醫(yī)院檢驗(yàn)科PCR室出科考試試題(附答案)一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，擴(kuò)增的目標(biāo)分子是（）A.蛋白質(zhì)B.脂類C.DNA/RNAD.多糖2.引物設(shè)計(jì)時(shí)，避免3’端互補(bǔ)的主要目的是（）A.提高擴(kuò)增效率B.防止引物二聚體形成C.增加特異性D.降低Tm值3.TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度是（）A.55℃B.72℃C.95℃D.60℃4.內(nèi)參基因（如GAPDH）在定量PCR中的主要作用是（）A.檢測擴(kuò)增效率B.校正樣本加樣量差異C.提高靈敏度D.區(qū)分DNA和RNA5.SYBRGreenI熒光染料法的主要缺點(diǎn)是（）A.成本高B.特異性較低C.只能檢測DNAD.需嚴(yán)格控溫6.PCR實(shí)驗(yàn)室中，防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染的關(guān)鍵措施是（）A.每日紫外線消毒B.分區(qū)操作并單向流動(dòng)C.使用一次性吸頭D.定期更換試劑盒7.擴(kuò)增曲線中“平臺(tái)期”形成的主要原因是（）A.引物耗盡B.模板濃度過高C.酶活性下降D.熒光信號(hào)飽和8.新冠病毒核酸檢測時(shí)，首選的樣本類型是（）A.血液B.糞便C.咽拭子/鼻拭子D.尿液9.定量PCR結(jié)果判讀中，“Ct值”的定義是（）A.熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.擴(kuò)增結(jié)束時(shí)的熒光強(qiáng)度C.引物退火的溫度D.模板初始濃度的對(duì)數(shù)10.PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)中，“擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)”屬于（）A.清潔區(qū)B.半污染區(qū)C.污染區(qū)D.緩沖區(qū)11.RNA提取時(shí)，加入β-巰基乙醇的主要目的是（）A.抑制RNA酶活性B.裂解細(xì)胞C.沉淀RNAD.去除蛋白質(zhì)12.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR結(jié)果出現(xiàn)“假陰性”（）A.擴(kuò)增產(chǎn)物污染B.樣本中存在PCR抑制劑C.引物濃度過高D.退火溫度過低13.熒光探針法（如TaqMan探針）的特異性主要取決于（）A.探針與目標(biāo)序列的互補(bǔ)性B.SYBRGreen的結(jié)合能力C.Taq酶的延伸效率D.模板的純度14.PCR反應(yīng)體系中，dNTP的主要作用是（）A.提供反應(yīng)緩沖環(huán)境B.作為合成DNA的原料C.激活Taq酶D.穩(wěn)定引物結(jié)構(gòu)15.實(shí)驗(yàn)室記錄中，PCR檢測原始數(shù)據(jù)應(yīng)保存至少（）A.1年B.2年C.3年D.5年二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分，多選、少選、錯(cuò)選均不得分）1.PCR反應(yīng)體系的基本組成包括（）A.模板DNA/RNAB.引物C.TaqDNA聚合酶D.dNTPsE.熒光染料或探針2.RNA提取過程中需嚴(yán)格避免RNA酶污染，措施包括（）A.使用DEPC處理的耗材B.實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭臺(tái)面C.操作者佩戴無粉手套并頻繁更換D.所有試劑分裝保存，避免反復(fù)凍融E.在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行提取3.PCR實(shí)驗(yàn)室常見的污染來源包括（）A.擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染B.樣本間交叉污染C.試劑污染（如引物或dNTP污染）D.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的外源DNA污染E.操作人員的汗液或唾液4.定量PCR質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括（）A.樣本采集與運(yùn)輸?shù)囊?guī)范性B.核酸提取的效率與純度C.反應(yīng)體系配制的準(zhǔn)確性D.擴(kuò)增程序設(shè)置的合理性E.結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)化5.PCR檢測報(bào)告需包含的信息有（）A.患者姓名、性別、年齡B.樣本類型及采集時(shí)間C.檢測項(xiàng)目及方法學(xué)D.結(jié)果描述（如“陽性”“陰性”或Ct值）E.報(bào)告人員及審核人員簽名三、判斷題（每題2分，共20分，正確填“√”，錯(cuò)誤填“×”）1.熱啟動(dòng)Taq酶通過化學(xué)修飾或抗體封閉，可減少非特異性擴(kuò)增（）2.熒光探針法的特異性高于SYBRGreen染料法（）3.陰性對(duì)照（無模板）出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明存在污染（）4.核酸提取時(shí)，離心速度和時(shí)間不影響提取效率（）5.新冠病毒核酸檢測中，單靶標(biāo)陽性即可判定為陽性（）6.PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)可共用冰箱和離心機(jī)（）7.擴(kuò)增后產(chǎn)物管應(yīng)在擴(kuò)增區(qū)開蓋處理（）8.樣本保存超過48小時(shí)（4℃），需凍存于-20℃以下（）9.Ct值越小，提示樣本中目標(biāo)核酸濃度越低（）10.實(shí)驗(yàn)室需定期進(jìn)行室間質(zhì)評(píng)（EQA）和室內(nèi)質(zhì)控（IQC）（）四、簡答題（每題5分，共20分）1.簡述PCR技術(shù)的基本原理及三步循環(huán)的具體溫度和作用。2.列舉PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)及各區(qū)域的主要功能。3.定量PCR擴(kuò)增曲線分為哪幾個(gè)階段？各階段的意義是什么？4.簡述PCR實(shí)驗(yàn)室污染的預(yù)防措施（至少5項(xiàng)）。五、案例分析題（共15分）某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新冠病毒核酸檢測時(shí)，出現(xiàn)以下情況：-陽性對(duì)照Ct值正常（25±2），陰性對(duì)照無擴(kuò)增；-部分患者樣本Ct值為38-40（實(shí)驗(yàn)室設(shè)定陽性閾值為Ct≤37）；-同一患者重復(fù)檢測時(shí)，Ct值波動(dòng)在35-40之間。問題：1.分析上述結(jié)果可能的原因（6分）。2.提出針對(duì)性的解決措施（9分）。答案一、單項(xiàng)選擇題1.C2.B3.B4.B5.B6.B7.A8.C9.A10.C11.A12.B13.A14.B15.B二、多項(xiàng)選擇題1.ABCDE2.ABCD3.ABCDE4.ABCDE5.ABCDE三、判斷題1.√2.√3.√4.×5.×6.×7.×8.√9.×10.√四、簡答題1.PCR原理：通過溫度循環(huán)（變性、退火、延伸），利用DNA聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。三步循環(huán)：-變性（94-95℃）：雙鏈DNA解鏈為單鏈；-退火（55-65℃）：引物與單鏈模板特異性結(jié)合；-延伸（72℃）：Taq酶以dNTP為原料，合成互補(bǔ)DNA鏈。2.分區(qū)及功能：-試劑準(zhǔn)備區(qū)：配制反應(yīng)體系（需超凈工作臺(tái)，避免外源DNA污染）；-樣本處理區(qū)：核酸提?。ㄐ枭锇踩?，防樣本間交叉污染）；-擴(kuò)增區(qū)：PCR擴(kuò)增（放置PCR儀，避免擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散）；-產(chǎn)物分析區(qū)：結(jié)果判讀（如電泳或熒光檢測，嚴(yán)格禁止產(chǎn)物回流入前區(qū)）。3.擴(kuò)增曲線階段及意義：-基線期：前15個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)未超過背景值（反映儀器噪聲）；-指數(shù)增長期：熒光信號(hào)呈指數(shù)上升（Ct值在此階段確定，與初始模板量成反比）；-平臺(tái)期：熒光信號(hào)增長停滯（因引物/dNTP耗盡或酶活性下降，不可用于定量）。4.污染預(yù)防措施：-嚴(yán)格分區(qū)，單向流動(dòng)（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)）；-使用帶濾芯吸頭，避免氣溶膠污染；-每日實(shí)驗(yàn)前后用紫外線（30分鐘）+75%酒精消毒各區(qū)；-定期更換實(shí)驗(yàn)服、手套，操作時(shí)避免說話或走動(dòng)；-設(shè)立陰/陽性對(duì)照，監(jiān)控污染；-擴(kuò)增后產(chǎn)物密封處理，按醫(yī)療廢物高壓滅菌后丟棄。五、案例分析題1.可能原因：-樣本中病毒載量低（接近檢測下限），導(dǎo)致Ct值波動(dòng)；-核酸提取效率不穩(wěn)定（如操作誤差或試劑批次差異）；-擴(kuò)增體系配制時(shí)加樣誤差（如樣本量不足或移液槍校準(zhǔn)不準(zhǔn)）；-擴(kuò)增程序設(shè)置不當(dāng)（如退火溫度偏高，影響擴(kuò)增效率）；-樣本保存或運(yùn)輸不當(dāng)（如超時(shí)未凍存，病毒核酸降解）。2.解決措施：-優(yōu)化樣本處理：使用高靈敏度提取試劑，延長洗脫時(shí)間或增加洗脫體積以提高濃度；-規(guī)范操作：校準(zhǔn)移液槍，采用帶濾芯吸頭，嚴(yán)格按SOP進(jìn)行加樣（避免氣泡或掛壁）；-調(diào)整擴(kuò)增條件：驗(yàn)證退火溫度（可降低1-2℃提高擴(kuò)增效率），延長延伸時(shí)間（如從30秒增至45