免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)操作流程一、實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是研究抗體結(jié)構(gòu)、功能及其與抗原相互作用的重要方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷和生物制品開(kāi)發(fā)。本流程涵蓋抗體制備、純化、鑒定及應(yīng)用等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作指導(dǎo)。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）試劑與材料

1.抗體溶液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配置不同濃度（如0.1-1.0mg/mL）

2.抗原溶液：純化抗原或重組蛋白，濃度需經(jīng)測(cè)定（如10-100μg/mL）

3.緩沖液：磷酸鹽緩沖液（PBS）、Tris-HCl等，pH值需精確調(diào)節(jié)（6.5-8.0）

4.試劑：吐溫-20（Tween-20）、甘氨酸、甲醇等純化輔助劑

5.儀器：離心機(jī)、電泳儀、酶標(biāo)儀、純水系統(tǒng)等

（二）耗材準(zhǔn)備

1.微量離心管（0.22μm濾膜）

2.純化柱（如蛋白G/蛋白A親和層析柱）

3.一次性手套、移液器吸頭等

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）抗體制備

1.抗原免疫動(dòng)物：選擇BALB/c、C57BL/6等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按標(biāo)準(zhǔn)免疫程序注射抗原（如佐劑乳化、多點(diǎn)注射）

2.血清采集：免疫后定期采血，通過(guò)血清分離機(jī)分離血漿

3.抗體純化：采用親和層析法

(1)預(yù)處理：血清經(jīng)0.22μm濾膜除菌后，加入蛋白G/A柱（流速1mL/min）

(2)洗脫：用含0.5-1.0MNaCl的緩沖液梯度洗脫（pH7.0-8.0）

(3)收集：通過(guò)蛋白檢測(cè)儀（如280nm吸光度）收集抗體峰段

（二）抗體純化

1.層析柱預(yù)處理：用平衡緩沖液（含0.1%Tween-20）平衡柱子（體積≥5倍柱體積）

2.上樣與洗脫：

(1)上樣：抗體溶液緩慢通過(guò)柱子（流速≤0.5mL/min）

(2)洗脫：先用低鹽緩沖液（0.1MNaCl）洗去未結(jié)合雜質(zhì)，再用高鹽緩沖液（1.0MNaCl）洗脫目標(biāo)抗體

3.收集與濃縮：收集抗體組分，通過(guò)超濾管（截留分子量3000Da）濃縮至目標(biāo)濃度

（三）抗體鑒定

1.SDS電泳：

(1)凝膠配置：12%分離膠+4%濃縮膠，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色

(2)結(jié)果分析：通過(guò)凝膠成像儀分析抗體條帶純度（純度≥90%為合格）

2.WesternBlot驗(yàn)證：

(1)配制抗原膜：轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉（4℃過(guò)夜）

(2)一抗孵育：抗體工作濃度0.1-0.5μg/mL，室溫孵育1-2h

(3)二抗結(jié)合：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（如1:5000稀釋?zhuān)?，孵?h

四、結(jié)果分析

（一）純化效果評(píng)估

1.純度檢測(cè)：通過(guò)SDS和WesternBlot驗(yàn)證抗體純度及特異性

2.活性測(cè)定：采用ELISA法檢測(cè)抗體結(jié)合活性（A值≥0.8為合格）

（二）儲(chǔ)存條件

1.穩(wěn)定劑：加入0.01%NaN3（終濃度）和20%甘油保護(hù)

2.保存方式：-20℃避光保存，反復(fù)凍融≤3次

五、注意事項(xiàng)

1.操作需在潔凈臺(tái)進(jìn)行，避免污染

2.每步操作后需用75%乙醇消毒工作臺(tái)面

3.抗體使用前需通過(guò)無(wú)菌檢測(cè)（≥99.9%無(wú)內(nèi)毒素）

4.高濃度抗體需分裝保存，避免反復(fù)凍融損失活性

**一、實(shí)驗(yàn)概述**

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是研究抗體結(jié)構(gòu)、功能及其與抗原相互作用的重要方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷和生物制品開(kāi)發(fā)。本流程涵蓋抗體制備、純化、鑒定及應(yīng)用等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作指導(dǎo)。通過(guò)系統(tǒng)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以確保獲得高純度、高活性的抗體，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）試劑與材料

1.抗體溶液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配置不同濃度（如0.1-1.0mg/mL），需使用無(wú)菌水或特定緩沖液溶解，并經(jīng)0.22μm濾膜除菌處理。儲(chǔ)存于-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。

2.抗原溶液：純化抗原或重組蛋白，濃度需經(jīng)測(cè)定（如10-100μg/mL），使用pH7.4的PBS或Tris-HCl緩沖液配制，并經(jīng)0.22μm濾膜除菌。儲(chǔ)存于-20℃。

3.緩沖液：

*磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：pH7.4，含0.01MNaH2PO4和0.137MNaCl，適用于多數(shù)免疫實(shí)驗(yàn)。

*Tris-HCl緩沖液：pH7.5-8.0，含0.1MTris-HCl和0.01MEDTA，適用于某些酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。

*甘氨酸緩沖液：pH2.8-3.0，用于抗體分子量測(cè)定（SDS）。

4.試劑：

*吐溫-20（Tween-20）：0.05%-0.1%濃度，用于洗滌步驟，提高非特異性結(jié)合蛋白的洗脫效率。

*甘氨酸：用于SDS凝膠電泳的濃縮膠和分離膠配制。

*甲醇：用于WesternBlot膜封閉和抗體稀釋。

*無(wú)水乙醇：用于SDS凝膠固定和抗體固定。

*DTT或β-巰基乙醇：還原劑，用于SDS樣品制備，打斷蛋白質(zhì)二硫鍵。

5.儀器：

*離心機(jī)：冷凍離心機(jī)（4℃）、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)，用于樣品分離和純化柱平衡。

*電泳儀：垂直電泳系統(tǒng)（用于SDS和WesternBlot）、水平電泳系統(tǒng)（用于免疫印跡）。

*酶標(biāo)儀：用于ELISA檢測(cè)抗體活性。

*蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：自動(dòng)層析系統(tǒng)或手動(dòng)層析柱。

*凝膠成像系統(tǒng)：化學(xué)發(fā)光或熒光成像，用于SDS和WesternBlot結(jié)果分析。

*超濾設(shè)備：用于抗體濃縮和緩沖液置換。

*恒溫?fù)u床：用于樣品孵育。

*超凈工作臺(tái)或生物安全柜：用于無(wú)菌操作。

（二）耗材準(zhǔn)備

1.微量離心管：0.5mL或1.5mL，帶0.22μm濾膜，用于樣品分裝和除菌。

2.純化柱：蛋白G/蛋白A親和層析柱（如Ni-NTA柱用于His標(biāo)簽蛋白），需預(yù)先用平衡緩沖液充分平衡。

3.層析柱：凝膠過(guò)濾層析柱（如Superdex200GL），用于抗體脫鹽和緩沖液置換。

4.電泳相關(guān)耗材：

*SDS凝膠試劑盒：預(yù)鑄凝膠或凝膠試劑盒（含分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液）。

*聚丙烯酰胺凝膠電泳槽。

*移液器吸頭：不同量程（1μL-1000μL），需定期校準(zhǔn)。

*電極梳、梳子固定架。

5.轉(zhuǎn)移相關(guān)耗材：

*轉(zhuǎn)移膜（PVDF膜、NC膜或尼龍膜），需預(yù)濕。

*甲醇：用于膜預(yù)處理。

*轉(zhuǎn)移槽：含電導(dǎo)緩沖液（如TBST）。

6.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）耗材：

*96孔酶標(biāo)板。

*辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗或生物素標(biāo)記的二抗。

*顯色試劑：TMB或5-氨基水楊酸（5-AS）。

*終止液：H2SO4或HCl。

7.一次性手套、移液器吸頭、離心管架、封口膜等。

**三、實(shí)驗(yàn)步驟**

（一）抗體制備

1.抗原免疫動(dòng)物：

*選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如BALB/c或C57BL/6小鼠，體重需符合實(shí)驗(yàn)要求（通常6-8周齡）。

*設(shè)計(jì)免疫程序：采用足墊注射或腹腔注射方式，初次免疫通常使用Freund's不完全佐劑乳化抗原（抗原與佐劑體積比1:1），加強(qiáng)免疫使用Freund's完全佐劑或純佐劑（如MontanideISA51），間隔2-4周進(jìn)行。

*免疫劑量：通常為10-50μg抗原/次，佐劑體積根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整（如0.1-0.2mL/次）。

*免疫周期：根據(jù)抗體需求，通常免疫3-5次，最后一次免疫后7-14天采血。

2.血清采集：

*采用眼底靜脈或心臟采血法，收集血液于含肝素或EDTA的抗凝管中（避免使用檸檬酸鈉，可能干擾抗體純化）。

*靜置血樣，4℃離心（3000rpm，20min）分離血漿。

*將血漿轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，經(jīng)0.22μm濾膜除菌，分裝后-20℃或-80℃凍存。

3.抗體純化：采用親和層析法

*預(yù)處理：取適量血漿，用0.22μm濾膜除菌后，按純化柱說(shuō)明書(shū)進(jìn)行平衡。平衡通常使用含0.05MNaAc（pH4.0）的緩沖液，平衡體積至少為柱體積的5-10倍。

*上樣與結(jié)合：將除菌后的抗體溶液緩慢通過(guò)已平衡的純化柱（上樣流速不超過(guò)0.5mL/min），抗體與柱內(nèi)配體（如蛋白G或蛋白A）結(jié)合。

*洗脫：首先用低鹽緩沖液（如含0.1MNaCl的平衡緩沖液）沖洗柱子，除去未結(jié)合的血漿蛋白和其他雜質(zhì)（洗脫體積為柱體積的2-3倍）。然后逐步增加緩沖液中鹽濃度（如用含0.5-1.0MNaCl的緩沖液，pH7.0-8.0），使結(jié)合的抗體特異性解離下來(lái)，收集解離液（抗體峰）。洗脫過(guò)程中可通過(guò)監(jiān)測(cè)流出液在特定波長(zhǎng)（如280nm）的吸光度變化，確定抗體洗脫峰。

*收集與濃縮：收集抗體洗脫峰組分，可通過(guò)分裝或超濾管（截留分子量3000Da）進(jìn)行濃縮至所需濃度。超濾濃縮時(shí)，需逐步更換至無(wú)鹽或低鹽緩沖液進(jìn)行置換，避免抗體聚集。

（二）抗體純化（親和層析后的進(jìn)一步純化）

1.層析柱預(yù)處理：

*選擇合適的層析柱（如凝膠過(guò)濾柱或離子交換柱），根據(jù)抗體分子量選擇合適的填料。

*用平衡緩沖液（如含0.1%Tween-20的PBS）平衡柱子，平衡體積為柱體積的5-10倍。平衡過(guò)程中需保持緩慢流速，確保填料充分浸潤(rùn)。

2.上樣與洗脫：

*將濃縮后的抗體溶液用平衡緩沖液適當(dāng)稀釋?zhuān)ń档蜐舛瓤商岣呱蠘有剩?，緩慢上樣至平衡好的層析柱（上樣體積一般不超過(guò)柱體積的10%）。

*用平衡緩沖液沖洗柱子，除去未結(jié)合或非特異性結(jié)合的雜質(zhì)（洗脫體積為柱體積的2-3倍）。

*根據(jù)層析柱類(lèi)型進(jìn)行洗脫：

*凝膠過(guò)濾層析：通過(guò)改變緩沖液中鹽濃度（如從低鹽到高鹽）或pH值進(jìn)行梯度洗脫，分離不同分子量的蛋白質(zhì)。

*離子交換層析：通過(guò)改變緩沖液中鹽濃度或pH值（改變離子強(qiáng)度或電荷狀態(tài)）進(jìn)行洗脫，分離帶不同電荷的蛋白質(zhì)。

3.收集與濃縮：

*收集目標(biāo)抗體組分，可通過(guò)監(jiān)測(cè)特定波長(zhǎng)（如280nm）的吸光度變化或結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（如WesternBlot）。

*收集的抗體組分可通過(guò)超濾管（截留分子量3000Da）進(jìn)行濃縮至所需濃度，同時(shí)可去除過(guò)量的鹽或其他雜質(zhì)。濃縮過(guò)程中需使用無(wú)鹽或低鹽緩沖液進(jìn)行置換，避免抗體沉淀。

（三）抗體鑒定

1.SDS電泳：

*凝膠配制：按比例稱(chēng)取丙烯酰胺凝膠試劑盒中的丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸等，加入去離子水配制分離膠（濃度12%）和濃縮膠（濃度4%）。加入TEMED和過(guò)硫酸銨引發(fā)聚合。

*樣品制備：取適量抗體樣品，加入5×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），沸水浴變性5min。若需測(cè)定分子量，可加入分子量標(biāo)準(zhǔn)品。

*上樣與電泳：將變性后的樣品加入梳子孔中，蓋上蓋板，水平電泳系統(tǒng)預(yù)電泳濃縮膠（80V，15min），然后更換電壓至100V，進(jìn)行分離膠電泳，直至溴酚藍(lán)前沿跑至凝膠底部。

*染色與脫色：電泳結(jié)束后，取出凝膠，先用甲醇固定（10min），再用考馬斯亮藍(lán)R-250染色（1-2h），蒸餾水或脫色液脫色至背景清晰。

*結(jié)果分析：通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍攝凝膠圖像，分析抗體條帶純度（純度≥90%為合格）、分子量和均一性。

2.WesternBlot驗(yàn)證：

*轉(zhuǎn)膜：將SDS凝膠置于轉(zhuǎn)膜裝置中，加入預(yù)濕的PVDF膜或NC膜，使用甲醇處理膜（5min），然后在轉(zhuǎn)移緩沖液（含20%甲醇）中平衡15-30min。連接電泳儀，設(shè)置合適電壓（如100V）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間根據(jù)凝膠大小而定（如10-20min）。

*膜封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用TBST（含0.05%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）漂洗（10minx2），然后加入5%脫脂奶粉或BSA溶液的TBST，室溫?fù)u床封閉1-2h，或4℃過(guò)夜封閉。

*一抗孵育：封閉結(jié)束后，棄封閉液，用TBST漂洗（10minx3），然后加入稀釋后的一抗（抗體工作濃度0.1-0.5μg/mL，用TBST或含少量脫脂奶粉的TBST稀釋?zhuān)覝鼗?℃孵育1-2h。

*二抗結(jié)合：孵育結(jié)束后，用TBST漂洗（10minx3），然后加入相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗（工作濃度1:5000-1:10000，用TBST稀釋?zhuān)?，室溫孵?h。

*化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：用TBST漂洗（10minx3），加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑盒），避光反應(yīng)1-5min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

*結(jié)果分析：通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度判斷抗體與抗原的特異性結(jié)合能力。

**四、結(jié)果分析**

（一）純化效果評(píng)估

1.純度檢測(cè)：通過(guò)SDS和WesternBlot驗(yàn)證抗體純度及特異性。純化后的抗體應(yīng)呈現(xiàn)單一主帶，WesternBlot結(jié)果顯示在對(duì)應(yīng)抗原位置有特異性條帶。

2.活性測(cè)定：采用ELISA法檢測(cè)抗體結(jié)合活性。將抗原包被于酶標(biāo)板，加入不同濃度的抗體，再結(jié)合HRP標(biāo)記的二抗，最后加入TMB顯色液，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定A值（450nm）。計(jì)算抗體效價(jià)（如能產(chǎn)生最大信號(hào)所需抗體濃度）和結(jié)合曲線，評(píng)估抗體活性。

（二）儲(chǔ)存條件

1.穩(wěn)定劑：抗體儲(chǔ)存液中需加入0.01%NaN3（終濃度）作為防腐劑，防止微生物生長(zhǎng)。加入20%甘油可增加抗體穩(wěn)定性，特別是在冷凍過(guò)程中。

2.保存方式：抗體應(yīng)分裝后儲(chǔ)存于-20℃或-80℃。避免反復(fù)凍融，建議分裝成小份（每次使用量），減少凍融次數(shù)。長(zhǎng)期儲(chǔ)存（超過(guò)1年）建議在-80℃。

**五、注意事項(xiàng)**

1.操作需在潔凈臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，確保無(wú)菌環(huán)境，避免樣品污染。

2.所有試劑和耗材均需經(jīng)過(guò)滅菌處理（如高壓蒸汽滅菌、濾膜除菌），確保無(wú)菌。

3.移液操作需使用校準(zhǔn)后的移液器，確保加樣準(zhǔn)確。

4.電泳和轉(zhuǎn)膜時(shí)需確保電極連接正確，防止短路。

5.親和層析純化時(shí)，上樣濃度不宜過(guò)高，避免填料過(guò)載導(dǎo)致抗體活性下降。

6.WesternBlot封閉和孵育過(guò)程中，避免膜干燥，必要時(shí)用濕布覆蓋。

7.使用抗體前需確認(rèn)其活性，避免使用失效抗體導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

8.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有廢棄物需按照規(guī)定進(jìn)行分類(lèi)處理，避免環(huán)境污染。

一、實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是研究抗體結(jié)構(gòu)、功能及其與抗原相互作用的重要方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷和生物制品開(kāi)發(fā)。本流程涵蓋抗體制備、純化、鑒定及應(yīng)用等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作指導(dǎo)。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）試劑與材料

1.抗體溶液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配置不同濃度（如0.1-1.0mg/mL）

2.抗原溶液：純化抗原或重組蛋白，濃度需經(jīng)測(cè)定（如10-100μg/mL）

3.緩沖液：磷酸鹽緩沖液（PBS）、Tris-HCl等，pH值需精確調(diào)節(jié)（6.5-8.0）

4.試劑：吐溫-20（Tween-20）、甘氨酸、甲醇等純化輔助劑

5.儀器：離心機(jī)、電泳儀、酶標(biāo)儀、純水系統(tǒng)等

（二）耗材準(zhǔn)備

1.微量離心管（0.22μm濾膜）

2.純化柱（如蛋白G/蛋白A親和層析柱）

3.一次性手套、移液器吸頭等

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）抗體制備

1.抗原免疫動(dòng)物：選擇BALB/c、C57BL/6等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按標(biāo)準(zhǔn)免疫程序注射抗原（如佐劑乳化、多點(diǎn)注射）

2.血清采集：免疫后定期采血，通過(guò)血清分離機(jī)分離血漿

3.抗體純化：采用親和層析法

(1)預(yù)處理：血清經(jīng)0.22μm濾膜除菌后，加入蛋白G/A柱（流速1mL/min）

(2)洗脫：用含0.5-1.0MNaCl的緩沖液梯度洗脫（pH7.0-8.0）

(3)收集：通過(guò)蛋白檢測(cè)儀（如280nm吸光度）收集抗體峰段

（二）抗體純化

1.層析柱預(yù)處理：用平衡緩沖液（含0.1%Tween-20）平衡柱子（體積≥5倍柱體積）

2.上樣與洗脫：

(1)上樣：抗體溶液緩慢通過(guò)柱子（流速≤0.5mL/min）

(2)洗脫：先用低鹽緩沖液（0.1MNaCl）洗去未結(jié)合雜質(zhì)，再用高鹽緩沖液（1.0MNaCl）洗脫目標(biāo)抗體

3.收集與濃縮：收集抗體組分，通過(guò)超濾管（截留分子量3000Da）濃縮至目標(biāo)濃度

（三）抗體鑒定

1.SDS電泳：

(1)凝膠配置：12%分離膠+4%濃縮膠，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色

(2)結(jié)果分析：通過(guò)凝膠成像儀分析抗體條帶純度（純度≥90%為合格）

2.WesternBlot驗(yàn)證：

(1)配制抗原膜：轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉（4℃過(guò)夜）

(2)一抗孵育：抗體工作濃度0.1-0.5μg/mL，室溫孵育1-2h

(3)二抗結(jié)合：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（如1:5000稀釋?zhuān)?，孵?h

四、結(jié)果分析

（一）純化效果評(píng)估

1.純度檢測(cè)：通過(guò)SDS和WesternBlot驗(yàn)證抗體純度及特異性

2.活性測(cè)定：采用ELISA法檢測(cè)抗體結(jié)合活性（A值≥0.8為合格）

（二）儲(chǔ)存條件

1.穩(wěn)定劑：加入0.01%NaN3（終濃度）和20%甘油保護(hù)

2.保存方式：-20℃避光保存，反復(fù)凍融≤3次

五、注意事項(xiàng)

1.操作需在潔凈臺(tái)進(jìn)行，避免污染

2.每步操作后需用75%乙醇消毒工作臺(tái)面

3.抗體使用前需通過(guò)無(wú)菌檢測(cè)（≥99.9%無(wú)內(nèi)毒素）

4.高濃度抗體需分裝保存，避免反復(fù)凍融損失活性

**一、實(shí)驗(yàn)概述**

免疫學(xué)抗體實(shí)驗(yàn)是研究抗體結(jié)構(gòu)、功能及其與抗原相互作用的重要方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷和生物制品開(kāi)發(fā)。本流程涵蓋抗體制備、純化、鑒定及應(yīng)用等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，旨在提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作指導(dǎo)。通過(guò)系統(tǒng)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以確保獲得高純度、高活性的抗體，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）試劑與材料

1.抗體溶液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配置不同濃度（如0.1-1.0mg/mL），需使用無(wú)菌水或特定緩沖液溶解，并經(jīng)0.22μm濾膜除菌處理。儲(chǔ)存于-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。

2.抗原溶液：純化抗原或重組蛋白，濃度需經(jīng)測(cè)定（如10-100μg/mL），使用pH7.4的PBS或Tris-HCl緩沖液配制，并經(jīng)0.22μm濾膜除菌。儲(chǔ)存于-20℃。

3.緩沖液：

*磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：pH7.4，含0.01MNaH2PO4和0.137MNaCl，適用于多數(shù)免疫實(shí)驗(yàn)。

*Tris-HCl緩沖液：pH7.5-8.0，含0.1MTris-HCl和0.01MEDTA，適用于某些酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。

*甘氨酸緩沖液：pH2.8-3.0，用于抗體分子量測(cè)定（SDS）。

4.試劑：

*吐溫-20（Tween-20）：0.05%-0.1%濃度，用于洗滌步驟，提高非特異性結(jié)合蛋白的洗脫效率。

*甘氨酸：用于SDS凝膠電泳的濃縮膠和分離膠配制。

*甲醇：用于WesternBlot膜封閉和抗體稀釋。

*無(wú)水乙醇：用于SDS凝膠固定和抗體固定。

*DTT或β-巰基乙醇：還原劑，用于SDS樣品制備，打斷蛋白質(zhì)二硫鍵。

5.儀器：

*離心機(jī)：冷凍離心機(jī)（4℃）、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)，用于樣品分離和純化柱平衡。

*電泳儀：垂直電泳系統(tǒng)（用于SDS和WesternBlot）、水平電泳系統(tǒng)（用于免疫印跡）。

*酶標(biāo)儀：用于ELISA檢測(cè)抗體活性。

*蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：自動(dòng)層析系統(tǒng)或手動(dòng)層析柱。

*凝膠成像系統(tǒng)：化學(xué)發(fā)光或熒光成像，用于SDS和WesternBlot結(jié)果分析。

*超濾設(shè)備：用于抗體濃縮和緩沖液置換。

*恒溫?fù)u床：用于樣品孵育。

*超凈工作臺(tái)或生物安全柜：用于無(wú)菌操作。

（二）耗材準(zhǔn)備

1.微量離心管：0.5mL或1.5mL，帶0.22μm濾膜，用于樣品分裝和除菌。

2.純化柱：蛋白G/蛋白A親和層析柱（如Ni-NTA柱用于His標(biāo)簽蛋白），需預(yù)先用平衡緩沖液充分平衡。

3.層析柱：凝膠過(guò)濾層析柱（如Superdex200GL），用于抗體脫鹽和緩沖液置換。

4.電泳相關(guān)耗材：

*SDS凝膠試劑盒：預(yù)鑄凝膠或凝膠試劑盒（含分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液）。

*聚丙烯酰胺凝膠電泳槽。

*移液器吸頭：不同量程（1μL-1000μL），需定期校準(zhǔn)。

*電極梳、梳子固定架。

5.轉(zhuǎn)移相關(guān)耗材：

*轉(zhuǎn)移膜（PVDF膜、NC膜或尼龍膜），需預(yù)濕。

*甲醇：用于膜預(yù)處理。

*轉(zhuǎn)移槽：含電導(dǎo)緩沖液（如TBST）。

6.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）耗材：

*96孔酶標(biāo)板。

*辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗或生物素標(biāo)記的二抗。

*顯色試劑：TMB或5-氨基水楊酸（5-AS）。

*終止液：H2SO4或HCl。

7.一次性手套、移液器吸頭、離心管架、封口膜等。

**三、實(shí)驗(yàn)步驟**

（一）抗體制備

1.抗原免疫動(dòng)物：

*選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如BALB/c或C57BL/6小鼠，體重需符合實(shí)驗(yàn)要求（通常6-8周齡）。

*設(shè)計(jì)免疫程序：采用足墊注射或腹腔注射方式，初次免疫通常使用Freund's不完全佐劑乳化抗原（抗原與佐劑體積比1:1），加強(qiáng)免疫使用Freund's完全佐劑或純佐劑（如MontanideISA51），間隔2-4周進(jìn)行。

*免疫劑量：通常為10-50μg抗原/次，佐劑體積根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整（如0.1-0.2mL/次）。

*免疫周期：根據(jù)抗體需求，通常免疫3-5次，最后一次免疫后7-14天采血。

2.血清采集：

*采用眼底靜脈或心臟采血法，收集血液于含肝素或EDTA的抗凝管中（避免使用檸檬酸鈉，可能干擾抗體純化）。

*靜置血樣，4℃離心（3000rpm，20min）分離血漿。

*將血漿轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，經(jīng)0.22μm濾膜除菌，分裝后-20℃或-80℃凍存。

3.抗體純化：采用親和層析法

*預(yù)處理：取適量血漿，用0.22μm濾膜除菌后，按純化柱說(shuō)明書(shū)進(jìn)行平衡。平衡通常使用含0.05MNaAc（pH4.0）的緩沖液，平衡體積至少為柱體積的5-10倍。

*上樣與結(jié)合：將除菌后的抗體溶液緩慢通過(guò)已平衡的純化柱（上樣流速不超過(guò)0.5mL/min），抗體與柱內(nèi)配體（如蛋白G或蛋白A）結(jié)合。

*洗脫：首先用低鹽緩沖液（如含0.1MNaCl的平衡緩沖液）沖洗柱子，除去未結(jié)合的血漿蛋白和其他雜質(zhì)（洗脫體積為柱體積的2-3倍）。然后逐步增加緩沖液中鹽濃度（如用含0.5-1.0MNaCl的緩沖液，pH7.0-8.0），使結(jié)合的抗體特異性解離下來(lái)，收集解離液（抗體峰）。洗脫過(guò)程中可通過(guò)監(jiān)測(cè)流出液在特定波長(zhǎng)（如280nm）的吸光度變化，確定抗體洗脫峰。

*收集與濃縮：收集抗體洗脫峰組分，可通過(guò)分裝或超濾管（截留分子量3000Da）進(jìn)行濃縮至所需濃度。超濾濃縮時(shí)，需逐步更換至無(wú)鹽或低鹽緩沖液進(jìn)行置換，避免抗體聚集。

（二）抗體純化（親和層析后的進(jìn)一步純化）

1.層析柱預(yù)處理：

*選擇合適的層析柱（如凝膠過(guò)濾柱或離子交換柱），根據(jù)抗體分子量選擇合適的填料。

*用平衡緩沖液（如含0.1%Tween-20的PBS）平衡柱子，平衡體積為柱體積的5-10倍。平衡過(guò)程中需保持緩慢流速，確保填料充分浸潤(rùn)。

2.上樣與洗脫：

*將濃縮后的抗體溶液用平衡緩沖液適當(dāng)稀釋?zhuān)ń档蜐舛瓤商岣呱蠘有剩徛蠘又疗胶夂玫膶游鲋ㄉ蠘芋w積一般不超過(guò)柱體積的10%）。

*用平衡緩沖液沖洗柱子，除去未結(jié)合或非特異性結(jié)合的雜質(zhì)（洗脫體積為柱體積的2-3倍）。

*根據(jù)層析柱類(lèi)型進(jìn)行洗脫：

*凝膠過(guò)濾層析：通過(guò)改變緩沖液中鹽濃度（如從低鹽到高鹽）或pH值進(jìn)行梯度洗脫，分離不同分子量的蛋白質(zhì)。

*離子交換層析：通過(guò)改變緩沖液中鹽濃度或pH值（改變離子強(qiáng)度或電荷狀態(tài)）進(jìn)行洗脫，分離帶不同電荷的蛋白質(zhì)。

3.收集與濃縮：

*收集目標(biāo)抗體組分，可通過(guò)監(jiān)測(cè)特定波長(zhǎng)（如280nm）的吸光度變化或結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（如WesternBlot）。

*收集的抗體組分可通過(guò)超濾管（截留分子量3000Da）進(jìn)行濃縮至所需濃度，同時(shí)可去除過(guò)量的鹽或其他雜質(zhì)。濃縮過(guò)程中需使用無(wú)鹽或低鹽緩沖液進(jìn)行置換，避免抗體沉淀。

（三）抗體鑒定

1.SDS電泳：

*凝膠配制：按比例稱(chēng)取丙烯酰胺凝膠試劑盒中的丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸等，加入去離子水配制分離膠（濃度12%）和濃縮膠（濃度4%）。加入TEMED和過(guò)硫酸銨引發(fā)聚合。

*樣品制備：取適量抗體樣品，加入5×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），沸水浴變性5min。若需測(cè)定分子量，可加入分子量標(biāo)準(zhǔn)品。

*上樣與電泳：將變性后的樣品加入梳子孔中，蓋上蓋板，水平電泳系統(tǒng)預(yù)電泳濃縮膠（80V，15min），然后更換電壓至100V，進(jìn)行分離膠電泳，直至溴酚藍(lán)前沿跑至凝膠底部。

*染色與脫色：電泳結(jié)束后，取出凝膠，先用甲醇固定（10min），再用考馬斯亮藍(lán)R-250染色（1-2h），蒸餾水或脫色液脫色至背景清晰。

*結(jié)果分析：通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍攝凝膠圖像，分析抗體條帶純度（純度≥90%為合格）、分子量和均一性。

2.WesternBlot驗(yàn)證：

*轉(zhuǎn)膜：將SDS凝膠置于轉(zhuǎn)膜裝置中，加入預(yù)濕的PVDF膜或NC膜，