免疫學(xué)操作規(guī)程總結(jié)###一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)過程中，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)涵蓋免疫學(xué)常用技術(shù)的基本操作步驟、關(guān)鍵注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制要點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室工作人員的日常操作參考。

###二、免疫學(xué)基本操作規(guī)程

####（一）抗體制備與純化

1.**抗體制備**

(1)**多克隆抗體制備**

-**免疫原制備**：根據(jù)目標(biāo)抗原設(shè)計(jì)合成肽段或表達(dá)重組蛋白，純化后用于免疫動物。

-**動物免疫**：選擇合適的小鼠或兔子，分階段進(jìn)行免疫（如首免、加強(qiáng)免疫），采集血清檢測效價。

-**血清純化**：采用蛋白A/G親和層析柱純化抗體，檢測純度（如SDS、WesternBlot）。

(2)**單克隆抗體制備**

-**雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建**：融合B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，篩選陽性克?。ㄈ鏗AT培養(yǎng)基篩選）。

-**腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清采集**：純化抗體（如蛋白A柱純化），檢測特異性（ELISA、WesternBlot）。

2.**抗體純化**

-**層析技術(shù)**：常用離子交換層析、凝膠過濾層析或親和層析純化抗體。

-**質(zhì)量檢測**：純度（>95%）、活性（特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)）、內(nèi)毒素（<1EU/mL）。

####（二）ELISA檢測技術(shù)

1.**間接ELISA操作**

(1)**包被**：用稀釋后的抗原包被酶標(biāo)板，4℃過夜。

(2)**封閉**：用封閉液（如5%脫脂奶粉）封閉非特異性位點(diǎn)，37℃1小時。

(3)**加樣**：加入稀釋后的二抗（或生物素化抗體），37℃1小時。

(4)**顯色**：加入TMB底物，避光反應(yīng)30分鐘，酶標(biāo)儀檢測OD值（450nm）。

2.**注意事項(xiàng)**

-抗體稀釋比例需優(yōu)化（如1:1000~1:5000）。

-避免交叉反應(yīng)，可使用交叉反應(yīng)性測試抗體驗(yàn)證。

####（三）WesternBlotting技術(shù)

1.**操作步驟**

(1)**蛋白提取與變性**：細(xì)胞裂解液提取蛋白，加入β-巰基乙醇，100℃變性5分鐘。

(2)**SDS電泳**：上樣20-50μg蛋白，120V電泳2-3小時。

(3)**轉(zhuǎn)膜**：電轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜，甲醇預(yù)濕潤10分鐘。

(4)**封閉**：5%脫脂奶粉封閉1小時，TBS-T洗膜3次。

(5)**孵育一抗**：1:1000稀釋抗體，4℃過夜，TBS-T洗膜3次。

(6)**孵育二抗**：1:5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃1小時，TBS-T洗膜3次。

(7)**化學(xué)發(fā)光**：加入ECL底物，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測（曝光時間5-10分鐘）。

2.**關(guān)鍵控制點(diǎn)**

-電泳時電壓和時間需標(biāo)準(zhǔn)化，避免條帶彌散。

-轉(zhuǎn)膜后用PVDF膜封閉前需甲醇激活（30秒）。

####（四）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.**細(xì)胞制備**

(1)**細(xì)胞收集**：用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集。

(2)**固定與permeabilization**：用固定液（如4%多聚甲醛）固定，PBS洗后用透化劑（如0.1%TritonX-100）處理。

2.**染色步驟**

(1)**表面染色**：冰上孵育熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE），避光30分鐘。

(2)**胞內(nèi)染色**：用破膜劑裂解細(xì)胞，加入胞內(nèi)抗體（如磷酸化信號通路抗體），避光30分鐘。

3.**上機(jī)檢測**

-設(shè)定門控區(qū)域，檢測細(xì)胞數(shù)量（如10000個細(xì)胞）及熒光強(qiáng)度。

-使用標(biāo)準(zhǔn)品（如同型對照抗體）校正熒光偏差。

###三、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)安全與質(zhì)量控制

1.**安全操作**

-操作生物試劑需佩戴手套、護(hù)目鏡，并在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

-化學(xué)試劑（如過氧化物酶）需避光保存，避免接觸皮膚。

2.**質(zhì)量控制**

-每個實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對照（如未包被板孔）、陽性對照（已知陽性樣本）。

-定期校準(zhǔn)儀器（如酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀），確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

3.**數(shù)據(jù)記錄**

-實(shí)驗(yàn)參數(shù)（如抗體濃度、孵育時間）需詳細(xì)記錄，確保可重復(fù)性。

###四、總結(jié)

免疫學(xué)操作規(guī)程的規(guī)范化執(zhí)行是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)。本總結(jié)涵蓋了抗體制備、ELISA、WesternBlot及流式細(xì)胞術(shù)的核心步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)化操作可減少誤差，提升實(shí)驗(yàn)效率。實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)嚴(yán)格遵循規(guī)程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

###二、免疫學(xué)基本操作規(guī)程（續(xù)）

####（一）抗體制備與純化（續(xù)）

1.**抗體制備**

(1)**多克隆抗體制備**

-**免疫原制備**

-**抗原設(shè)計(jì)**：根據(jù)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，選擇包含主要表位的合成肽段（如15-20個氨基酸，重疊度30%）。或表達(dá)重組蛋白，通過Ni-NTA親和層析純化。

-**佐劑選擇**：常用福氏不完全佐劑（首次免疫）或完全佐劑（加強(qiáng)免疫），體積按體重計(jì)算（如每只小鼠100-200μg抗原）。

-**免疫程序**：首免（皮下注射），間隔2-4周加強(qiáng)免疫（足掌或腋下），最后一次免疫后7-10天采血。

(2)**抗體純化**

-**蛋白A/G磁珠純化**：將血清與磁珠結(jié)合，用含0.05M甘氨酸、0.5M氯化鈉的緩沖液洗滌3次，最后用Tris-HCl（pH7.5）洗脫。

-**抗體濃縮與透析**：使用AmiconUltra-15超濾杯濃縮抗體至1mg/mL，用PBS或緩沖液（pH7.4）透析24小時，更換緩沖液2-3次。

(2)**單克隆抗體制備**

-**雜交瘤細(xì)胞篩選**

-**間接ELISA篩選**：用純化抗原包被板，待測雜交瘤上清為第一抗體，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為第二抗體，TMB顯色后計(jì)算OD值，篩選陽性孔。

-**克隆化**：陽性細(xì)胞通過有限稀釋法或顯微操作儀進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后驗(yàn)證特異性。

-**腹水制備與純化**

-**注射IL-6**：向小鼠（如Balb/c）腹腔注射重組人IL-6（50-100ng/只）促進(jìn)腹水生成。

-**腹水采集與純化**：抽取腹水，使用同樣方法（蛋白A/G磁珠）純化抗體。

2.**抗體純化（續(xù)）**

-**高級純化技術(shù)**

-**親和純化優(yōu)化**：通過梯度洗脫（如0.1-1M甘氨酸-鹽酸）分離雜蛋白，收集抗體峰。

-**糖基化抗體純化**：采用疏水相互作用層析（HIC，如SephacelHeavyluty）分離含糖抗體，檢測N端測序確認(rèn)結(jié)構(gòu)完整性。

-**質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)**

-**純度分析**：SDS（應(yīng)單一主帶，分子量與理論值一致），SizeExclusionChromatography（SEC，檢測聚集體）。

-**活性驗(yàn)證**：WesternBlot（檢測靶蛋白特異性結(jié)合），ELISA（計(jì)算效價，如1:20000）。

####（二）ELISA檢測技術(shù)（續(xù)）

1.**間接ELISA操作（續(xù)）**

-**競爭性ELISA**：用于低豐度樣本檢測，需添加已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣本競爭結(jié)合有限量的標(biāo)記抗原。

-**雙抗體夾心ELISA**：需同時驗(yàn)證一抗和二抗的特異性，包被抗體和檢測抗體不能交叉反應(yīng)（如用針對不同物種的抗體組合）。

2.**注意事項(xiàng)（續(xù)）**

-**阻斷劑優(yōu)化**：封閉液濃度（2-10%）、種類（BSA、脫脂奶粉、封閉抗體）需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

-**pH控制**：包被液和洗滌液pH值（通常7.4-7.6）影響抗體結(jié)合，需用pH計(jì)校準(zhǔn)。

####（三）WesternBlotting技術(shù)（續(xù)）

1.**操作步驟（續(xù)）**

-**轉(zhuǎn)膜優(yōu)化**：PVDF膜需甲醇激活（60秒），NC膜需電擊活化（1mA/cm2，10分鐘）。

-**抗體濃度與孵育**：一抗（1:1000~1:5000）4℃過夜，二抗（1:5000~1:10000）37℃1小時，避免過高濃度導(dǎo)致非特異性。

-**化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)**：用增強(qiáng)液（如ECLMax）可延長曝光時間（30-60分鐘），但需注意背景過亮可能影響信號。

2.**關(guān)鍵控制點(diǎn)（續(xù)）**

-**加載量標(biāo)準(zhǔn)化**：使用蛋白濃度梯度（如10-100μg）檢測，確保條帶清晰且無飽和。

-**內(nèi)參選擇**：常用β-actin、GAPDH，需驗(yàn)證其在不同處理下的穩(wěn)定性（通過geNorm或NormFinder）。

####（四）流式細(xì)胞術(shù)操作（續(xù)）

1.**細(xì)胞制備（續(xù)）**

-**機(jī)械破碎**：對于組織樣本，用酶消化（膠原酶、DNase）后，通過細(xì)胞篩網(wǎng)（40μm）過濾，避免細(xì)胞團(tuán)塊堵塞。

-**死細(xì)胞排除**：用PI（propidiumiodide）或7-AAD染料，設(shè)門去除熒光陽性細(xì)胞。

2.**染色步驟（續(xù)）**

-**多色染色**：抗體濃度梯度優(yōu)化（如CD3-FITC1:100，CD4-PE1:200），避免過高濃度導(dǎo)致熒光飽和。

-**阻斷Fc受體**：加入小鼠血清（1:10稀釋）或Fc阻斷劑（如Anti-CD16/32），孵育10分鐘，減少非特異性結(jié)合。

###三、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)安全與質(zhì)量控制（續(xù)）

1.**安全操作（續(xù)）**

-**生物安全**：高致病性病毒實(shí)驗(yàn)需在BSL-2級以上實(shí)驗(yàn)室操作，穿戴二級防護(hù)（手套、面屏、隔離衣）。

-**廢液處理**：含氯金溶液（WesternBlot）需用酸中和后滅菌，熒光染料（如DCFH-DA）需用有機(jī)溶劑萃取處理。

2.**質(zhì)量控制（續(xù)）**

-**陽性對照設(shè)計(jì)**：使用已驗(yàn)證的抗體和樣本，確保實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)正常工作。

-**重復(fù)性驗(yàn)證**：每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)（CV）評估穩(wěn)定性（理想值<10%）。

3.**數(shù)據(jù)記錄（續(xù)）**

-**電子版記錄**：使用Excel或Labnotebook記錄抗體批號、稀釋比例、孵育條件等，附帶原始圖片（如WesternBlot曝光曲線）。

###四、總結(jié)（續(xù)）

免疫學(xué)操作規(guī)程的精細(xì)化執(zhí)行依賴于對每個步驟的嚴(yán)格把控。本總結(jié)補(bǔ)充了高級純化技術(shù)、競爭性ELISA、多色流式細(xì)胞術(shù)等擴(kuò)展應(yīng)用，并強(qiáng)調(diào)了安全與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立操作手冊，定期培訓(xùn)人員，結(jié)合自動化設(shè)備（如移液機(jī)器人）進(jìn)一步減少人為誤差，以適應(yīng)高通量實(shí)驗(yàn)需求。

###一、免疫學(xué)操作規(guī)程概述

免疫學(xué)操作規(guī)程是指在免疫學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)過程中，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性及操作人員的安全而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化流程。本總結(jié)涵蓋免疫學(xué)常用技術(shù)的基本操作步驟、關(guān)鍵注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制要點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室工作人員的日常操作參考。

###二、免疫學(xué)基本操作規(guī)程

####（一）抗體制備與純化

1.**抗體制備**

(1)**多克隆抗體制備**

-**免疫原制備**：根據(jù)目標(biāo)抗原設(shè)計(jì)合成肽段或表達(dá)重組蛋白，純化后用于免疫動物。

-**動物免疫**：選擇合適的小鼠或兔子，分階段進(jìn)行免疫（如首免、加強(qiáng)免疫），采集血清檢測效價。

-**血清純化**：采用蛋白A/G親和層析柱純化抗體，檢測純度（如SDS、WesternBlot）。

(2)**單克隆抗體制備**

-**雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建**：融合B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，篩選陽性克?。ㄈ鏗AT培養(yǎng)基篩選）。

-**腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清采集**：純化抗體（如蛋白A柱純化），檢測特異性（ELISA、WesternBlot）。

2.**抗體純化**

-**層析技術(shù)**：常用離子交換層析、凝膠過濾層析或親和層析純化抗體。

-**質(zhì)量檢測**：純度（>95%）、活性（特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)）、內(nèi)毒素（<1EU/mL）。

####（二）ELISA檢測技術(shù)

1.**間接ELISA操作**

(1)**包被**：用稀釋后的抗原包被酶標(biāo)板，4℃過夜。

(2)**封閉**：用封閉液（如5%脫脂奶粉）封閉非特異性位點(diǎn)，37℃1小時。

(3)**加樣**：加入稀釋后的二抗（或生物素化抗體），37℃1小時。

(4)**顯色**：加入TMB底物，避光反應(yīng)30分鐘，酶標(biāo)儀檢測OD值（450nm）。

2.**注意事項(xiàng)**

-抗體稀釋比例需優(yōu)化（如1:1000~1:5000）。

-避免交叉反應(yīng)，可使用交叉反應(yīng)性測試抗體驗(yàn)證。

####（三）WesternBlotting技術(shù)

1.**操作步驟**

(1)**蛋白提取與變性**：細(xì)胞裂解液提取蛋白，加入β-巰基乙醇，100℃變性5分鐘。

(2)**SDS電泳**：上樣20-50μg蛋白，120V電泳2-3小時。

(3)**轉(zhuǎn)膜**：電轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜，甲醇預(yù)濕潤10分鐘。

(4)**封閉**：5%脫脂奶粉封閉1小時，TBS-T洗膜3次。

(5)**孵育一抗**：1:1000稀釋抗體，4℃過夜，TBS-T洗膜3次。

(6)**孵育二抗**：1:5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃1小時，TBS-T洗膜3次。

(7)**化學(xué)發(fā)光**：加入ECL底物，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測（曝光時間5-10分鐘）。

2.**關(guān)鍵控制點(diǎn)**

-電泳時電壓和時間需標(biāo)準(zhǔn)化，避免條帶彌散。

-轉(zhuǎn)膜后用PVDF膜封閉前需甲醇激活（30秒）。

####（四）流式細(xì)胞術(shù)操作

1.**細(xì)胞制備**

(1)**細(xì)胞收集**：用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，離心收集。

(2)**固定與permeabilization**：用固定液（如4%多聚甲醛）固定，PBS洗后用透化劑（如0.1%TritonX-100）處理。

2.**染色步驟**

(1)**表面染色**：冰上孵育熒光標(biāo)記抗體（如CD3-PE），避光30分鐘。

(2)**胞內(nèi)染色**：用破膜劑裂解細(xì)胞，加入胞內(nèi)抗體（如磷酸化信號通路抗體），避光30分鐘。

3.**上機(jī)檢測**

-設(shè)定門控區(qū)域，檢測細(xì)胞數(shù)量（如10000個細(xì)胞）及熒光強(qiáng)度。

-使用標(biāo)準(zhǔn)品（如同型對照抗體）校正熒光偏差。

###三、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)安全與質(zhì)量控制

1.**安全操作**

-操作生物試劑需佩戴手套、護(hù)目鏡，并在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

-化學(xué)試劑（如過氧化物酶）需避光保存，避免接觸皮膚。

2.**質(zhì)量控制**

-每個實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對照（如未包被板孔）、陽性對照（已知陽性樣本）。

-定期校準(zhǔn)儀器（如酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀），確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

3.**數(shù)據(jù)記錄**

-實(shí)驗(yàn)參數(shù)（如抗體濃度、孵育時間）需詳細(xì)記錄，確?？芍貜?fù)性。

###四、總結(jié)

免疫學(xué)操作規(guī)程的規(guī)范化執(zhí)行是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)。本總結(jié)涵蓋了抗體制備、ELISA、WesternBlot及流式細(xì)胞術(shù)的核心步驟，通過標(biāo)準(zhǔn)化操作可減少誤差，提升實(shí)驗(yàn)效率。實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)嚴(yán)格遵循規(guī)程，并持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

###二、免疫學(xué)基本操作規(guī)程（續(xù)）

####（一）抗體制備與純化（續(xù)）

1.**抗體制備**

(1)**多克隆抗體制備**

-**免疫原制備**

-**抗原設(shè)計(jì)**：根據(jù)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，選擇包含主要表位的合成肽段（如15-20個氨基酸，重疊度30%）?；虮磉_(dá)重組蛋白，通過Ni-NTA親和層析純化。

-**佐劑選擇**：常用福氏不完全佐劑（首次免疫）或完全佐劑（加強(qiáng)免疫），體積按體重計(jì)算（如每只小鼠100-200μg抗原）。

-**免疫程序**：首免（皮下注射），間隔2-4周加強(qiáng)免疫（足掌或腋下），最后一次免疫后7-10天采血。

(2)**抗體純化**

-**蛋白A/G磁珠純化**：將血清與磁珠結(jié)合，用含0.05M甘氨酸、0.5M氯化鈉的緩沖液洗滌3次，最后用Tris-HCl（pH7.5）洗脫。

-**抗體濃縮與透析**：使用AmiconUltra-15超濾杯濃縮抗體至1mg/mL，用PBS或緩沖液（pH7.4）透析24小時，更換緩沖液2-3次。

(2)**單克隆抗體制備**

-**雜交瘤細(xì)胞篩選**

-**間接ELISA篩選**：用純化抗原包被板，待測雜交瘤上清為第一抗體，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為第二抗體，TMB顯色后計(jì)算OD值，篩選陽性孔。

-**克隆化**：陽性細(xì)胞通過有限稀釋法或顯微操作儀進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后驗(yàn)證特異性。

-**腹水制備與純化**

-**注射IL-6**：向小鼠（如Balb/c）腹腔注射重組人IL-6（50-100ng/只）促進(jìn)腹水生成。

-**腹水采集與純化**：抽取腹水，使用同樣方法（蛋白A/G磁珠）純化抗體。

2.**抗體純化（續(xù)）**

-**高級純化技術(shù)**

-**親和純化優(yōu)化**：通過梯度洗脫（如0.1-1M甘氨酸-鹽酸）分離雜蛋白，收集抗體峰。

-**糖基化抗體純化**：采用疏水相互作用層析（HIC，如SephacelHeavyluty）分離含糖抗體，檢測N端測序確認(rèn)結(jié)構(gòu)完整性。

-**質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)**

-**純度分析**：SDS（應(yīng)單一主帶，分子量與理論值一致），SizeExclusionChromatography（SEC，檢測聚集體）。

-**活性驗(yàn)證**：WesternBlot（檢測靶蛋白特異性結(jié)合），ELISA（計(jì)算效價，如1:20000）。

####（二）ELISA檢測技術(shù)（續(xù)）

1.**間接ELISA操作（續(xù)）**

-**競爭性ELISA**：用于低豐度樣本檢測，需添加已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品和樣本競爭結(jié)合有限量的標(biāo)記抗原。

-**雙抗體夾心ELISA**：需同時驗(yàn)證一抗和二抗的特異性，包被抗體和檢測抗體不能交叉反應(yīng)（如用針對不同物種的抗體組合）。

2.**注意事項(xiàng)（續(xù)）**

-**阻斷劑優(yōu)化**：封閉液濃度（2-10%）、種類（BSA、脫脂奶粉、封閉抗體）需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

-**pH控制**：包被液和洗滌液pH值（通常7.4-7.6）影響抗體結(jié)合，需用pH計(jì)校準(zhǔn)。

####（三）WesternBlotting技術(shù)（續(xù)）

1.**操作步驟（續(xù)）**

-**轉(zhuǎn)膜優(yōu)化**：PVDF膜需甲醇激活（60秒），NC膜需電擊活化（1mA/cm2，10分鐘）。

-**抗體濃度與孵育**：一抗（1:1000~1:5000）4℃過夜，二抗（1:5000~1:10000）37℃1小時，避免過高濃度導(dǎo)致非特異性。

-**化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)**：用增強(qiáng)液（如ECLMax）可延長曝光時間（30-60分鐘），但需注意背景過亮可能影響信號。

2.**關(guān)鍵控制點(diǎn)（續(xù)）**

-**加載量標(biāo)準(zhǔn)化**：使用蛋白濃度梯度（如10-100μg）檢測，確保條帶清晰且無飽和。