分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范手冊(cè)一、引言本手冊(cè)旨在規(guī)范分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作流程，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性，同時(shí)確保實(shí)驗(yàn)人員安全與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境合規(guī)。適用于科研機(jī)構(gòu)、高校及企業(yè)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，供科研人員、技術(shù)人員及學(xué)生參考使用。二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與環(huán)境要求（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制1.溫濕度與潔凈度：常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度宜保持在20–25℃，濕度40%–60%；無菌操作區(qū)（如細(xì)胞房、超凈臺(tái)）需定期監(jiān)測(cè)塵埃粒子數(shù)，每周至少進(jìn)行1次紫外消毒（時(shí)間≥30分鐘）。2.功能分區(qū)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分試劑準(zhǔn)備區(qū)（配制試劑、引物）、樣本處理區(qū)（核酸/蛋白提?。?、擴(kuò)增區(qū)（PCR操作）、檢測(cè)區(qū)（電泳、成像），避免交叉污染。（二）個(gè)人防護(hù)規(guī)范1.防護(hù)裝備：實(shí)驗(yàn)全程需穿戴實(shí)驗(yàn)服（定期清洗，避免帶出實(shí)驗(yàn)室）、一次性手套（核酸實(shí)驗(yàn)換手套頻率≥2次/樣本，避免RNA酶污染）；涉及有毒試劑（如EB、甲醇）或氣溶膠操作時(shí)，需佩戴護(hù)目鏡與N95口罩。2.操作后清潔：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即洗手，使用75%乙醇擦拭工作臺(tái)；若試劑接觸皮膚/眼睛，立即用大量清水沖洗（≥15分鐘），必要時(shí)就醫(yī)。（三）試劑與耗材準(zhǔn)備1.試劑質(zhì)檢：新購(gòu)試劑需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（如PCR酶的擴(kuò)增效率、核酸染料的靈敏度）；避光試劑（如EB、熒光染料）需儲(chǔ)存于棕色瓶，-20℃或4℃保存。2.耗材處理：槍頭、離心管等耗材需經(jīng)高壓滅菌（121℃，20分鐘）或無酶處理（RNA實(shí)驗(yàn)用DEPC水浸泡過夜后滅菌）；玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡后沖洗晾干。三、核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)范（一）核酸提取（以植物基因組DNA提取為例）1.樣品處理：取新鮮葉片（≤0.1g），液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2mL離心管。2.裂解與分離：加入600μLCTAB裂解液（65℃預(yù)熱），渦旋混勻后65℃水浴30分鐘（每10分鐘顛倒一次）；加入等體積氯仿-異戊醇（24:1），輕柔顛倒10次，____rpm離心10分鐘。3.沉淀與純化：取上清（避免吸到蛋白層），加入0.6倍體積異丙醇，-20℃靜置30分鐘；____rpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次（每次離心5分鐘）。4.溶解與保存：沉淀晾干后（避免完全干燥），加入50μLTE緩沖液（含RNaseA），37℃水浴30分鐘以去除RNA，-20℃保存。*注：RNA提取需全程使用無RNA酶耗材，裂解液含β-巰基乙醇，操作后樣品立即置于冰上，避免RNA降解。*（二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）1.反應(yīng)體系配制（冰上操作）：模板DNA（或cDNA）：1–5μL（濃度≤100ng/μL）引物（F/R）：各0.5–1μL（終濃度0.2–0.5μM）2×MasterMix：10μL（含酶、dNTP、Buffer）ddH?O：補(bǔ)至20μL*注：先加酶以外的試劑，最后加聚合酶，避免酶失活。*2.擴(kuò)增程序設(shè)置：預(yù)變性：95℃3分鐘（1個(gè)循環(huán)）變性：95℃30秒；退火：Tm值-5℃30秒；延伸：72℃1分鐘/kb（30–35個(gè)循環(huán)）終延伸：72℃5分鐘；保溫：4℃保存3.污染防控：設(shè)置陰性對(duì)照（模板換ddH?O）與陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性模板）；PCR產(chǎn)物與試劑配制區(qū)物理隔離，避免氣溶膠污染。（三）瓊脂糖凝膠電泳1.凝膠制備：稱取瓊脂糖（濃度1%–2%，依片段大小調(diào)整），加入TAE緩沖液，微波爐加熱至完全溶解；冷卻至50℃左右，加入核酸染料（如EB或SafeGreen，終濃度0.5μg/mL），倒入制膠板（避免氣泡），插入梳子。2.上樣與電泳：凝膠凝固后放入電泳槽，加樣孔梳齒端接負(fù)極；樣品與LoadingBuffer（含溴酚藍(lán)）按4:1混合，緩慢加入加樣孔（避免溢出）；恒壓電泳（5–10V/cm），至溴酚藍(lán)遷移至凝膠2/3處停止。3.結(jié)果觀察：戴手套取出凝膠，置于成像系統(tǒng)下觀察（EB染色需戴防護(hù)手套，避免接觸皮膚）；拍照時(shí)標(biāo)注Marker條帶大小，保存原始圖像。（四）分子克隆（質(zhì)粒構(gòu)建流程）1.質(zhì)粒提取（堿裂解法）：菌液37℃振蕩培養(yǎng)12–16小時(shí)，____rpm離心1分鐘收集菌體；加入SolutionI（含RNaseA）重懸，加SolutionII（裂解液）輕柔顛倒5次（室溫靜置5分鐘，勿劇烈振蕩）；加SolutionIII（中和液）顛倒10次，____rpm離心10分鐘，取上清過柱（硅膠膜吸附質(zhì)粒），用漂洗液洗滌后，加ElutionBuffer洗脫質(zhì)粒。2.酶切與連接：酶切體系：質(zhì)粒（1μg）+內(nèi)切酶（1–2μL）+10×Buffer+ddH?O，37℃孵育2–4小時(shí)；連接體系：載體（50–100ng）+插入片段（載體:片段=1:3–1:10）+T4連接酶（1μL）+10×Buffer，16℃連接過夜或22℃連接2小時(shí)。3.感受態(tài)轉(zhuǎn)化：取5μL連接產(chǎn)物加入100μL感受態(tài)細(xì)胞（冰浴30分鐘），42℃熱激90秒（勿搖動(dòng)），立即冰浴2分鐘；加800μL無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇1小時(shí)，取200μL涂布含抗生素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12–16小時(shí)。（五）蛋白免疫印跡（WesternBlot）1.樣品制備：細(xì)胞/組織加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，____rpm離心15分鐘取上清；BCA法蛋白定量后，按5:1加入5×LoadingBuffer，95℃煮樣5分鐘，-20℃保存。2.電泳與轉(zhuǎn)膜：SDS膠配制：分離膠（10%–12%）+濃縮膠（5%），上樣后恒壓電泳（濃縮膠50V，分離膠100V）；轉(zhuǎn)膜：PVDF膜用甲醇激活后，與膠、濾紙組成“三明治”結(jié)構(gòu)（避免氣泡），恒壓（200mA）轉(zhuǎn)膜1–2小時(shí)（依蛋白大小調(diào)整時(shí)間）。3.孵育與顯色：封閉：5%脫脂牛奶（或BSA，磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時(shí)；一抗孵育：4℃過夜（稀釋比例1:1000–1:5000），TBST洗滌3次（每次10分鐘）；二抗孵育：室溫1小時(shí)（HRP標(biāo)記，稀釋比例1:5000–1:____），TBST洗滌3次；顯色：滴加ECL底物，曝光（10秒–5分鐘，依信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整），ImageJ軟件分析條帶灰度。四、儀器設(shè)備操作與維護(hù)（一）PCR儀操作規(guī)范：設(shè)置程序時(shí)確認(rèn)循環(huán)數(shù)、溫度、時(shí)間；樣品管蓋緊，避免漏液；運(yùn)行結(jié)束后及時(shí)取出樣品，防止非特異性擴(kuò)增。維護(hù)要點(diǎn)：每月清潔加熱模塊（用75%乙醇擦拭）；每年校準(zhǔn)溫度準(zhǔn)確性（使用溫度驗(yàn)證儀）。（二）離心機(jī)平衡操作：離心管對(duì)稱放置，重量差≤0.1g；嚴(yán)禁無轉(zhuǎn)子空轉(zhuǎn)或超轉(zhuǎn)速運(yùn)行。維護(hù)要點(diǎn)：每周清理轉(zhuǎn)子腔（用棉簽蘸乙醇擦拭）；每季度檢查轉(zhuǎn)子密封圈，避免漏液腐蝕電機(jī)。（三）超凈工作臺(tái)無菌操作：開機(jī)后紫外消毒30分鐘，通風(fēng)10分鐘再操作；實(shí)驗(yàn)物品需經(jīng)酒精擦拭后放入，操作時(shí)保持氣流穩(wěn)定（勿阻擋風(fēng)口）。維護(hù)要點(diǎn)：每月更換高效過濾器前的預(yù)過濾棉；每半年檢測(cè)風(fēng)速（≥0.3m/s為合格）。五、生物安全與廢棄物處置（一）生物樣本處理細(xì)菌/酵母培養(yǎng)物：121℃高壓滅菌30分鐘后丟棄；重組質(zhì)粒/病毒樣本：需用含1%次氯酸鈉的廢液處理30分鐘。銳器（針頭、刀片）：放入專用利器盒，滿3/4時(shí)封閉，由專業(yè)機(jī)構(gòu)回收。（二）化學(xué)廢液分類核酸染料廢液（如EB）：用活性炭吸附后，按危廢處理；有機(jī)溶劑（甲醇、異丙醇）：?jiǎn)为?dú)收集，避免與水相廢液混合；酸堿廢液：中和至pH6–9后，稀釋排放（濃度≤1%）。六、實(shí)驗(yàn)記錄與數(shù)據(jù)管理（一）實(shí)驗(yàn)記錄本規(guī)范紙質(zhì)記錄：需包含日期、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒉牧希ㄔ噭┡?hào)、儀器型號(hào)）、操作步驟、原始數(shù)據(jù)（電泳圖、測(cè)序峰圖）、結(jié)果分析；異常結(jié)果需標(biāo)注原因（如“PCR無條帶，可能引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤”）。電子記錄：原始數(shù)據(jù)（如凝膠成像圖、蛋白定量結(jié)果）需以“日期-實(shí)驗(yàn)名稱-操作者”命名，備份至實(shí)驗(yàn)室服務(wù)器，保留至少3年。（二）數(shù)據(jù)可重復(fù)性保障詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件（如PCR退火溫度、轉(zhuǎn)膜時(shí)間），便于他人重復(fù)；關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)（如克隆構(gòu)建、藥物篩選）需至少重復(fù)3次，取平均值分析。七、常見問題與解決方案（一）PCR無擴(kuò)增產(chǎn)物原因：模板濃度低、引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤、酶失活。解決：提高模板量（≤1μg）、重新設(shè)計(jì)引物（檢查Tm值與特異性）、更換新酶并驗(yàn)證活性。（二）WesternBlot無信號(hào)原因：轉(zhuǎn)膜不完全、一抗失效、封閉過度。解決：延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間（或提高電壓）、更換一抗（4℃保存避