guān)注的關(guān)鍵指標(biāo)及其意義：1.平均堿基質(zhì)量值（Per-baseQualityScore）：反映測(cè)序讀段整體和每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量。高且穩(wěn)定的質(zhì)量值是可靠分析的基礎(chǔ)。2.讀段長(zhǎng)度分布（ReadLengthDistribution）：了解樣本中產(chǎn)生的讀段長(zhǎng)度是否符合預(yù)期，是否存在明顯偏短或偏長(zhǎng)的讀段，這可能與文庫(kù)構(gòu)建或測(cè)序過(guò)程有關(guān)。3.GC含量分布（GCContentDistribution）：檢查樣本中讀段的GC含量是否在正常范圍內(nèi)或呈現(xiàn)異常峰，可能指示PCR擴(kuò)增偏好或存在污染。4.(可選)去除率（trimmingrate）：如果進(jìn)行了讀段修剪，去除率可以反映低質(zhì)量堿基或引物序列被去除的比例。三、參考基因組是經(jīng)過(guò)測(cè)序和注釋的、代表某一物種全部遺傳信息的DNA序列匯編。其重要性體現(xiàn)在：1.比對(duì)基礎(chǔ)：是將RNA-Seq產(chǎn)生的原始讀段（Reads）進(jìn)行定位和映射的依據(jù)，確定讀段來(lái)源于基因組的哪個(gè)位置。2.特征注釋?zhuān)簠⒖蓟蚪M通常包含基因注釋信息（如基因ID、外顯子位置等），比對(duì)后可關(guān)聯(lián)讀段到具體的基因或轉(zhuǎn)錄本上。3.標(biāo)準(zhǔn)化前提：比對(duì)是后續(xù)計(jì)算基因表達(dá)量（如featureCounts,RSEM）和進(jìn)行差異分析的前提步驟，準(zhǔn)確的比對(duì)位置是量化表達(dá)的基礎(chǔ)。四、featureCounts與RSEM的主要異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：1.應(yīng)用目的：都用于估計(jì)RNA-Seq數(shù)據(jù)中每個(gè)基因或轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)/絕對(duì)豐度。2.輸入輸出：都需要參考基因組注釋文件和比對(duì)后的讀段文件作為輸入，輸出通常是基因/轉(zhuǎn)錄本的計(jì)數(shù)值矩陣。3.依賴(lài)注釋?zhuān)憾紘?yán)重依賴(lài)高質(zhì)量的基因組注釋文件。不同點(diǎn)：1.原理：featureCounts基于讀段計(jì)數(shù)，直接統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因/轉(zhuǎn)錄本包含的讀段數(shù)量；RSEM基于模型，將讀段比對(duì)到基因的不同位置（外顯子），并使用混合模型估計(jì)每個(gè)外顯子的使用率，進(jìn)而計(jì)算基因表達(dá)量。2.輸出結(jié)果：featureCounts輸出的是每個(gè)基因/轉(zhuǎn)錄本的讀段計(jì)數(shù)；RSEM輸出的是每個(gè)基因/轉(zhuǎn)錄本的豐度估計(jì)值（如FPKM/TPM），考慮了讀段長(zhǎng)度和可變剪接的影響。3.適用場(chǎng)景：*featureCounts計(jì)算簡(jiǎn)單快速，結(jié)果直觀（計(jì)數(shù)值），適用于快速獲取基因?qū)用娴谋磉_(dá)概況，尤其適合比對(duì)質(zhì)量較高、重復(fù)序列較少的數(shù)據(jù)。*RSEM考慮了外顯子長(zhǎng)度和可變剪接，定量結(jié)果更接近轉(zhuǎn)錄本豐度，在需要精確定量或分析可變剪接事件時(shí)更優(yōu)，但計(jì)算相對(duì)復(fù)雜。五、進(jìn)行文庫(kù)大小因子計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化的原因及原理：1.原因：不同樣本的RNA輸入量、文庫(kù)擴(kuò)增效率可能不同，導(dǎo)致不同文庫(kù)產(chǎn)生的原始讀段數(shù)量（庫(kù)大?。┎町惥薮?。直接比較原始計(jì)數(shù)值會(huì)高估來(lái)自庫(kù)大小較大的樣本的基因表達(dá)量。2.原理：文庫(kù)大小因子是每個(gè)樣本庫(kù)大小與其平均庫(kù)大小的比值。通過(guò)將每個(gè)樣本的基因計(jì)數(shù)值除以該樣本的文庫(kù)大小因子，進(jìn)行歸一化處理，使得所有樣本的計(jì)數(shù)值處于相似尺度上。這相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了一個(gè)“相對(duì)稀釋”，消除了庫(kù)大小差異帶來(lái)的系統(tǒng)性偏差，使得不同樣本間的基因表達(dá)水平具有可比性。其本質(zhì)是進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使比較基于相對(duì)表達(dá)而非絕對(duì)讀段數(shù)。六、火山圖的橫縱坐標(biāo)及篩選方法：1.橫坐標(biāo)：通常代表基因表達(dá)差異的FoldChange（倍數(shù)變化），即處理組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。正值表示處理組表達(dá)上調(diào)，負(fù)值表示下調(diào)。2.縱坐標(biāo)：通常代表基因表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)顯著性，常用負(fù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的P值（-log10(P-value)）表示。數(shù)值越大，表示差異越顯著（P值越?。?。3.篩選方法：通過(guò)火山圖可以初步篩選出同時(shí)滿(mǎn)足高表達(dá)差異（FoldChange絕對(duì)值大于某個(gè)閾值，如2倍或倍數(shù)變化>1.5）和高度顯著（P值小于某個(gè)閾值，如0.05，對(duì)應(yīng)于-y軸上的某個(gè)數(shù)值）的基因。這些基因通常具有生物學(xué)意義，值得進(jìn)一步關(guān)注。七、常用的P值調(diào)整方法及其目的和區(qū)別：1.Bonferroni校正：目的是最保守的調(diào)整方法，通過(guò)將顯著性水平（α）除以進(jìn)行檢驗(yàn)的總基因數(shù)來(lái)降低假陽(yáng)性率。優(yōu)點(diǎn)是控制Family-wiseErrorRate（FWER），缺點(diǎn)是過(guò)于保守，可能導(dǎo)致大量真陽(yáng)性被錯(cuò)誤地剔除。適用于檢驗(yàn)假設(shè)相互獨(dú)立的情況。2.Benjamini-Hochberg（BH）校正（或FDR）：目的是在控制假發(fā)現(xiàn)率（FalseDiscoveryRate，即被錯(cuò)誤標(biāo)記為顯著的總比例）的前提下，盡可能發(fā)現(xiàn)更多的真陽(yáng)性。相比Bonferroni，它允許一定比例的假陽(yáng)性，但能檢測(cè)到更多的生物學(xué)上真實(shí)的差異。在RNA-Seq等高通量數(shù)據(jù)中應(yīng)用更廣泛，因?yàn)樗诳刂棋e(cuò)誤率的同時(shí)提高了發(fā)現(xiàn)能力。3.其他方法：如Holm校正（順序Bonferroni）、Hochberg校正（非順序Bonferroni）等，在控制FWER方面比Bonferroni更靈活，通常比Bonferroni寬松一些。八、基本分析流程設(shè)計(jì)：1.數(shù)據(jù)預(yù)處理與質(zhì)控：使用FastQC檢查原始讀段質(zhì)量；根據(jù)質(zhì)量報(bào)告進(jìn)行修剪（如Trimmomatic）；使用MultiQC匯總QC結(jié)果。目的：去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，保證輸入比對(duì)的數(shù)據(jù)質(zhì)量。2.讀段比對(duì)：選擇合適的比對(duì)工具（如STAR或HISAT2），將處理組和對(duì)照組的讀段分別比對(duì)到參考基因組上。目的：將RNA讀段定位到基因組上的可能位置（基因、轉(zhuǎn)錄本）。3.表達(dá)定量：使用featureCounts或RSEM（或Salmon）計(jì)算每個(gè)基因（或轉(zhuǎn)錄本）在處理組和對(duì)照組中的表達(dá)量（如讀段計(jì)數(shù)或FPKM/TPM值）。featureCounts用于快速獲取計(jì)數(shù)值，RSEM/Salmon考慮了長(zhǎng)度和可變剪接，定量更精確。目的：獲得各樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的豐度估計(jì)。4.差異表達(dá)分析：使用DESeq2或edgeR等R包進(jìn)行差異表達(dá)分析。輸入定量結(jié)果，進(jìn)行方差建模、歸一化、統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，得到基因的FoldChange和調(diào)整后的P值（如FDR）。目的：識(shí)別在處理組中表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組發(fā)生顯著變化的基因。5.結(jié)果解讀與可視化：使用火山圖、熱圖等可視化工具展示差異表達(dá)結(jié)果；對(duì)顯著差異基因進(jìn)行功能注釋和富集分析（如GO或KEGG）；結(jié)合生物學(xué)背景解釋結(jié)果的生物學(xué)意義。選擇方法的理由：*比對(duì)：STAR和HISAT2是目前主流的高效比對(duì)工具，選擇其一即可滿(mǎn)足需求。*定量：featureCounts計(jì)算快，適合初步分析或關(guān)注計(jì)數(shù)值；RSEM/Salmon定量更準(zhǔn)確，考慮可變剪接，適合深入分析?？筛鶕?jù)研究需求選擇。*差異分析：DESeq2是目前最常用且功能強(qiáng)大的R包之一，易于使用，結(jié)果可靠，適合處理組間差異分析。九、重復(fù)序列（或低復(fù)雜度區(qū)域）及其影響與應(yīng)對(duì)策略：1.定義：重復(fù)序列指基因組中大量存在的、序列相同的片段（如Alu元件、衛(wèi)星DNA）或區(qū)域（如高度GC富集區(qū)、AT富集區(qū)）。低復(fù)雜度區(qū)域指堿基組成高度單一或變化極小的區(qū)域。2.影響：*比對(duì)：比對(duì)工具可能難以準(zhǔn)確區(qū)分來(lái)自同一重復(fù)序列的來(lái)自不同樣本的讀段（產(chǎn)生多值映射），或錯(cuò)誤地將非同源的讀段比對(duì)到重復(fù)區(qū)域。*定量：可能導(dǎo)致某些基因的計(jì)數(shù)值被錯(cuò)誤分配或過(guò)高估計(jì)，影響差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。*序列分析：可能干擾結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)、基因組組裝等分析。3.應(yīng)對(duì)策略：*在比對(duì)前移除：使用工具（如TruSeqAdapterRemoval,UMI-tools中的extract_barcode_andUMI）去除文庫(kù)特有的引物、接頭序列，這些通常位于重復(fù)區(qū)域。*使用特異性引物/探針：設(shè)計(jì)引物或探針時(shí)盡量避開(kāi)重復(fù)序列區(qū)域。*選擇合適的比對(duì)參數(shù)：一些比對(duì)工具允許設(shè)置參數(shù)以處理重復(fù)區(qū)域（如STAR的--alignSJDBoverlap參數(shù)）。*基因組預(yù)處理：對(duì)參考基因組進(jìn)行預(yù)處理，如使用repetitiveMasker進(jìn)行重復(fù)序列注釋?zhuān)嬷葘?duì)工具避開(kāi)這些區(qū)域。*在分析中考慮：某些分析方法（如RSEM）在設(shè)計(jì)時(shí)就考慮了重復(fù)序列的影響。在結(jié)果解讀時(shí)，需注意重復(fù)基因可能存在的表達(dá)波動(dòng)。十、比對(duì)率偏低的原因及解決思路：1.RNA質(zhì)量差：RNA降解嚴(yán)重、純度低（如存在DNA污染）、或起始量不足。*解決：提高RNA提取質(zhì)量，確保RIN值（或類(lèi)似指標(biāo)）合格；使用高質(zhì)量的水；優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄或PCR條件；增加RNA輸入量。2.文庫(kù)構(gòu)建問(wèn)題：引物/adaptor使用過(guò)量或不足、PCR擴(kuò)增效率低、文庫(kù)片段化不均或過(guò)大/過(guò)小。*解決：優(yōu)化文庫(kù)構(gòu)建流程，精確控制引物/adaptor用量；檢查PCR條件；確保文庫(kù)在目標(biāo)大小范圍內(nèi)且分布均勻。3.參考基因組問(wèn)題：使用的參考基因組版本過(guò)舊，缺少樣本物種特有的基因或新近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致部分讀段無(wú)法比對(duì)。