免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程###一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫應(yīng)答機(jī)制、抗體特性、細(xì)胞功能等的重要手段。通過一系列標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，可以準(zhǔn)確檢測(cè)和分析免疫相關(guān)分子及細(xì)胞。本流程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與樣本處理

####（一）實(shí)驗(yàn)材料與試劑準(zhǔn)備

1.**主要試劑**：

-免疫佐劑（如弗氏不完全佐劑或完全佐劑）

-抗體（單克隆或多克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇）

-補(bǔ)體（如豚鼠補(bǔ)體或羊抗鼠IgG補(bǔ)體）

-酶標(biāo)記抗體（如HRP或AP標(biāo)記的抗體）

-終止液（如2MH?SO?或氫氧化鈉溶液）

-標(biāo)記底物（如TMB或OPD）

2.**其他材料**：

-96孔酶標(biāo)板或ELISA板

-移液器及吸頭（不同量程）

-微波爐或水浴鍋

-酶標(biāo)儀

####（二）樣本采集與處理

1.**樣本類型**：

-血清/血漿

-組織勻漿液

-細(xì)胞培養(yǎng)上清

-唾液或尿液

2.**處理步驟**：

(1)**血清/血漿制備**：

-靜脈采血，室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清。

--20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)**組織勻漿**：

-組織用PBS清洗，剪成小塊，加入勻漿緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上勻漿。

-12000rpm離心15分鐘，取上清。

(3)**細(xì)胞培養(yǎng)上清**：

-收集24-48小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液，4000rpm離心5分鐘，取上清。

###三、實(shí)驗(yàn)操作流程

####（一）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）

1.**包被**：

(1)將抗體（如捕獲抗體）用包被液稀釋至0.1-1.0μg/mL。

(2)100μL/孔加入ELISA板，4℃過夜包被。

(3)用PBST（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5分鐘。

2.**封閉**：

(1)加入封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉），37℃封閉1-2小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

3.**孵育檢測(cè)抗體**：

(1)加入稀釋后的檢測(cè)抗體（如一抗），37℃孵育1小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

4.**孵育酶標(biāo)抗體**：

(1)加入HRP或AP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

5.**顯色**：

(1)加入TMB或OPD底物，避光反應(yīng)15-30分鐘（可根據(jù)酶標(biāo)儀信號(hào)調(diào)整）。

(2)加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（OD450或OD405）。

6.**結(jié)果計(jì)算**：

-計(jì)算樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)品曲線的濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系。

####（二）WesternBlot（蛋白質(zhì)印跡）

1.**樣品制備**：

(1)細(xì)胞或組織裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

(2)樣品加入還原劑（如β-巰基乙醇）和上樣緩沖液，煮沸5分鐘。

2.**SDS電泳**：

(1)配制12-15%SDS凝膠，樣品上樣，100V電泳2-3小時(shí)。

(2)電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜。

3.**封閉與孵育**：

(1)膜用TBST洗滌，5%BSA封閉1小時(shí)。

(2)孵育一抗（1:1000稀釋），4℃過夜。

(3)TBST洗滌3次，孵育HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），37℃1小時(shí)。

4.**化學(xué)發(fā)光檢測(cè)**：

(1)加入ECL底物，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

(2)使用軟件分析條帶灰度值。

####（三）流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）

1.**細(xì)胞制備**：

(1)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，胰酶消化，PBS重懸。

(2)1000rpm離心5分鐘，棄上清。

2.**染色**：

(1)加入固定液，4℃固定30分鐘。

(2)PBS洗滌，加入破膜劑，室溫孵育15分鐘。

(3)孵育熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE，CD4-FITC），4℃避光30分鐘。

3.**上機(jī)檢測(cè)**：

(1)PBS洗滌，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

(2)設(shè)定門控區(qū)域，分析細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞功能。

###四、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

1.**數(shù)據(jù)分析軟件**：

-ELISA：GraphPadPrism或Excel擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

-WesternBlot：ImageJ或QuantityOne分析條帶灰度。

-流式細(xì)胞術(shù)：FlowJo或FCSExpress進(jìn)行細(xì)胞分群分析。

2.**結(jié)果解讀**：

-結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康模治隹贵w結(jié)合強(qiáng)度、蛋白表達(dá)水平或細(xì)胞亞群變化。

-注意對(duì)照組設(shè)置（如陰性對(duì)照、空白對(duì)照）以排除干擾。

###五、注意事項(xiàng)

1.**無菌操作**：所有實(shí)驗(yàn)需在潔凈臺(tái)進(jìn)行，避免污染。

2.**酶標(biāo)儀校準(zhǔn)**：定期校準(zhǔn)吸光度檢測(cè)，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

3.**抗體存儲(chǔ)**：抗體需-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

4.**安全防護(hù)**：操作時(shí)佩戴手套和護(hù)目鏡，避免試劑接觸皮膚。

###四、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析（續(xù)）

####（一）ELISA數(shù)據(jù)分析詳解

1.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：

(1)使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的OD值，在Excel或GraphPadPrism中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)選擇合適的回歸模型（如4-PL或線性回歸），確保R2值大于0.95。

(3)根據(jù)樣品OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)濃度。

2.**結(jié)果校正**：

(1)若存在背景吸光度，需從樣品OD值中扣除背景值。

(2)對(duì)于高濃度樣品，考慮進(jìn)行系列稀釋后重新測(cè)定。

3.**統(tǒng)計(jì)分析**：

(1)使用ANOVA或t檢驗(yàn)比較不同組間差異，p<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

(2)可計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）或標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示數(shù)據(jù)離散度。

####（二）WesternBlot數(shù)據(jù)分析詳解

1.**條帶識(shí)別與校準(zhǔn)**：

(1)在凝膠底部加入蛋白Marker，確定目標(biāo)蛋白大小。

(2)使用成像軟件自動(dòng)或手動(dòng)校準(zhǔn)條帶位置，確保灰度值準(zhǔn)確。

2.**定量方法**：

(1)避免目標(biāo)條帶飽和，適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間。

(2)使用ImageJ的“AnalyzeTools”測(cè)量條帶積分光密度（IOD）。

3.**內(nèi)參校正**：

(1)選擇Housekeeping蛋白（如β-actin或GAPDH）作為內(nèi)參。

(2)目標(biāo)蛋白表達(dá)量=目標(biāo)條帶IOD/內(nèi)參條帶IOD×100%。

####（三）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析詳解

1.**門控策略**：

(1)先設(shè)陰性對(duì)照門（如未染色細(xì)胞），排除背景熒光。

(2)根據(jù)FSC/SSC散點(diǎn)圖篩選活細(xì)胞，排除死細(xì)胞（如PI染色）。

(3)在目標(biāo)熒光通道上設(shè)門，分析特定細(xì)胞亞群。

2.**定量指標(biāo)**：

(1)**頻率**：亞群細(xì)胞占總活細(xì)胞的百分比。

(2)**平均熒光強(qiáng)度（MFI）**：反映細(xì)胞表面分子表達(dá)水平。

(3)**絕對(duì)計(jì)數(shù)**：結(jié)合細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算亞群絕對(duì)數(shù)量（需已知細(xì)胞濃度）。

3.**可視化工具**：

(1)使用FCSExpress繪制二維散點(diǎn)圖（如CD4vsCD8），直觀展示亞群分布。

(2)可進(jìn)行歸一化處理（如相對(duì)于對(duì)照組），增強(qiáng)可比性。

###五、注意事項(xiàng)（續(xù)）

####（一）試劑與耗材細(xì)節(jié)

1.**ELISA關(guān)鍵試劑**：

-包被抗體濃度：通常0.1-1.0μg/mL，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

-酶標(biāo)抗體稀釋液：5%-20%BSA封閉液常用于稀釋二抗。

-底物反應(yīng)條件：TMB需避光，OPD需室溫，終止后需快速混勻。

2.**WesternBlot耗材**：

-轉(zhuǎn)膜參數(shù)：PVDF膜需甲醇預(yù)浸10分鐘，轉(zhuǎn)膜條件100V/1小時(shí)。

-抗體稀釋液：5%脫脂奶粉或封閉液常用于一抗和二抗稀釋。

3.**流式細(xì)胞耗材**：

-染色濃度：CD標(biāo)記抗體常用濃度1-10μg/mL，需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

-固定液選擇：多聚甲醛適用于長(zhǎng)期存儲(chǔ)，甲醇適用于快速固定。

####（二）常見問題排查

1.**ELISA問題**：

-**背景高**：檢查包被液是否污染、洗滌是否充分。

-**信號(hào)弱**：確認(rèn)抗體效價(jià)，可嘗試提高抗體濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

2.**WesternBlot問題**：

-**條帶模糊**：SDS濃度不均或電泳電壓不穩(wěn)，需重新制備凝膠。

-**蛋白缺失**：樣品裂解不充分，可嘗試超聲破碎或增加裂解時(shí)間。

3.**流式細(xì)胞問題**：

-**熒光淬滅**：避免抗體長(zhǎng)時(shí)間暴露于強(qiáng)光，及時(shí)避光保存。

-**細(xì)胞聚集**：洗滌不充分導(dǎo)致細(xì)胞粘連，可增加PBS洗滌次數(shù)。

####（三）實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議

1.**ELISA優(yōu)化**：

-嘗試不同抗體濃度梯度（如0.1,0.5,1,5μg/mL）。

-比較不同封閉液（BSA、奶粉、脫脂牛奶）的效果。

2.**WesternBlot優(yōu)化**：

-調(diào)整抗體孵育條件（如4℃過夜vs37℃1小時(shí)）。

-嘗試不同還原劑（如β-巰基乙醇vs二硫蘇糖醇）。

3.**流式細(xì)胞優(yōu)化**：

-優(yōu)化抗體組合，減少非特異性結(jié)合（如加入封閉抗體）。

-調(diào)整細(xì)胞固定濃度（如多聚甲醛0.1%-4%梯度實(shí)驗(yàn)）。

###六、安全與存儲(chǔ)規(guī)范

####（一）個(gè)人防護(hù)措施

1.**基本防護(hù)**：

-操作時(shí)佩戴一次性手套、實(shí)驗(yàn)服和護(hù)目鏡。

-涉及生物危害時(shí)，需在生物安全柜中操作。

2.**化學(xué)品防護(hù)**：

-強(qiáng)酸強(qiáng)堿需佩戴耐腐蝕手套，避免接觸皮膚。

-溶劑（如乙醇、DMSO）需在通風(fēng)櫥中使用。

3.**廢棄物處理**：

-涂抹式廢棄物（如拭子）需放入生物危害垃圾袋。

-化學(xué)廢棄物按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定分類收集。

####（二）試劑存儲(chǔ)規(guī)范

1.**低溫存儲(chǔ)**：

-酶標(biāo)抗體、熒光抗體需-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

-試劑需標(biāo)注開蓋日期，優(yōu)先使用舊批次。

2.**避光存儲(chǔ)**：

-底物（TMB、ECL）需避光保存，開封后建議冷藏。

-熒光標(biāo)記抗體需避光，避免熒光猝滅。

3.**氣相保護(hù)**：

-氫氧化鈉等易吸收CO?的試劑需用密封瓶存儲(chǔ)。

-金屬酶（如HRP）需避免接觸空氣，可加惰性氣體保護(hù)。

####（三）設(shè)備維護(hù)

1.**酶標(biāo)儀校準(zhǔn)**：

-每月使用校準(zhǔn)品（如pH標(biāo)準(zhǔn)液）校準(zhǔn)吸光度檢測(cè)。

-定期清潔板面，避免交叉污染。

2.**流式細(xì)胞儀保養(yǎng)**：

-每次實(shí)驗(yàn)后清洗流式池，定期更換鞘液。

-校準(zhǔn)激光器功率和熒光通道，確保定量準(zhǔn)確。

3.**電泳設(shè)備維護(hù)**：

-檢查電源和電泳槽接地，避免漏電風(fēng)險(xiǎn)。

-定期更換緩沖液，清潔凝膠鑄模。

###七、總結(jié)

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程涉及多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從樣本處理到數(shù)據(jù)分析需嚴(yán)格把控。本流程通過細(xì)化操作步驟、優(yōu)化試劑選擇及規(guī)范安全措施，可提高實(shí)驗(yàn)效率和結(jié)果可靠性。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟悉各技術(shù)原理，并根據(jù)具體需求調(diào)整參數(shù)，確保實(shí)驗(yàn)成功。

###一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是研究免疫應(yīng)答機(jī)制、抗體特性、細(xì)胞功能等的重要手段。通過一系列標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，可以準(zhǔn)確檢測(cè)和分析免疫相關(guān)分子及細(xì)胞。本流程涵蓋樣本準(zhǔn)備、試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

###二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與樣本處理

####（一）實(shí)驗(yàn)材料與試劑準(zhǔn)備

1.**主要試劑**：

-免疫佐劑（如弗氏不完全佐劑或完全佐劑）

-抗體（單克隆或多克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇）

-補(bǔ)體（如豚鼠補(bǔ)體或羊抗鼠IgG補(bǔ)體）

-酶標(biāo)記抗體（如HRP或AP標(biāo)記的抗體）

-終止液（如2MH?SO?或氫氧化鈉溶液）

-標(biāo)記底物（如TMB或OPD）

2.**其他材料**：

-96孔酶標(biāo)板或ELISA板

-移液器及吸頭（不同量程）

-微波爐或水浴鍋

-酶標(biāo)儀

####（二）樣本采集與處理

1.**樣本類型**：

-血清/血漿

-組織勻漿液

-細(xì)胞培養(yǎng)上清

-唾液或尿液

2.**處理步驟**：

(1)**血清/血漿制備**：

-靜脈采血，室溫靜置30分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清。

--20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)**組織勻漿**：

-組織用PBS清洗，剪成小塊，加入勻漿緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上勻漿。

-12000rpm離心15分鐘，取上清。

(3)**細(xì)胞培養(yǎng)上清**：

-收集24-48小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液，4000rpm離心5分鐘，取上清。

###三、實(shí)驗(yàn)操作流程

####（一）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）

1.**包被**：

(1)將抗體（如捕獲抗體）用包被液稀釋至0.1-1.0μg/mL。

(2)100μL/孔加入ELISA板，4℃過夜包被。

(3)用PBST（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5分鐘。

2.**封閉**：

(1)加入封閉液（如5%BSA或脫脂奶粉），37℃封閉1-2小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

3.**孵育檢測(cè)抗體**：

(1)加入稀釋后的檢測(cè)抗體（如一抗），37℃孵育1小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

4.**孵育酶標(biāo)抗體**：

(1)加入HRP或AP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1小時(shí)。

(2)PBST洗滌3次。

5.**顯色**：

(1)加入TMB或OPD底物，避光反應(yīng)15-30分鐘（可根據(jù)酶標(biāo)儀信號(hào)調(diào)整）。

(2)加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值（OD450或OD405）。

6.**結(jié)果計(jì)算**：

-計(jì)算樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)品曲線的濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系。

####（二）WesternBlot（蛋白質(zhì)印跡）

1.**樣品制備**：

(1)細(xì)胞或組織裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

(2)樣品加入還原劑（如β-巰基乙醇）和上樣緩沖液，煮沸5分鐘。

2.**SDS電泳**：

(1)配制12-15%SDS凝膠，樣品上樣，100V電泳2-3小時(shí)。

(2)電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜。

3.**封閉與孵育**：

(1)膜用TBST洗滌，5%BSA封閉1小時(shí)。

(2)孵育一抗（1:1000稀釋），4℃過夜。

(3)TBST洗滌3次，孵育HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），37℃1小時(shí)。

4.**化學(xué)發(fā)光檢測(cè)**：

(1)加入ECL底物，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

(2)使用軟件分析條帶灰度值。

####（三）流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）

1.**細(xì)胞制備**：

(1)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，胰酶消化，PBS重懸。

(2)1000rpm離心5分鐘，棄上清。

2.**染色**：

(1)加入固定液，4℃固定30分鐘。

(2)PBS洗滌，加入破膜劑，室溫孵育15分鐘。

(3)孵育熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE，CD4-FITC），4℃避光30分鐘。

3.**上機(jī)檢測(cè)**：

(1)PBS洗滌，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

(2)設(shè)定門控區(qū)域，分析細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞功能。

###四、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

1.**數(shù)據(jù)分析軟件**：

-ELISA：GraphPadPrism或Excel擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

-WesternBlot：ImageJ或QuantityOne分析條帶灰度。

-流式細(xì)胞術(shù)：FlowJo或FCSExpress進(jìn)行細(xì)胞分群分析。

2.**結(jié)果解讀**：

-結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，分析抗體結(jié)合強(qiáng)度、蛋白表達(dá)水平或細(xì)胞亞群變化。

-注意對(duì)照組設(shè)置（如陰性對(duì)照、空白對(duì)照）以排除干擾。

###五、注意事項(xiàng)

1.**無菌操作**：所有實(shí)驗(yàn)需在潔凈臺(tái)進(jìn)行，避免污染。

2.**酶標(biāo)儀校準(zhǔn)**：定期校準(zhǔn)吸光度檢測(cè)，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

3.**抗體存儲(chǔ)**：抗體需-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

4.**安全防護(hù)**：操作時(shí)佩戴手套和護(hù)目鏡，避免試劑接觸皮膚。

###四、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析（續(xù)）

####（一）ELISA數(shù)據(jù)分析詳解

1.**標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制**：

(1)使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的OD值，在Excel或GraphPadPrism中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)選擇合適的回歸模型（如4-PL或線性回歸），確保R2值大于0.95。

(3)根據(jù)樣品OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)濃度。

2.**結(jié)果校正**：

(1)若存在背景吸光度，需從樣品OD值中扣除背景值。

(2)對(duì)于高濃度樣品，考慮進(jìn)行系列稀釋后重新測(cè)定。

3.**統(tǒng)計(jì)分析**：

(1)使用ANOVA或t檢驗(yàn)比較不同組間差異，p<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

(2)可計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）或標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示數(shù)據(jù)離散度。

####（二）WesternBlot數(shù)據(jù)分析詳解

1.**條帶識(shí)別與校準(zhǔn)**：

(1)在凝膠底部加入蛋白Marker，確定目標(biāo)蛋白大小。

(2)使用成像軟件自動(dòng)或手動(dòng)校準(zhǔn)條帶位置，確保灰度值準(zhǔn)確。

2.**定量方法**：

(1)避免目標(biāo)條帶飽和，適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間。

(2)使用ImageJ的“AnalyzeTools”測(cè)量條帶積分光密度（IOD）。

3.**內(nèi)參校正**：

(1)選擇Housekeeping蛋白（如β-actin或GAPDH）作為內(nèi)參。

(2)目標(biāo)蛋白表達(dá)量=目標(biāo)條帶IOD/內(nèi)參條帶IOD×100%。

####（三）流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析詳解

1.**門控策略**：

(1)先設(shè)陰性對(duì)照門（如未染色細(xì)胞），排除背景熒光。

(2)根據(jù)FSC/SSC散點(diǎn)圖篩選活細(xì)胞，排除死細(xì)胞（如PI染色）。

(3)在目標(biāo)熒光通道上設(shè)門，分析特定細(xì)胞亞群。

2.**定量指標(biāo)**：

(1)**頻率**：亞群細(xì)胞占總活細(xì)胞的百分比。

(2)**平均熒光強(qiáng)度（MFI）**：反映細(xì)胞表面分子表達(dá)水平。

(3)**絕對(duì)計(jì)數(shù)**：結(jié)合細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算亞群絕對(duì)數(shù)量（需已知細(xì)胞濃度）。

3.**可視化工具**：

(1)使用FCSExpress繪制二維散點(diǎn)圖（如CD4vsCD8），直觀展示亞群分布。

(2)可進(jìn)行歸一化處理（如相對(duì)于對(duì)照組），增強(qiáng)可比性。

###五、注意事項(xiàng)（續(xù)）

####（一）試劑與耗材細(xì)節(jié)

1.**ELISA關(guān)鍵試劑**：

-包被抗體濃度：通常0.1-1.0μg/mL，需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

-酶標(biāo)抗體稀釋液：5%-20%BSA封閉液常用于稀釋二抗。

-底物反應(yīng)條件：TMB需避光，OPD需室溫，終止后需快速混勻。

2.**WesternBlot耗材**：

-轉(zhuǎn)膜參數(shù)：PVDF膜需甲醇預(yù)浸10分鐘，轉(zhuǎn)膜條件100V/1小時(shí)。

-抗體稀釋液：5%脫脂奶粉或封閉液常用于一抗和二抗稀釋。

3.**流式細(xì)胞耗材**：

-染色濃度：CD標(biāo)記抗體常用濃度1-10μg/mL，需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

-固定液選擇：多聚甲醛適用于長(zhǎng)期存儲(chǔ)，甲醇適用于快速固定。

####（二）常見問題排查

1.**ELISA問題**：

-**背景高**：檢查包被液是否污染、洗滌是否充分。

-**信號(hào)弱**：確認(rèn)抗體效價(jià)，可嘗試提高抗體濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

2.**WesternBlot問題**：

-**條帶模糊**：SDS濃度不均或電泳電壓不穩(wěn)，需重新制備凝膠。

-**蛋白缺失**：樣品裂解不充分，可嘗試超聲破碎或增加裂解時(shí)間。

3.**流式細(xì)胞問題**：

-**熒光淬滅**：避免抗體長(zhǎng)時(shí)間暴露于強(qiáng)光，及時(shí)避光保存。

-**細(xì)胞聚集**：洗滌不充分導(dǎo)致細(xì)胞粘連，可增加PBS洗滌次數(shù)。

####（三）實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議

1.**ELISA優(yōu)化**：

-嘗試不同抗體濃度梯度（如0.1,0.5,1,