ICS65.020

CCSB33

35

福建省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB35/T1993—2021

果蔗脫毒種苗質(zhì)量與技術(shù)

Qualityandtechnicalrequirementsforpathogen-freeplantofchewingcane

2021-08-17發(fā)布2021-11-17實(shí)施

福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB35/T1993—2021

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4種苗脫毒與繁殖.....................................................................2

5質(zhì)量要求...........................................................................2

6有害生物檢測(cè)對(duì)象...................................................................4

7檢測(cè)方法...........................................................................5

8抽樣...............................................................................9

9包裝、標(biāo)簽、存儲(chǔ)及運(yùn)輸.............................................................9

I

DB35/T1993—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。

本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)

測(cè)試中心、福建省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。

本文件主要起草人：高三基、傅華英、黃美婷、鄭海梅、黃國(guó)強(qiáng)、王錦達(dá)、張慧麗、鄧祖湖。

II

DB35/T1993—2021

果蔗脫毒種苗質(zhì)量與技術(shù)

1范圍

本文件規(guī)定了果蔗種苗脫毒與繁殖、質(zhì)量要求、有害生物檢測(cè)對(duì)象、檢測(cè)方法、抽樣和包裝、標(biāo)簽、

存儲(chǔ)及運(yùn)輸。

本文件適用于福建省內(nèi)果蔗脫毒種苗的繁殖與質(zhì)量檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T1488農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程甘蔗

NY/T1796甘蔗種苗

NY/T2724甘蔗脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

NY/T3172甘蔗種苗脫毒技術(shù)規(guī)范

NY/T3754甘蔗品種真實(shí)性鑒定SSR分子標(biāo)記法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

瓶苗bottleplantlet

將果蔗莖尖和腋芽的頂端分生組織作為外植體，在無(wú)菌操作條件下接種于無(wú)菌培養(yǎng)基上，并在一定

的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)叢芽增殖和壯苗繼代培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根等過(guò)程，最終發(fā)育成根、莖、

葉俱全的果蔗植株種苗。

3.2

穴盤(pán)苗plugplantlet

將瓶苗假植于裝有營(yíng)養(yǎng)土的塑料穴盤(pán)或育苗袋中，并置于具有防蟲(chóng)網(wǎng)（適宜目數(shù)為40～60目）隔離

條件下的溫室或網(wǎng)室內(nèi)，經(jīng)過(guò)水肥精細(xì)管理，培育成可供大田定植的果蔗植株種苗。

3.3

種莖seedcane

果蔗頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以下帶有健康、可萌發(fā)芽的蔗莖或蔗莖段，可作為大田生產(chǎn)種植用的果蔗種苗（簡(jiǎn)

稱(chēng)蔗種）。

3.4

遺傳變異株abnormalplantlet

在組織培養(yǎng)過(guò)程中果蔗植株的遺傳特性發(fā)生了改變，其形態(tài)或DNA指紋圖譜表現(xiàn)出有別于原品種特

征的植株。

1

DB35/T1993—2021

3.5

目標(biāo)有害生物targetedpests

為害果蔗種苗的目標(biāo)病原（病毒和細(xì)菌）、病原真菌和昆蟲(chóng)。

4種苗脫毒與繁殖

4.1無(wú)目標(biāo)病原苗的獲得

4.1.1莖尖培養(yǎng)脫毒苗

按照NY/T2724和NY/T3172的規(guī)定，經(jīng)莖尖培養(yǎng)方法獲得無(wú)目標(biāo)病原的瓶苗、無(wú)瓊脂苗和穴盤(pán)苗等。

4.1.2腋芽培養(yǎng)脫毒苗

蔗莖取回并清洗后，在52℃熱水處理30min（內(nèi)含25%多菌靈可濕性粉劑400倍液），然后在38℃～

42℃溫度下催芽6d～10d后，取腋芽的莖尖培養(yǎng)、繁殖成苗。

4.1.3無(wú)毒苗圃組培苗

采用經(jīng)檢測(cè)不攜帶目標(biāo)病原的種苗，在隔離網(wǎng)室的環(huán)境下長(zhǎng)成的植株。

4.2脫毒種苗繁殖與管理

4.2.1繁殖基地選擇

原種、基礎(chǔ)種繁殖基地選擇排灌方便、水旱輪作、自然隔離條件較好的基地。生產(chǎn)用種繁殖選擇在

有一定灌溉條件和隔離條件的繁育基地。

4.2.2田間病原控制

無(wú)目標(biāo)病原的脫毒種苗在6～9個(gè)月生長(zhǎng)期間做好病蟲(chóng)害防治。在果蔗生長(zhǎng)各生育期和采收前進(jìn)行田

間巡查，發(fā)現(xiàn)有目標(biāo)病原和其它病原侵染的病株及時(shí)清除。

5質(zhì)量要求

5.1整體要求

種苗植株健壯、完整，葉色正常、根系發(fā)達(dá)，無(wú)污染、無(wú)病蟲(chóng)為害，無(wú)遺傳變異。

5.2脫毒瓶苗

按照NY/T1796和NY/T2724的規(guī)定，要求根系有分叉，有主根及側(cè)根，葉色淺綠，生長(zhǎng)正常，無(wú)遺

傳變異，無(wú)污染。脫毒瓶苗質(zhì)量分為一級(jí)、二級(jí)兩個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表1。

表1果蔗脫毒瓶苗等級(jí)劃分

項(xiàng)目指標(biāo)

等級(jí)一級(jí)二級(jí)

假莖有（+）有（+）

2

DB35/T1993—2021

表1果蔗脫毒瓶苗等級(jí)劃分（續(xù)）

項(xiàng)目指標(biāo)

完全展開(kāi)葉

≥4≥3，＜4

片

株高

≥5.0≥3.5，＜5.0

cm

1.0cm以上白色根

≥4≥2，＜4

條

目標(biāo)病原檢出率

不得檢出不得檢出

%

遺傳變異率

不得檢出不得檢出

%

5.3脫毒穴盤(pán)苗

按照NY/T1796和NY/T2724的規(guī)定，要求植株健壯，葉色正常，根系生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲(chóng)為害，無(wú)遺

傳變異株。脫毒穴盤(pán)苗質(zhì)量分為一級(jí)、二級(jí)兩個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表2。

表2果蔗脫毒穴盤(pán)苗等級(jí)劃分

項(xiàng)目指標(biāo)

等級(jí)一級(jí)二級(jí)

新出葉

≥6≥4，＜6

片

假莖株高

≥12.0≥8.0，＜12.0

cm

假莖莖粗

≥0.3≥0.2，＜0.3

cm

3.0cm以上白色根

≥4≥2，＜4

條

目標(biāo)病原檢出率

不得檢出不得檢出

%

遺傳變異率

不得檢出不得檢出

%

5.4脫毒種莖

按照NY/T1796的規(guī)定，要求蔗莖新鮮、蔗芽飽滿(mǎn)、蔗莖節(jié)上根點(diǎn)無(wú)萌發(fā)，大田種植后無(wú)遺傳變異

株。脫毒種莖質(zhì)量分為一級(jí)、二級(jí)兩個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表3。

3

DB35/T1993—2021

表3果蔗脫毒種莖等級(jí)劃分

項(xiàng)目指標(biāo)

等級(jí)一級(jí)二級(jí)

品種純度

100100

%

夾雜物率

≤1.0≤1.0

%

種莖莖徑

≥2.5≥2.0，＜2.5

cm

含水量

70～8070～80

%

發(fā)芽率

≥80.0≥75.0，＜80.0

%

螟害節(jié)率

≤1.0＞1.0，≤3.0

%

目標(biāo)病原檢出率

≤1.0＞1.0，≤3.0

%

其他主要病害發(fā)病株率

≤3.0＞3.0，≤5.0

%

注：其他主要病害指為害果蔗的黑穗病和梢腐病。

5.5不合格種苗處理

脫毒瓶苗、穴盤(pán)苗目標(biāo)病原檢測(cè)不合格的，脫毒瓶苗經(jīng)121℃、101kPa高壓滅菌20min～30min

后再?gòu)U棄；穴盤(pán)苗采用焚燒或填埋方式處理。

6有害生物檢測(cè)對(duì)象

6.1病毒

本文件檢測(cè)病毒包括甘蔗花葉病毒（sugarcanemosaicvirus，SCMV）、高粱花葉病毒（sorghum

mosaicvirus，SrMV）、甘蔗條紋花葉病毒（sugarcanestreakmosaicvirus，SCSMV）和甘蔗黃葉病

毒（sugarcaneyellowleafvirus，SCYLV）。

6.2細(xì)菌

本文件檢測(cè)細(xì)菌包括甘蔗宿根矮化病菌（Leifsoniaxylisubsp.Xyli，Lxx）和甘蔗白條病菌

（Xanthomonasalbilineans，Xa）。

6.3真菌

本文件診斷的真菌性病害包括由黑穗病菌（Sporisoriumscitamineum）引起的黑穗病和由梢腐病

菌（Fusariumspp.）引起的梢腐病。

4

DB35/T1993—2021

6.4昆蟲(chóng)

本文件鑒定的昆蟲(chóng)包括二點(diǎn)螟（ChiloinfuscatellusSnellen）、條螟（Chilosacchariphagus

Bojer）、黃螟（ArgyroploceschistaceanaSnellen）、紅尾白螟（TryporyzaintactaSnellen）、

大螟（SesamiainferensWalker）、臺(tái)灣稻螟（ChiloauriciliusDudgeno）等為害果蔗莖部的鉆蛀

性害蟲(chóng)。

7檢測(cè)方法

7.1形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

7.1.1瓶苗株高

用標(biāo)尺測(cè)量脫毒瓶苗根基位置至最新完整展開(kāi)葉肥厚帶處，結(jié)果以平均值表示，精確到0.1cm。

7.1.2瓶苗白色根長(zhǎng)

用標(biāo)尺測(cè)量脫毒瓶苗白色根的長(zhǎng)度，記錄大于或等于1.0cm長(zhǎng)的白色根條數(shù)。

7.1.3瓶苗完全展開(kāi)葉片數(shù)

目測(cè)并統(tǒng)計(jì)脫毒瓶苗植株完全展開(kāi)的葉片數(shù)。

7.1.4穴盤(pán)苗新出葉片數(shù)

目測(cè)并統(tǒng)計(jì)瓶苗移栽假植到穴盤(pán)期間新長(zhǎng)出的完全展開(kāi)綠葉數(shù)。

7.1.5穴盤(pán)苗假莖莖粗

用游標(biāo)卡尺測(cè)量植株假莖中部直徑，結(jié)果以平均值表示，精確到0.1cm。

7.1.6穴盤(pán)苗假莖株高

用標(biāo)尺測(cè)量植株根基位置至最新完整展開(kāi)葉肥厚帶處，結(jié)果以平均值表示，精確到0.1cm。

7.1.7穴盤(pán)苗白色根長(zhǎng)

用標(biāo)尺測(cè)量植株白色根的長(zhǎng)度，記錄大于或等于3.0cm長(zhǎng)的白色根條數(shù)。

7.1.8種莖品種純度

按照NY/T1488的規(guī)定，觀察果蔗莖形、節(jié)間形狀、根點(diǎn)排列、芽形狀、芽位、芽溝、葉鞘被（57

號(hào)）毛群、內(nèi)外葉耳形狀等品種植物學(xué)特征特性，依公式（1）計(jì)算品種純度。

VP=N1/N0×100%????????????????????（1）

式中：

VP——種莖品種純度，%；

N1——正確無(wú)誤的種莖數(shù)；

N0——種莖總數(shù)。

7.1.9種莖含水量

種莖切斷后劈成4份，于105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，依公式（2）計(jì)算含水量。

5

DB35/T1993—2021

W=(M0-M1)/M0×100%??????????????????（2）

式中：

W——種莖含水量，%；

M0——烘干前重量，單位為克（g）；

M1——烘干后重量，單位為克（g）。

7.1.10種莖發(fā)芽率

脫毒種莖通過(guò)沙培，在28℃～30℃條件下催芽，依公式（3）計(jì)算發(fā)芽率。

B=B1/B0×100%????????????????????（3）

式中：

B——種莖發(fā)芽率，%；

B1——萌芽數(shù)，單位為個(gè)；

B0——總芽數(shù)，單位為個(gè)。

7.1.11種莖莖徑

用游標(biāo)卡尺測(cè)量脫毒植株中部蔗莖節(jié)間的直徑，結(jié)果以平均值表示，精確到0.1cm。

7.1.12種莖夾雜物率

隨機(jī)采集以20～25根為一捆的脫毒種莖，稱(chēng)重后，依公式（4）計(jì)算夾雜物率。

T=W1/W0×100%?????????????????????（4）

式中：

T——種莖夾雜物率，%；

W1——夾雜物重量，單位為克（g）；

W0——種莖重量，單位為克（g）。

7.2病原物檢測(cè)

7.2.1檢測(cè)目標(biāo)病原種類(lèi)

本文件檢測(cè)的目標(biāo)病原包括甘蔗花葉病毒、高粱花葉病毒、甘蔗條紋花葉病毒、甘蔗黃葉病毒、甘

蔗宿根矮化病菌和甘蔗白條病菌，依公式（5）計(jì)算目標(biāo)病原檢出率。

P=P1/P0×100%????????????????????（5）

式中：

P——目標(biāo)病原檢出率，%；

P1——檢測(cè)出病毒或病菌的株數(shù)，單位為株；

P0——總檢測(cè)株數(shù)，單位為株。

7.2.2病原檢測(cè)方法

7.2.2.1核酸提取

樣品葉片總核糖核酸（RNA）、總脫氧核糖核酸（DNA）提取分別采用異硫氰酸胍/酚法（Trizol法）

和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammoniumbromide，簡(jiǎn)稱(chēng)CTAB）法。

6

DB35/T1993—2021

7.2.2.2RNA病毒互補(bǔ)脫氧核糖核酸鏈（cDNA）合成

cDNA合成反應(yīng)體系和程序參照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法或試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

7.2.2.3檢測(cè)引物

目標(biāo)病原的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)引物序列見(jiàn)表4。

表4果蔗脫毒種苗病原檢測(cè)引物序列

引物序列目的條帶大小

病原名稱(chēng)

5'→3'bp

SCMV-F4:GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC

SCMV900

SCMV-R3:AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC

SrMV-F:ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC

SrMV850

SrMV-R:CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC

SCSMV-CPF2:TCATMTCTTCATCRGCCGC

SCSMV572

SCSMV-CPR2:ATCTTCYCTACGCAGGTCCG

YLS111:TCTCACTTTCACGGTTGACG

SCYLV352

YLS462:GTCTCCATTCCCTTTGTACAGC

Lxx-F1:CCGAAGTGAGCAGATTGACCAATGAT

Lxx439

Lxx-R1:ACCCTGTGTTGTTTTCAACGCAGAG

XAF1:CCTGGTGATGACGCTGGGTT

Xa608

XAR1:CGATCAGCGATGCACGCAGT

注：M=A/C，R=A/G，W=T/A，Y=C/T。

7.2.2.4PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系參數(shù)見(jiàn)表5，反應(yīng)總體為25μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)見(jiàn)表6，實(shí)驗(yàn)操作參照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法

或試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。反應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，空白對(duì)照為用無(wú)菌水替代樣品模板進(jìn)

行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

表5果蔗脫毒種苗病原檢測(cè)PCR反應(yīng)體系

單位：微升（μL）

脫氧核糖核苷三磷

上游引物下游引物TaqDNA聚合酶

病原名稱(chēng)10×PCR緩沖液酸混合液（dNTPs）樣品模板無(wú)菌水

10μmol/L10μmol/L5U/μL

2.5mmol/L

SCMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SrMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SCSMV2.52.51.01.00.1251.016.875

SCYLV2.52.51.01.00.1251.016.875

Lxx2.52.01.01.00.2501.017.250

Xa2.52.51.01.00.1251.016.875

7

DB35/T1993—2021

表6果蔗脫毒種苗病原檢測(cè)PCR反應(yīng)程序

病原名稱(chēng)PCR反應(yīng)程序

SCMV94℃預(yù)熱2min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸10min

SrMV94℃預(yù)熱2min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸10min

SCSMV94℃預(yù)熱2min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸10min

SCYLV94℃預(yù)熱2min；94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸10min

Lxx94℃預(yù)熱3min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸10min

Xa94℃預(yù)熱1min；94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸30s，35次擴(kuò)增循環(huán)；再72℃延伸5min

7.3真菌性病害調(diào)查

根據(jù)典型病害癥狀對(duì)甘蔗黑穗病和甘蔗梢腐病進(jìn)行鑒定，依公式（6）計(jì)算病害發(fā)病株率。

D=D1/D0×100%?????????????????????（6）

式中：

D——病害發(fā)病株率，%；

D1——發(fā)生病害株數(shù)，單位為株；

D0——總調(diào)查株數(shù)，單位為株。

7.4螟害節(jié)率調(diào)查

在果蔗生長(zhǎng)中后期螟蟲(chóng)幼蟲(chóng)入侵蔗莖，造成螟害節(jié)，依公式（7）計(jì)算螟害節(jié)率。

S=S1/S0×100%?????????????????????（7）

式中：

S——螟害節(jié)率，%；

S1——種莖螟害節(jié)數(shù)，單位為節(jié)；

S0——種莖總節(jié)數(shù)，單位為節(jié)。

7.5遺傳變異率檢測(cè)

7.5.1檢測(cè)引物及檢測(cè)方法

按照NY/T3754中規(guī)定的檢測(cè)引物和檢測(cè)方法檢測(cè)果蔗脫毒種苗遺傳變異率。

7.5.2結(jié)果判定

通過(guò)擴(kuò)增條帶數(shù)量及其分子量大小計(jì)算等位基因頻率，若供檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品出現(xiàn)相同的指紋圖譜，

則判定為無(wú)遺傳變異；否則，判定為有遺傳變異。依公式（8）計(jì)算遺傳變異率。

G=G1/G0×100%????????????????????（8）

式中：

G—