ICS11.020

CCSC04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CPMA031—2023

病原微生物菌（毒）種分離和鑒定方法

鼻病毒

Isolationandidentificationofpathogenicmicroorganisms—Humanrhinoviruses

2023-10–XX發(fā)布2023-10-XX實(shí)施

中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布

T/CPMA031—2023

病原微生物菌（毒）種分離和鑒定方法鼻病毒

1范圍

本文件規(guī)定了鼻病毒分離和鑒定的方法。

本文件適用于全國(guó)各級(jí)病原微生物菌（毒）種保藏機(jī)構(gòu)，以及涉及人間傳染的鼻病毒研究、教學(xué)、

檢測(cè)、診斷等相關(guān)活動(dòng)的機(jī)構(gòu)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

鼻病毒humanrhinovirus

與腸道病毒有相似的基因組結(jié)構(gòu)，衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4組成的小RNA病毒科腸道

病毒屬的病毒。

注：是引起普通感冒的重要病原體，與其它腸道病毒不同的是，鼻病毒不耐酸，pH值低于5~6時(shí)病毒活性不穩(wěn)定。

可在人宮頸癌細(xì)胞、人胚肺及二倍體細(xì)胞系或人胚氣管器官培養(yǎng)中增殖。鼻病毒病原學(xué)見(jiàn)附錄A。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

CPE：細(xì)胞病變效應(yīng)(CytopathicEffect)

Ct：循環(huán)閾值(CycleThreshold)

DMEM：改良的eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)

FBS：胎牛血清(FetalBovineSerum)

HRV：鼻病毒（HumanRhinovirus）

NCR：非編碼區(qū)(NoncodingRegion)

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)

PS：青鏈霉素混合液100×(Penicillin-StreptomycinSolution)

Q-PCR：熒光定量PCR(QuantitativeFluorescencePCR)

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscriptionPCR)

TCID50：半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50%組織細(xì)胞感染量)(Fifty-percentTissueCultureInfectiveDose)

VP：病毒蛋白基因(VirusProteinGene)

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5分離技術(shù)要求

5.1臨床樣本類型

臨床樣本為呼吸道感染者的鼻咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、氣管分泌物、深度誘導(dǎo)痰等。

5.2臨床樣本的存儲(chǔ)和運(yùn)輸

5.2.1呼吸道樣本應(yīng)在收集后盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

5.2.2可以在24h送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的樣本可以在4℃存儲(chǔ)和運(yùn)輸。

5.2.324h無(wú)法送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的樣本，應(yīng)于-20℃或-80℃凍存并用干冰運(yùn)輸。

5.3臨床樣本前處理

5.3.1咽拭子

在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)裝有鼻咽拭子離心管的管蓋，用無(wú)菌巴氏吸管吹吸棉拭子數(shù)次并擠出棉拭子上

的液體。將裝有樣本的離心管置于離心機(jī)，于4℃，12000rpm離心10min。

5.3.2痰液

5.3.2.1若痰液中含有少量黏液，按照咽拭子樣本的處理方法離心后接種細(xì)胞。

5.3.2.2若痰液中含有大量黏液，按照1:1體積比加入痰消化液，混勻后置37℃液化15min，取適量樣

本按照咽拭子樣本的處理方法離心后接種細(xì)胞。

5.3.3其他呼吸道樣本

如支氣管肺泡灌洗液、氣管分泌物等的處理原則按照痰液進(jìn)行。

5.4陽(yáng)性樣本篩查

按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本核酸，應(yīng)利用鼻病毒通用引物和探針進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。

5.5PCR內(nèi)部質(zhì)控

核酸提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程中應(yīng)有質(zhì)控，每個(gè)檢測(cè)體系應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

5.6敏感細(xì)胞

A種和B種鼻病毒敏感細(xì)胞為H1-HeLa、HeLa、WI-38、MRC-5、Wis.L，常用H1-HeLa進(jìn)行病毒

分離和培養(yǎng)。C種鼻病毒可以用鼻竇黏膜組織進(jìn)行分離，也可以用轉(zhuǎn)染了其受體CDHR3的HeLa進(jìn)行

培養(yǎng)。

5.7病毒培養(yǎng)條件

病毒培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)保持溫度33℃~35℃，CO2濃度5%±0.1%。

5.8病毒分離

臨床樣本接種細(xì)胞，病毒分離成功時(shí)可見(jiàn)培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓、脫落

等。無(wú)明顯CPE時(shí)可將培養(yǎng)細(xì)胞凍融2次后盲傳3代，觀察CPE。

5.9病毒純化

分離成功的鼻病毒應(yīng)進(jìn)行空斑純化。

5.10病毒滴度測(cè)定

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應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)稀釋法測(cè)定鼻病毒滴度TCID50。

5.11病毒分裝

病毒液應(yīng)分裝于螺口凍存管中，并記錄病毒名稱、代次、敏感細(xì)胞、病毒滴度、分裝體積、凍存日

期、操作者等信息。

6鑒定技術(shù)要求

6.1基因型鑒定

6.1.1應(yīng)對(duì)鼻病毒基因VP2/4和/或VP1進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。

6.1.2對(duì)測(cè)得的病毒基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，判斷病毒的種和基因型。

6.2形態(tài)學(xué)鑒定（推薦）

對(duì)分離的鼻病毒進(jìn)行負(fù)染或制備超薄切片，利用電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。負(fù)染后，電鏡下可見(jiàn)

鼻病毒具備小RNA病毒的形態(tài)學(xué)特征，無(wú)包膜、呈球形、直徑約為30nm，偶可見(jiàn)空心病毒顆粒。超

薄切片電鏡下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)高電子密度球形病毒顆粒，直徑約30nm，有時(shí)病毒可聚集形成結(jié)晶狀病毒

包涵體。

7分離和鑒定程序

鼻病毒分離和鑒定程序流程見(jiàn)圖1。

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圖1鼻病毒分離和鑒定流程

8分離和鑒定流程

8.1陽(yáng)性樣本篩查

8.1.1通用引物和探針序列

通用引物和探針序列信息見(jiàn)表1。

表1通用引物和探針序列信息

引物或探針名稱5’~3’序列擴(kuò)增區(qū)域

引物RV_5NCR_FCYAGCCTGCGTGGCNCR

引物RV_5NCR_RGAAACACGGACACCCAAAGTA

探針RV_5NCRTCCTCCGGCCCCTGAATGYGGC

8.1.2病毒RNA提取

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本RNA。

8.1.3反應(yīng)體系

應(yīng)根據(jù)商品化一步法Q-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

示例：無(wú)RNA酶的水7.5μL，2×RT-PCR緩沖液12.5μL，引物-探針混合物（10μmol/L）2μL，25×RT-PCR酶混

合物1μL，病毒RNA2μL，共25μL。

8.1.4擴(kuò)增條件

應(yīng)根據(jù)商品化一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

示例：50℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，15~30sec，至少40個(gè)循環(huán)。

8.1.5結(jié)果判定

8.1.5.1陰性，無(wú)擴(kuò)增曲線，或Ct≥40。

8.1.5.2陽(yáng)性，Ct<35且具典型的“S”型擴(kuò)增曲線。

8.1.5.3可疑陽(yáng)性，具有典型“S”型擴(kuò)增曲線，但Ct在35~40之間，需重復(fù)試驗(yàn)確證。若重復(fù)試驗(yàn)

Ct值<35，具有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

8.2病毒分離

8.2.1病毒接種

8.2.1.1樣本接種前一天將細(xì)胞傳至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日細(xì)胞應(yīng)至60%~70%豐度。

8.2.1.2將呼吸道樣本于4℃、12000g離心20min，吸出100μL樣本，加于200μL孵育液中混合待

用。

8.2.1.3用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩遍，將上述300μL樣本接種于細(xì)胞上，完全覆蓋細(xì)

胞，置于33℃~35℃、5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱吸附1h。

8.2.1.4吸棄病毒液，加入500μL病毒維持液，置33℃~35℃、5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。設(shè)置正

常細(xì)胞作為對(duì)照。

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8.2.2CPE觀察

按上述方法將樣本接種細(xì)胞后，每24h在倒置顯微鏡下觀察CPE，以0%～25%細(xì)胞CPE變化為

“+”，26%～50%細(xì)胞CPE變化為“++”，51%～75%細(xì)胞CPE變化為“+++”，76%～100%細(xì)胞CPE

變化為“++++”。正常細(xì)胞形態(tài)為“-”。

8.2.3培養(yǎng)物收集

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于-80℃冰箱和37℃水浴凍融兩次，將細(xì)胞培養(yǎng)上清于4℃、

2000g離心10min，離心后的上清液分裝于凍存管中，并記錄病毒名稱、代次、細(xì)胞、日期、操作人

等信息。

8.2.4空斑純化

8.2.4.1細(xì)胞傳代

細(xì)胞以1×104cell/500μL/孔傳代至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

8.2.4.2病毒稀釋

次日，用病毒孵育液將病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，10-1～10-8共八個(gè)稀釋度。

8.2.4.3細(xì)胞洗滌

棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩遍。

8.2.4.4病毒孵育

取200μl系列稀釋的病毒接種到細(xì)胞上，置33℃~35℃、5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱孵育1h。

8.2.4.5細(xì)胞洗滌

棄病毒孵育液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩遍。

8.2.4.6病毒培養(yǎng)

將1%的甲基纖維素（2%甲基纖維素:2×DMEM=1:1）加到24孔板中，每孔1ml，置33℃~35℃、

5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)72小時(shí)。

8.2.4.7挑取空斑

選取合適大小的空斑下進(jìn)行病毒的下一輪增殖和純化

8.2.5病毒滴度測(cè)定

8.2.5.1細(xì)胞傳代

細(xì)胞以1×104cell/100ul/孔傳代至96孔板，次日細(xì)胞應(yīng)至70%～80%豐度。

8.2.5.2病毒稀釋

次日，用病毒孵育液將經(jīng)過(guò)空斑純化的病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋，10-1～10-8共八個(gè)稀釋度，每個(gè)稀

釋度8個(gè)復(fù)孔。

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8.2.5.3細(xì)胞洗滌

棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩遍。

8.2.5.4病毒孵育

將系列稀釋的病毒接種到細(xì)胞上，置33℃~35℃、5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱孵育1h，留一排細(xì)胞不加

病毒作為陰性對(duì)照。

8.2.5.5細(xì)胞洗滌

棄病毒孵育液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩遍。

8.2.5.6病毒培養(yǎng)

每孔加入100μl病毒維持液，置33℃~35℃、5%±0.1%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d~7d。

8.2.5.7CPE觀察

倒置顯微鏡下觀察CPE，計(jì)數(shù)病變孔與非病變孔，計(jì)算TCID50。以觀察該孔是否出現(xiàn)CPE確定該

孔是否為陽(yáng)性孔，假如某個(gè)梯度8個(gè)孔中共有6個(gè)陽(yáng)性孔，則將該梯度的結(jié)果記為6/8，依次類推。

8.2.5.8計(jì)算病毒TCID50

用Reed-Muench公式計(jì)算病毒滴度。

Reed-Muench計(jì)算公式TCID50＝高于50%死亡率的病毒稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比值×稀釋倍數(shù)的對(duì)

數(shù)。距離比值=（高于50%的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)）。

8.3病毒鑒定

8.3.1RT-PCR方法

8.3.1.1分型引物信息

分型引物信息見(jiàn)表2。

表2分型引物信息

引物名稱5’~3’引物序列擴(kuò)增區(qū)域長(zhǎng)度

HRV-A/BFGGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGTVP4/VP2550bp

HRV-A/BRGCATCIGGYARYTTCCACCACCANCC

HRV-CFACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCVP4/VP2330bp

HRV-CRTTTCCRATAGTGATTTGCTTKAGCC

8.3.1.2反應(yīng)體系

利用商品化一步法試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將細(xì)胞培養(yǎng)上清提取病毒RNA，配置如下反應(yīng)體系：

無(wú)RNA酶的水8.5μL，2×一步法混合物12.5μL，基因特異性正向引物（10μM）1μL，基因特異

性反向引物（10μM）1μL，病毒RNA2μL。

8.3.1.3擴(kuò)增條件

逆轉(zhuǎn)錄步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：94℃~98℃，3min（根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)調(diào)整）；94℃~98℃，

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30sec，55℃，30sec，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃,5min。

8.3.1.4結(jié)果判定

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小初步判斷是否為鼻病毒。PCR產(chǎn)物利用分

型引物進(jìn)行雙向序列測(cè)定，并進(jìn)行序列拼接，通過(guò)序列比對(duì)判斷鼻病毒的種和基因型。

8.3.2電鏡鑒定方法

8.3.2.1負(fù)染檢測(cè)

病毒培養(yǎng)上清或細(xì)胞凍融后，于2000g離心10min。將30μL上清滴在封口膜上，將載網(wǎng)有膜面

接觸樣本，漂浮在樣本上5min~10min，夾起載網(wǎng)，吸除多余樣本，以同樣方式將載網(wǎng)漂浮在1%磷鎢

酸（pH6.8）上1min，夾起載網(wǎng)，吸除多余染液，置室溫干燥后用透射電子顯微鏡檢測(cè)?？梢?jiàn)鼻病毒具

備小RNA病毒的形態(tài)學(xué)特征，無(wú)包膜、呈球形、直徑約為30nm，偶可見(jiàn)空心病毒顆粒。

8.3.2.2超薄切片檢測(cè)

8.3.2.2.1固定

用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，于1000g離心15min，吸棄上清，細(xì)胞沉淀加入2.5%戊二醛（pH7.4）于4℃

固定2h，以0.1M二甲砷酸鈉（pH7.4）洗滌10min×3次。以1%四氧化鋨于4℃固定2h，以雙蒸水

洗滌10min×3次。

8.3.2.2.2脫水與浸透

分別以50%~70%~90%~100%~100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次10min。分別以樹(shù)脂:無(wú)水乙醇比例

1:1和3:1各浸透樣本1次，再用純樹(shù)脂浸透樣本2次，每次2h。

8.3.2.2.3包埋與聚合

將樣本轉(zhuǎn)移至包埋管，放入聚合儀內(nèi)，按照樹(shù)脂使用說(shuō)明書(shū)設(shè)定溫度進(jìn)行聚合。

8.3.2.2.4修塊

聚合后的樹(shù)脂塊用刀片進(jìn)行修塊，暴露出細(xì)胞并將表面修整為等腰梯形。

8.3.2.2.5切片

用超薄切片機(jī)對(duì)樹(shù)脂塊進(jìn)行超薄切片，切片厚度為50nm~100nm，以銅網(wǎng)撈取切片，置室溫晾干。

8.3.2.2.6染色

分別以1%醋酸雙氧鈾和0.2%枸櫞酸鉛染液進(jìn)行染色，時(shí)間分別為10min和5min，每次染色后以

雙蒸水洗滌銅網(wǎng)10min×3次。

8.3.2.2.7觀察和結(jié)果判定

晾干載網(wǎng)，用透射電子顯微鏡觀察。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)高電子密度球形病毒顆粒，直徑約30nm，有時(shí)

病毒可聚集形成結(jié)晶狀病毒包涵體。

9質(zhì)量控制和生物安全要求

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T/CPMA031—2023

9.1應(yīng)制定病毒分離和鑒定等關(guān)鍵技術(shù)方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，技術(shù)方法應(yīng)經(jīng)過(guò)至少兩家獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室確

認(rèn)和驗(yàn)證。

9.2細(xì)胞傳代應(yīng)保持在10代以內(nèi)。

9.3病毒應(yīng)是純培養(yǎng)物，無(wú)外源因子污染。

9.4病毒的分離、培養(yǎng)、傳代、滴度測(cè)定和鑒定等試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)記錄并可溯源。

9.5病毒分離、培養(yǎng)、滴度測(cè)定等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，所有操作應(yīng)符合GB19489。

9.6廢棄樣本應(yīng)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，并做好銷毀記錄。

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T/CPMA031—2023

AA

附錄A

（資料性）

鼻病毒病原學(xué)

鼻病毒（humanrhinovirus）是人類呼吸道感染最常見(jiàn)的病毒之一，于1956年發(fā)現(xiàn)，rhinovirus來(lái)自

希臘語(yǔ)鼻“rhinos”和拉丁語(yǔ)virus。鼻病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，有三個(gè)種（species，A，B和

C）包括169個(gè)血清/基因型。

鼻病毒呈球形，為二十面立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜，直徑約30nm。病毒基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)

度約為7079~7233nt（不包括PolyA尾），基因組編碼單個(gè)開(kāi)放閱讀框（Openreadingframe，ORF），翻

譯產(chǎn)生多聚蛋白（Polyprotein,P），包括P1、P2和P3。鼻病毒包括4種結(jié)構(gòu)蛋白-VP1、VP2、VP3和VP4，

VP1、VP2和VP3位于病毒衣殼表面，VP4蛋白位于衣殼內(nèi)部。

鼻病毒浮力密度為1.40g/mL。鼻病毒沒(méi)有脂質(zhì)包膜，有機(jī)溶劑如75%乙醇、0.1%鄰苯酚、乙醚、2%

戊二醛、1%碘和家用漂白劑均可殺滅病毒。病毒在56℃水浴加熱16分鐘后失活，其活性在pH低于6時(shí)

不穩(wěn)定。病毒在不銹鋼、漆木、尼龍、醋酸酯、奧綸、滌綸、羊毛和絲綢上存活3h，在棉質(zhì)、人造絲、

面巾紙和紙巾上存活1h，在鼻粘膜中存活24h。干燥對(duì)病毒存活率無(wú)明顯影響。

氣溶膠和飛沫通過(guò)空氣傳播是鼻病毒傳播的主要途徑，可經(jīng)口鼻進(jìn)入人體。也可通過(guò)直接和間接接

觸傳播，最常見(jiàn)的是“手-鼻-手”途徑。潛伏期一般為48h~72h。鼻病毒是普通感冒的主要病因，也是

哮喘和慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)惡化的病因。病毒在33℃~35℃

時(shí)復(fù)制最優(yōu)，因此感染常見(jiàn)于上呼吸道，引起持續(xù)性支氣管痙攣性咳嗽，也可導(dǎo)致繼發(fā)性細(xì)菌感染，如

鼻竇炎和中耳炎。鼻病毒也可以在37℃復(fù)制，因此也是引起幼兒和有免疫缺陷成人下呼吸道感染，引

起肺炎、毛細(xì)支氣管炎、支氣管炎和支氣管肺炎。鼻病毒感染還與慢性阻塞性肺疾病、哮喘和囊性纖維

化的急性加重和住院時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。在社區(qū)獲得性肺炎中，鼻病毒感染與呼吸衰竭顯著相關(guān)。

根據(jù)原衛(wèi)生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)〔2006〕15號(hào)），鼻病毒危害程度

屬于第三類，未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作、病毒分離、培養(yǎng)和滴度測(cè)定等操作在生物安全二級(jí)（BSL-2）

實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，采用B類（UN3373）包裝運(yùn)輸。滅活材料和無(wú)感染性材料的操作在生物安全一級(jí)（BSL-1）

實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

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附錄B

（規(guī)范性）

設(shè)備和材料

B.1生物安全柜：II級(jí)；

B.2冰箱：4℃、-20℃、-80℃；

B.3低溫高速離心機(jī)；

B.4熒光定量PCR儀；

B.5普通PCR儀；

B.6CO2培養(yǎng)箱；

B.7水浴鍋；

B.8倒置顯微鏡；

B.9水平電泳儀：包括電源、電泳槽、膠槽和梳子；

B.10凝膠成像系統(tǒng)；

B.11聚合儀；

B.12超薄切片機(jī)；

B.13透射電子顯微鏡；

B.14微量移液器：量程10μL、200μL和1000μL；

B.15八道移液器：量程300μL；

B.16電動(dòng)移液器：量程10mL；

B.17無(wú)菌刻度移液管：10mL；

B.18無(wú)菌離心管：1.5mL、15mL和50mL；

B.19無(wú)菌吸頭：10μL、200μL和1000μL；

B.20PCR管：0.2mL；

B.21細(xì)胞培養(yǎng)板：96孔，24孔；

B.22細(xì)胞培養(yǎng)瓶：T25、T75；

B.23細(xì)胞凍存管：1.8mL；

B.24封口膜；

B.25覆膜銅網(wǎng)；

B.26包埋管。

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T/CPMA031—2023

附錄C

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基和試劑

C.1通用引物序列信息：參見(jiàn)表1。

C.2探針序列信息：參見(jiàn)表1。

C.3分型PCR引物信息：參見(jiàn)表2。

C.45×TBE電泳緩沖液：Tris堿54g+硼酸27.5g+Na2EDTA·2H2O3.72g，加去離子水定容

至1L。瓊脂糖凝膠電泳時(shí)使用濃度為0.5×。

C.550×TAE電泳緩沖液：Tris堿242g+Na2EDTA·2H2O37.2g+離子水600mL+57.1m