第55課時基因工程的基本工具和基本操

作程序

課程標(biāo)準(zhǔn)解讀

i.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微牛.物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而

來的。2.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基

本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的

構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。4.活動：DNA的粗提取

與鑒定。5.活動：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定或運用軟件進(jìn)行

虛擬PCR實驗。

考點一重組DNA技術(shù)的基本工具

必備知識梳理?夯基礎(chǔ)

1.基因工程的概念

概念

操作

分子水平一

水平-原理一基因重組

創(chuàng)造出更符按照人們的愿

合人們需要段卜望，通過轉(zhuǎn)基因

的新的生物T目的卜

等技術(shù)，賦予生

美型和生物物新的遺傳特性

產(chǎn)品

操作克服遠(yuǎn)緣雜交不

生物體外一

環(huán)境優(yōu)點/翻的障礙，鮑

17

改造生物的遺傳

與雜交育種相比性狀

與誘變有種相比

2.基因工程的基本工具

(1)限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)

再要來叫原核生物

種類?分離的限制醐有數(shù)千種

作用識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序列,

限一~~"使每一?條鏈中特定部位的磷酸二酶鍵斷開

制

酷「切割位置:識別序列的中心軸線兩側(cè)

￡coRI

黏性5-GAATTC-3,GAATTC

(在G與

A之間3-CTTAAG-5'CTTAAG

切割)中軸線’

結(jié)果

切割位置:識別序列的中心軸線處

SmaI

平一

I(在G與5—CCCGGG-3'CCCGGG

末端

C之間

3-GGGCCC-5'GGGCCC

切割)

中軸線

I提醒

①限制晦的識別序列一般由6個核甘酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核甘酸組

成。

②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。

③在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末

端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。

(2)DNA連接酶

些也將雙鏈DNA片段“縫伊起來，恢復(fù)被限制

一酶切開的磷酸二酯鍵

DNA

來源大腸桿菌

連E.coliDNA

接連接再功能“縫合”互補的黏性末端

酣和平末端，但''縫合”平木

端的效率低

類型來源T4噬菌體

T4DNA

功能“縫合”互補的黏性末端

連接前

和平末端

4提醒

①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合萌是把單個的脫氧核管酸連接到

已有的DNA片段上。

②DNA聚合酹起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。

(3)載體

種類「質(zhì)粒(常用載體):壞狀雙捱DNA分子

唾苞住、動植物病毒等

有一個至多個限制解切割位點

「攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)

我持占

7一衛(wèi)也一胞后，能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整

IT-------------

合到受體DNA上,隨受體DNA同步復(fù)制

常有特殊的皿基因，便于重組DNA

分子的篩選

作用攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞

|辨析與表達(dá).

(1)通過基因工程技術(shù)能夠定向改造生物的遺傳性狀，(V)

(2)￡co〃DNA連接酶只能連接黏性末端。(X)

(3)DNA連接酶具有特異性，只能連接同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割形成的黏性末端。

(X)

(4)若兩種限制酶的識別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接晦相互連接。

(X)

(5)限制性內(nèi)切核酸酶識別序列越短，則該序列在DMA中出現(xiàn)的概率就越大。(7)

(6)載體質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，以便于重組D、A分子的篩選。(J)

(7)載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標(biāo)記基因。(X)

(8)(選擇性必修3P72正文)天然的DNA分子不能直接用作基因工程載體的原因有哪

些？

提示：天然的DNA分子一般不完全具備作為載體的全部條件，需要進(jìn)行人工改造后才

能用于基因工程操作。

核心素養(yǎng)達(dá)成/?破考向

考向圍繞重組DNA技術(shù)的基本工具考查科學(xué)，思維))

1.(2025?福建廈門模擬)BamH1、MboI、SmaI三種限制酶的識別序列和切割位

點依次為5"-GIGATCC-3\5，一\GATC-3\S'-CCCIGGG-31如圖表示某DNA片

段的部分堿基序列，已知其余序列不含這三種限制酸的識別序列。下列敘述正確的是

(C)

5,-------------------------------------------------------------------3，

GGATCCCCCGGGCCCGGGGGATCC

,：

1,?a

,CCTAGGGiGGCCCGGGCCCCCTAGG

3,-------------------------------------------------------------------5，

卜634bp0|-?896bp---------卜758bp

A.若用SmaI完全力割該DNA,則其產(chǎn)物的長度為634bp、896bp、75Xbp

B.若虛線方框內(nèi)的堿基對被T—A替換，則用S加H完全切割該DNA可產(chǎn)生3種片

段

C.若用Mb。1和&mHI切割該DNA,可形成相同的黏性末端

D.用SmaI切割該DNA產(chǎn)生的片段，用E.coliDNA連接酶重新將其連接效率較高

解析：SmaI的識別序列為5f-CCCIGGG-3\則用Sma\完全切割該DNA會產(chǎn)生三

個片段，即637bp、890bp.761bp,A錯誤；若虛線方框內(nèi)的堿基對被T—A替換，則用

SmaI完全切割該DNA可產(chǎn)生2種片段，B錯誤；BamHIMboI識別的序列分別為

5，-GIGATCC-3，、5r-IGATC-3r,則二者切割該DNA,可形成相同的黏性末端，C正確：

用S〃心I切割該DNA產(chǎn)生的片段為平末端，用￡co〃DNA連接酶連接效率低，D錯誤。

2.(2024?江西卷)y-級基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L-谷氨酸脫竣酶

(GadB)催化L-谷氨酸脫竣是高效生產(chǎn)上氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將

釀酒酵母S的L-谷氨酸脫竣酶基因?qū)肷a(chǎn)菌株E.c?！?gòu)建了以L-谷朝酸鈉為底物

高效生產(chǎn)丫?氨基丁酸的菌株下列敘述正確的是(D)

NeoI和即“I___

o

質(zhì)粒

E.cohA

(含多克隆位點)

NcoI和Kp〃I

重組灰粒

PC..雙再叫

釀?酒酵母SE.coliB

A.上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到大量目的基因gad8

B.￡c。〃〃發(fā)酵生產(chǎn)y-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能

C.E.coliA和￡.co〃B都能高效降解y-氨基丁酸

D.可以用其他酶替代Na【和以〃I構(gòu)建重組質(zhì)粒

解析：從釀酒酵母S中分離得到含有目的基因取油序列的染色體DNA,如題圖所示，

若要獲取大量目的基因，需要進(jìn)行PCR和酶切，A錯誤；題意顯示，用L-谷氨酸脫蹂晦(GadB)

催化L-谷氨酸脫廢是高效生產(chǎn)r氨基丁酸的重要途徑之一，￡co〃8中能表達(dá)L-谷氨酸脫期

酶(GadB),因此可用發(fā)酵生產(chǎn)y-氨基丁酸，該過程中L-谷氨酸鈉的作用不是供能，

B錯誤；E.coliA中沒有L-谷氮酸脫較酶(GadB),因而K能使L-谷氨酸鈉脫疑，而E.coliB

中含有該酶的基因，因而能使L-谷氨酸鈉脫瘦，高效生產(chǎn)y-氨基丁酸，C錯誤；除了Nc。1

和Kp〃I外，還有其他的限制酶可選，此外，構(gòu)建重組質(zhì)粒也未必非要用這兩種酶，而是

可以用同足晦替代，D正癰。

/歸納總結(jié)

與DNA有關(guān)的酶的比較

名稱作用部位作用底物作用結(jié)果

將DNA切成兩個或多個片

限制酶磷酸二酯鍵DNA

段

將兩個DNA片段連接為一

DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段

個DNA分子

以DNA單鏈為模板，將單

DNA聚合酶或熱穩(wěn)定

磷酸二酯鍵脫氧核昔酸個脫氧核甘酸依次連接到

DNA聚合酶

DNA單鏈末端

將DNA片段水解為單個脫

DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA

第,核甘酸

將雙鏈DNA分子局部解旋

解旋晦堿基對之間的氫鍵DNA

為單鏈，形成兩條長鏈

核糖核將單個核糖核昔酸依次連

RNA聚合梅磷酸二酯鍵

甘酸接到RNA單鏈末端

考點二基因工程的基本操作程序

必備知識梳理?夯基礎(chǔ)

1.目的基因的篩選與獲取

(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)

物等的基因。

(2)篩選合適的目的基因

①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。

②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進(jìn)行篩選。

(3)目的基因的獲取

①人工合成目的基因，

②常用POt特異性地快速擴(kuò)增目的基因。

#提醒I

①在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、(1CTP),既可作為合

成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

②引物是一小段單錐的DNA或RNA,作為新子鏈的合成起點，只能結(jié)合在母鏈的3,

端，使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始連接脫氧核苗酸。

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心

(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代，同時使目的基因能

夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

(2)基因表達(dá)載體的組成及作用

/目的基因:編碼蛋白質(zhì)的基因或具有調(diào)

控作用的因子

竹嬴啟動子:RNA聚合施識別和結(jié)合的部位

W表達(dá)載體以轉(zhuǎn)錄的終點,在轉(zhuǎn)錄過程中

復(fù)制八起調(diào)控作用

原點近逞里:鑒別受體細(xì)胞中是否含有

目的基因

?提醒

啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比

起始終止

項目啟動子終止子

密碼子密碼子

本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶識別

翻譯的結(jié)束信號

和結(jié)合的部位，使轉(zhuǎn)錄在所需要辨譯的起始信號

功能(正常情況下，

驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出的地方停下來(編碼氨基酸)

不編碼氨基酸)

mRNA

(3)構(gòu)建過程

我體（質(zhì)粒）

外源DNA

同種限制前切割

I------------L,5ZZ1

DNA連接的少兩個切口，獲得

、⑤,”的基因

基因表達(dá)載體（質(zhì)組質(zhì)粒）

3.將目的基因?qū)胧苄菁?xì)胞

受體細(xì)胞導(dǎo)入方法內(nèi)容

①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入壬蜃中：

花粉管

②植物受粉后，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使

通道法

植物細(xì)胞目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊

農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可攜帶目的基因整合到受體

轉(zhuǎn)化法細(xì)胞的染色體DNA上

顯微注射

動物細(xì)胞常用受體細(xì)胞：受精卵

技術(shù)

Ca?一處用C'a2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子

原核細(xì)胞

理法的生理狀態(tài)

4提醒

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的

T-DNA±,第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞的染色

體DNA上；第一次導(dǎo)入是導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入（非人工操作）是將含目的基因的T-DNA

導(dǎo)入受體細(xì)胞。

②導(dǎo)入的目的基因可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體

DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染工

4.目的基因的檢測與鑒定

I

分子春檢測個體生物學(xué)

水平鑒定

|辨析與表達(dá)

（1）目的基因就是指編碼蛋白質(zhì)的基因。（X）

（2）DNA片段的PCR獷增實險中反應(yīng)緩沖液中的Mg2+能夠激活時高溫的DNA聚合酶。

（J）

（3）一個基因表達(dá)載體一般包括目的基因、標(biāo)記基因、起始密碼子和終止密碼子等結(jié)構(gòu)。

（4）培育抗蟲棉時，將抗蟲基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA片段內(nèi)。（J）

（5）若受體細(xì)胞為大腸桿菌，則需先用Ca?+處理，更利于實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。（J）

（6）若能在植物細(xì)胞中檢測到相應(yīng)的目的基因，則說明基因工程項目獲得成功。（X）

(7)檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否具有抗蟲性狀時，選擇轉(zhuǎn)基因棉花與普通棉花分別接種等量

棉鈴蟲進(jìn)行比較。(J)

(8)用PCR不能直接擴(kuò)增mRNA的原因是PCR是片:DNA雙筵作模板的，不能直接用單

繕RNA做PCR,必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再做PCR。

(9)(選擇性必修3P81“資料卡”)農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，

為什么能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并整合到染色體DNA上?

提示：農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T?DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的

染色體DNA上。

關(guān)鍵能力提出?研趨勢

【情境應(yīng)用】如圖是PCR反應(yīng)過程示意圖。

DNAI5-

模板\k?)

f4種脫氧核￡“耐高溫的DNA聚合酶

普酸”引物

'DQUUUIUIIUIOUUI3,,…,___________

53

3iuimimiui5.miiiiiiniiiiiimiiHiniDiin

持了增的DNA片段/111

,iiiimmimi[n|；nnniQ5總

3mimmiiiiL灑1111111111111115,

變性3‘復(fù)性‘延伸

【問題探究】

(l)PCR技術(shù)需要引物的理由是DNA聚合解不能從要開始合成DNA.只能從3'端延伸

DNA鏈。

(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時需要兩種引物，原因是目的基因的兩條反向平行的捶

都作為模板,其堿基序列不同'

(3)設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序

列)都不合理(如圖)，請分別說明理由。

第組引物f弓I物I

11nCAGGCT

1引物niiiiii

AGCCTG

第2組引物［HI*—AACTG—CAGTT

［引物n，.——........——

CGACTGATTA

①第］組：引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補配對而失效:

②第2組：引物「自身折■后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。

(4)為檢測胚乳細(xì)胞中畋基因是否表達(dá)，科研人員提取胚乳中的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過

程獲得總cDNA,通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地擴(kuò)增出Wx基因的cDNA,原因是

引物是依據(jù)法基因的一段已知片列設(shè)計合成的(或引物能與仍:基因的cDNA特異性結(jié)合)。

(5)若一個DNA分子在PCR中經(jīng)過〃輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個引物？第〃輪循

環(huán)需要消耗多少個引物？

提示：經(jīng)過〃輪循環(huán)需要消耗引物數(shù)為Q的-2)個，第〃輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2〃

個。

歸納總結(jié)L

PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律

Rimnnnn幅t，

□吧手

3，.￥flnnE手

*3m的nnnu皿哆

一目標(biāo)序列

一?依具序列

口引物A：；陽理"；：HnnH

口引物B

韁環(huán)1:循環(huán)2:循環(huán)3:

變性+復(fù)性+延伸變性+及性-莫?變性?復(fù)性?英仲

循環(huán)次數(shù)123n

DNA分子數(shù)2482“

含引物A（或B）的DNA分子數(shù)1,72”-1

0=2=6=

同時含引物A、B的DNA分子數(shù)2〃一2

2'-222-223一2

2=6=14=

共消耗的引物數(shù)量2〃+1—2

2|+,-222+1-223+-2

核心素養(yǎng)達(dá)成/?破考向

考向1結(jié)合目的基因的篩選與獲取考查科學(xué)思維

1.（2025?江蘇南通模擬）引物的設(shè)計是影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性的關(guān)鍵因素,

相關(guān)敘述正確的是（B）

A.引物的堿基數(shù)量越少，則復(fù)性溫度越低、目標(biāo)DNA獲得率越高

B.根據(jù)需要可在引物的5,端添加限制酶識別序列、點突變序列等

C.兩種引物的復(fù)性溫度差異較大，可減少引物與模板的非特異性結(jié)合

D.引物的G—C含量越高，結(jié)合特異性越強，越利于目標(biāo)DNA的擴(kuò)增

解析：復(fù)性溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，引物的堿基數(shù)量越少，

則復(fù)性溫度越低，但能與引物發(fā)生配對的片段就越多，目標(biāo)DNA獲得率越低，A錯誤；根

據(jù)需要可在引物的5'端添加限制酶識別序列、點突變序列等，以便更加準(zhǔn)確地獲得目的基因，

B正確；兩種引物的復(fù)性溫度差異較大，導(dǎo)致不能同時復(fù)性，甚至一條鏈在延伸，一條鏈在

復(fù)性，可增加引物與模板的非特異性結(jié)合，C錯誤；引物的G—C含量越高，結(jié)合特異性越

強，但G—C含量過高，不利于復(fù)性，從而阻礙目標(biāo)DNA的擴(kuò)增，D錯誤。

2.（2022?遼寧卷）抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12—5是我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為

給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因檢測，反應(yīng)程序如圖所示。

下列敘述正確的是（B）

預(yù)變性「變性：

941minIQJ.八\!

/匕30\延伸；后延伸

\復(fù)性.2tC,30s172P,1min

58P,30s

：<--------35次循環(huán)-------->;

A.預(yù)變性過程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制

B.后延伸過程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分

C.延伸過程無須引物參與即可完成半保留復(fù)制

D.轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測含有目的基因后即可上市

解析：預(yù)變性是使模板DNA充分變性，A錯誤：后延伸過程是為了使目的基因的擴(kuò)增

更加充分，B正確：延伸過程需引物參與，C錯誤；轉(zhuǎn)基因品種不僅需要檢測是否含有目的

基因，還要檢測目的基因是否表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能存在的安全性問題后才可上市，D錯

誤。

考向2圍繞基因工程的基本操作程序考查科學(xué)思、維、科學(xué)探究））

3.（2023?湖北卷）壓氨莘青霉素抗性基因（4叩R）、四環(huán)素抗性基因（定喬）作為標(biāo)記基因

構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酸切后的質(zhì)粒構(gòu)建基因

表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），棄轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（D）

A.若用〃加dHI酸切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用P以I酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用即力I酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否

D.若用如〃I酶切，攜帶"的基因的受體菌在含Amp（氨茉青霉素）和Tet的培養(yǎng)基

中能形成菌落

解析：若用小〃dHI酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能

不同，A正確；若用2%I酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因（在力，因此在含

Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確：重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不

同，DNA凝膠電冰技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段.能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，

C正確；SphI的晦切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphI酪切,重組質(zhì)粒中含氨節(jié)青

霉素抗性基因（力〃?〃R）,但四環(huán)素抗性基因（7?力被破壞，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp

（氨羊青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。

/歸納總結(jié)

限制酶的選擇技巧

1.根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類

PsiISma1PstI

III

SmaIEcoR1

圖1

（1）應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖1可選擇RfIo

（2）不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖1不能選擇S〃?al。

（3）為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基

因和質(zhì)粒，如圖1也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制攜（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種晦的

切點或切割后有與之相同的末端）。

2.根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酹的種類

其以點不

在啟動子

與終止子—?XhoI其會破壞啟動子,

之同，不HindlW不宜選擇

宜選擇

抗生啟動子NdeI

其位于啟動子、終

素抗XbaI

止子之間，宜選擇

PstI性基因

終止子風(fēng)BamHI

其會破壞終止子.

其會破壞EcoRI

不宜選擇

標(biāo)記基因,

不宜選擇

復(fù)制原點被破壞后，目的基因不能在受體匆胞中復(fù)制，不宜選擇

4.（2024?重慶卷）大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。

我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN（種子較大）中的表達(dá)量高于品種TL（種子較

?。缓罂寺×嗽摶騣兩品種中基因S序列無差異）及其上游的啟動子序列，并開展相

關(guān)研究。

①表達(dá)載體

限制酶識別位點

（小〃dlll,SpeI,￡coRI,XhaI）

②啟動子D+基因S

5'.........TAGAATTCCA.........3'

3'.........ATCTTAAGGT.........5'

③四種限制酶識別序列及切割位點

HindDI：SpeI：EcoRI：XbaI：

1rii

5'AAGCTT3'5'ACTAGT3'5/GAATTC3,5'TCTAGA3'

3,TTCGAA5,3,TGATCA5,3'CTTAAG5'3'AGATCT5'

tttt

注箭頭表示薛的切割位置。

（1）基因S啟動子的某本組成單位是脫氧核糖核苔酸（脫氧核昔酸）。

（2）通過基因工程方法,將DN克隆的“啟動子D+基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大

豆品種YZ。根據(jù)如圖所示信息（不考慮未標(biāo)明序列）判斷構(gòu)建重組表達(dá)載體時，為保證目

標(biāo)序列的完整性，不宜使用的限制版是EccR1；此外，不宜同時選用前蘇eI和筋〃I。

原因是酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我環(huán)化：不能保證目標(biāo)片段與載體定向連接。

（3）為驗證“啟動子D+基因S”是否連接在表達(dá)載體上，可用限制的對?重組表達(dá)載體酹

切后進(jìn)行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外，還應(yīng)有酶切后的空載體

片段、啟動子D+基因S片段。經(jīng)驗證的重組表達(dá)載體需轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，檢測轉(zhuǎn)入是否成功的

技術(shù)是因工。

（4）用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ-1的種子變大。同時將從TL克隆

的“啟動子T+基因S”序列成功導(dǎo)入Y乙所得再生植株YZ-2的種子也變大，但小于YZ-L

綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是品種DN的基因S上游啟動子效應(yīng)比TL強.

使得基因S表達(dá)量更高,種子更大.

解析：(1)啟動子是RNA聚合酹識別和結(jié)合的部位，用于啟動DNA的轉(zhuǎn)錄，是一段DNA

片段，其基本組成單位是四種脫氧核糖核苔酸。(2)根據(jù)圖示信息可知，“啟動子D+基因S”

的DNA序列上存在EcoRi的識別序列，若使用限制酶EcoRi,會使目的基因序列被破壞：

根據(jù)圖中限制酶的識別序列及切割位點可知，限制酶即eI和XbaI切割產(chǎn)生的黏性末端相

同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA片段在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，

以及無法保證目的基因片段與載體片段定向連接，影響目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)。

(3)DNA也泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達(dá)載體酶切后的產(chǎn)物不僅

有啟動子D+基因S片段，還有酹切后的空載體片段，因此電泳時，對照樣品除指示分子大

小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外，還應(yīng)有隘切后的空載體片段和啟動子D+基因S片段；在分子水平上檢

測目的基因是否轉(zhuǎn)入成功可通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的DNA上是否插入目的基因或

目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAo(4)根據(jù)題目信息可知，再生植株YZ-1導(dǎo)入的目的基因為取自

品種DN的“啟動子D+基因S”序列，再生植株YZ-2導(dǎo)入的目的基因為取自品種TL的

“啟動子T+基因S”序列，結(jié)合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種

DN的基因S上游的啟動子D的效應(yīng)強于品種TL的啟動子T,啟動子D使基因S表達(dá)量更

高，因而種子更大。

/歸納總結(jié)

如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞

1.原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種

抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性

基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。

2.被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。

3.篩選方法：將細(xì)南先放在含氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的

細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的

培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即含有重組質(zhì)粒

的菌落，如圖中1、5菌落。最后，可在含氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

考點三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒

定

必備知識梳理?夯基礎(chǔ)

1.DNA的粗提取與鑒定

(I)實驗原理

提取利用DNA和其他物質(zhì)在物理和

思路化學(xué)性質(zhì)方面的差異,提取DNA

實

驗溶解度：DNA不溶于酒精.

原

理可與蛋白質(zhì)等分離

DNA在不同濃度的

商T的|NaQ溶液中溶解度不同.

性質(zhì)能溶于2mol/L的NaQ溶

液

DNA的鑒定：DNA+二苯

胺試劑沸水浴，藍(lán)色

(2)實驗步驟

一提醒

①加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA

分子不能形成絲狀物。

②本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無

細(xì)胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料。

2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

(1)實驗基礎(chǔ)

加熱,雙螺

IPCR'雙鏈旋結(jié)構(gòu)斛體一單鏈

|原理|一DNA‘緩慢冷卻?分離的‘DNA

DNA疑乂重新結(jié)合

DNA分子具有可解離的基團(tuán)?在一定的

pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電

荷。在電場的作用下.這些帶電分子會向

著與它所帶電荷柯區(qū)的電極移動.這個過

程就是電泳

PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來

畫一鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與

凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等

有關(guān)

(2)PCR實驗操作步驟

用微量移液器按照配方或PCR試劑盒的

移液

說明書且微量離心管中依次加入各級分

蓋嚴(yán)離心管的蓋子.將微量離心管放入離

心機(jī)里，離心約10§.使反應(yīng)液集中在管

的底部

設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序，將裝有反應(yīng)

I反應(yīng)I-

液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)

(3)DNA的電泳鑒定

瓊脂糖凝膠制備：根據(jù)待分離DNA片段

的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液

(一般質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%?1.2%),在沸

水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍

冷卻后?加入適量的核酸染料混勻

凝膠板制備：將溫?zé)岬沫傇轮继侨芤貉杆俚?/p>

入模具，并插入合適大小的梳子形成加樣

孔?待凝膠溶液完全凝固后，小心拔出梳

子?將凝膠放入電泳槽內(nèi)

電

泳

鑒點樣：加電泳緩沖液.然后用微量移液器

定將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖

液(內(nèi)含指示劑)的混合液注入加樣孔

內(nèi).